核桃多肽體外抗氧化活性研究

賈靖霖，陸健康，汪莉莉，王小茹，侯旭杰*

（塔里木大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 南疆特色農(nóng)產(chǎn)品深加工兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

核桃（Julans ragia.）是一種兼具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的珍貴果木，同時(shí)也是世界上一種非常重要的堅(jiān)果類果樹(shù)和木本油料樹(shù)種[1]。當(dāng)前，核桃種植面積全球共有228.36萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量為256.87萬(wàn)t。據(jù)《中國(guó)果樹(shù)志》核桃卷記載[2]，中國(guó)種植的核桃面積為66.7萬(wàn)hm2，品種（系）有216個(gè)，有2億多株是實(shí)生果樹(shù)，實(shí)生農(nóng)家品種164個(gè)，優(yōu)良單株系486個(gè)，年產(chǎn)量164.91萬(wàn)t，位居世界首位。

新疆盛產(chǎn)核桃，2011年核桃種植總面積（不含兵團(tuán)）達(dá)28.02萬(wàn)hm2，產(chǎn)量達(dá)23.42萬(wàn)t，占全國(guó)總產(chǎn)量的17.8%，主要分布在阿克蘇地區(qū)、喀什地區(qū)、和田地區(qū)，是名符其實(shí)的核桃主產(chǎn)區(qū)[3]。隨著“國(guó)家木本油料產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略”的實(shí)施、核桃良種化進(jìn)程的加快、標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)技術(shù)的推廣應(yīng)用、技術(shù)管理和物化投入水平的提高，預(yù)計(jì)到2015年全疆核桃產(chǎn)量將達(dá)到40萬(wàn)t以上[4]。南疆核桃資源豐富、品質(zhì)優(yōu)良，主要品種有新豐、扎-343、溫-179、新2號(hào)、溫-185等。其中溫-185核桃于1989年通過(guò)林業(yè)部門(mén)鑒定[5]，具有豐產(chǎn)、早熟、抗逆性強(qiáng)、殼薄等特性。隨著南疆核桃產(chǎn)業(yè)的迅速發(fā)展，溫-185核桃在南疆核桃產(chǎn)業(yè)中的地位將會(huì)越來(lái)越重要。

目前對(duì)溫-185核桃的研究主要集中在溫185-核桃的豐產(chǎn)栽培技術(shù)[6]、核桃殼斷口形貌的研究[7]、不同方法制備核桃油的研究[8]等，有關(guān)溫-185核桃多肽的研究較少。本研究將以前期試驗(yàn)制備的核桃多肽為原料，探討不同水解度的核桃多肽液的體外抗氧化活性，以期為今后溫-185核桃綜合利用及開(kāi)發(fā)成各種營(yíng)養(yǎng)保健食品提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

核桃薄皮溫-185：新疆阿拉爾市禾普商貿(mào)城；維生素C、維生素E、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、焦性沒(méi)食子酸、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇、鄰菲羅啉、硫酸亞鐵、30%雙氧水：上海山浦化工有限公司；磷酸二氫鈉：天津福晨化學(xué)試劑廠；磷酸氫二鈉：天津博迪化工股份有限公司；濃鹽酸：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；Tris、二苯代苦味酰自由基：美國(guó)Sigma公司；堿性蛋白酶（1×105U/g）、中性蛋白酶（1.3×105U/g）、酸性蛋白酶（5×104U/mg）：上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

AR2140電子天平：奧豪斯國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；88-1磁力攪拌器：常州國(guó)華電器有限公司；211C酸度計(jì)：北京哈納科儀科技有限公司；FD-10-80冷凍干燥機(jī)：北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；GL-20G-Ⅱ冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；HHS電熱恒溫水浴鍋：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；JH756紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 核桃多肽的制備[9]

核桃蛋白的制備采用傳統(tǒng)的堿溶酸沉法[2，10]，制備工藝流程如下：

核桃→核桃仁→榨油→核桃粕→體積分?jǐn)?shù)95%乙醇洗滌→過(guò)濾→濾餅揮干溶劑→定容→調(diào)pH值為9.0→磁力攪拌1h（40℃）→離心（5 000r/min、15min、25℃）→取上清液→調(diào)pH值為4.5→磁力攪拌1 h（40℃）→離心（5 000r/min、15min、25℃）→取沉淀→40℃水洗至中性→冷凍干燥→核桃蛋白粉

多酶協(xié)同水解核桃蛋白采用分步依次加酶，不同酶解時(shí)間制備出2種不同水解度（degree of hydrolysis，DH）的多肽液，其酶解工藝流程如下：

