實驗用金黃色葡萄球菌生物被膜體外模型的建立

張全