最優(yōu)條件制得核桃多肽液：稱取核桃蛋白粉→定容→調(diào)pH值為9.5→加堿性蛋白酶→水浴酶解（5h、50℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調(diào)pH值為8.0→加中性蛋白酶→水浴酶解（6h、40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調(diào)pH值為3.0→加酸性蛋白酶→水浴酶解（4h，40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→冷卻→冷凍離心→取上清液→測(cè)定水解度[4]。

最優(yōu)條件下酶解時(shí)間減半制得多肽液：稱取核桃蛋白粉→定容→調(diào)pH值為9.5→加堿性蛋白酶→水浴酶解（2.5h、50℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調(diào)pH值為8.0→加中性蛋白酶→水浴酶解（3h、40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→調(diào)pH值為3.0→加酸性蛋白酶→水浴酶解（2h、40℃）→取出沸水浴10min滅酶活→冷卻→冷凍離心→取上清液→測(cè)定水解度[4]。

1.3.2 水解度測(cè)定[10]

核桃多肽液中氨基酸態(tài)氮采用甲醛滴定法測(cè)定，總氮按照國(guó)標(biāo)GB/T5009.5—2003《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法進(jìn)行測(cè)定，水解度（DH）按下式計(jì)算：

1.3.3 核桃多肽總還原能力的測(cè)定[11]

核桃多肽總還原能力的測(cè)定采用普魯士蘭法。在2.5mL磷酸緩沖溶液（pH 6.6）中分別加入樣品、維生素C、維生素E，添加量均為0、0.05mL、0.10mL、0.15mL、0.20mL、0.25mL、0.30mL，雙蒸水1.0mL、0.95mL、0.90mL、0.85mL、0.80mL、0.75mL、0.70mL，再加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%鐵氰化鉀1mL，混合物在50℃恒溫條件下，加熱20min后，急速冷卻，加2.5mL 10%三氯乙酸，3 500r/min離心分離10min。取上層清液2.5mL、雙蒸水2.5mL，再加0.5mL 0.1%FeCl3，混合均勻，靜置10min后在波長(zhǎng)700nm條件下測(cè)吸光度值A(chǔ)700nm。A700nm越大，則樣品的總還原力越大，抗氧化性就越好。

1.3.4 核桃多肽清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力測(cè)定[12]

采用鄰苯三酚自氧化法。取pH值為8.2的Tris-HCl緩沖液6mL，加入0.02g/10mL、0.04g/10mL、0.06g/10mL、0.08g/10mL、0.10g/10mL、0.12g/10mL、0.14g/10mL的樣品各0.5mL，37℃水浴10min，最后加入37℃預(yù)熱過(guò)的7mmol/L鄰苯三酚鹽酸溶液1mL，混勻后反應(yīng)4min，用0.5mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在波長(zhǎng)325nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)325nm，以等體積pH值為8.2的Tris-HCl 緩沖液作為空白吸光度值A(chǔ)0，超氧陰離子自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A0為空白吸光度值；A為樣品的吸光度值。

1.3.5 核桃多肽清除羥自由基（·OH）能力測(cè)定[13]

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法。吸取15mmol/L的鄰二氮菲應(yīng)用液1.5mL，先加入pH值為7.4的磷酸鈉緩沖液4mL，充分混勻后再加入7.5mmol/L的FeSO4溶液1mL，立刻混勻。加入1mL質(zhì)量濃度分別為0.02g/10mL、0.04g/10mL、0.06g/10mL、0.08g/10mL、0.10g/10mL、0.12g/10mL、0.14g/10mL的樣品溶液后立即混勻，再加入1.5mL雙蒸水，最后加入1%的H2O2溶液1.0mL，以雙蒸水代替H2O2溶液，在波長(zhǎng)536nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)536nm，羥自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：A加藥為加入樣品（抗氧化劑）及H2O2溶液的吸光度值；A損傷為加H2O2而不加抗氧化劑溶液的吸光度值；A未損為兩者都不加的溶液的吸光度值。

1.3.6 核桃多肽清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）能力測(cè)定[14-15]

在10mL比色管中依次加入pH值為6.86磷酸鹽緩沖液4mL，2×10-4mol/L的DPPH溶液（用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇配制）4mL，搖勻。再加入1mL待測(cè)液，用蒸餾水定容至10.00mL刻度，充分混勻，10min后用體積分?jǐn)?shù)95%乙醇作參比，在波長(zhǎng)520nm處測(cè)定其吸光度值，DPPH自由基清除率計(jì)算公式如下：

式中：Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度值；Aj為不加DPPH，只加抗氧化劑及水的溶液的吸光度值；Ac為不加抗氧化劑，只加DPPH及水的溶液的吸光度值。

1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)均采用（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）表示；統(tǒng)計(jì)分析軟件DPS 7.55對(duì)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度的測(cè)定

最優(yōu)條件制得的核桃多肽液水解度為45.58%，最優(yōu)條件下酶解時(shí)間減半制得的核桃多肽液水解度為30.92%。

2.2 核桃多肽總還原能力的測(cè)定

核桃多肽的總還原能力與VC的總還原能力進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 核桃多肽總還原力測(cè)定Fig.1 Determination of total reducing power of different samples

由圖1可知，核桃多肽液水解度為45.58%的總還原能力稍優(yōu)于水解度為30.92%，但2種水解度的酶解液還原效果均弱于VC，且隨著多肽液質(zhì)量濃度的升高，樣品的總還原能力也逐漸升高，后又基本趨于穩(wěn)定，達(dá)到了VC總抗還原能力的60%～80%。說(shuō)明其具有一定的總還原能力，即核桃多肽有一定的抗氧化性。

2.3 核桃多肽清除超氧陰離子自由基（O2-·）能力測(cè)定

圖2 不同水解度下核桃多肽質(zhì)量濃度對(duì)O2-·的清除率Fig.2 Effect of walnut polypeptide concentration on O2-·scavenging activity under different hydrolysis degree

不同水解度下核桃多肽對(duì)O2-·的清除率結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知，核桃多肽液的質(zhì)量濃度與超氧陰離子自由基的清除率呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，隨質(zhì)量濃度增加，超氧陰離子自由基的清除率呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，核桃多肽液水解度為30.92%對(duì)超氧陰離子自由基的清除率稍優(yōu)于水解度為45.58%，但2種水解度的酶解液對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果均弱于VC，表明核桃多肽具有一定的清除超氧陰離子自由基的能力。

2.4 核桃多肽清除羥基自由基（·OH）能力測(cè)定

不同水解度下核桃多肽液對(duì)·OH的清除率結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知，核桃多肽液對(duì)羥基自由基有較明顯的清除作用，且隨著核桃多肽液質(zhì)量濃度的升高，其清除率也逐漸增強(qiáng)，核桃多肽液水解度為45.58%對(duì)羥基自由基的清除率優(yōu)于水解度為30.92%，但2種水解度的核桃多肽液對(duì)羥基自由基的清除能力都低于VC，說(shuō)明其具有一定的抗氧化能力。

圖3 不同水解度下核桃多肽質(zhì)量濃度對(duì)·OH的清除率Fig.3 Effect of walnut polypeptide concentration on·OH scavenging activity under different hydrolysis degree

2.5 核桃多肽清除二苯代苦味酰自由基（DPPH）能力測(cè)定

不同水解度下核桃多肽液對(duì)DPPH的清除率見(jiàn)圖4。由圖4可知，水解度為45.58%及30.92%核桃多肽液對(duì)DPPH自由基都有清除作用，并且二者清除效果差別不大。在較低質(zhì)量濃度時(shí)遠(yuǎn)低于VC的清除率，但隨著其質(zhì)量濃度的升高，DPPH自由基清除率逐漸上升，直到當(dāng)核桃多肽質(zhì)量濃度達(dá)到0.6mg/mL時(shí)清除率逐漸趨于穩(wěn)定，說(shuō)明核桃多肽具有一定的抗氧化性。

圖4 不同水解度下核桃多肽液質(zhì)量濃度對(duì)DPPH的清除率Fig.4 Effect of walnut polypeptide concentration on DPPH scavenging activity under different hydrolysis degree

3 結(jié)論

采用新疆產(chǎn)溫-185核桃，利用榨完油后的殘?jiān)崛〔煌舛群颂业鞍祝⒅苽洳煌舛鹊亩嚯囊?。以VC為對(duì)照，探討了核桃多肽的總還原能力、對(duì)不同自由基的清除能力以及不同質(zhì)量濃度對(duì)自由基清除率的影響。結(jié)果表明，核桃多肽對(duì)超氧陰離子自由基、羥基自由基以及DPPH自由基有一定的清除作用，且呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，說(shuō)明核桃多肽具有一定的抗氧化能力，有作為天然抗氧化劑進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用的價(jià)值。

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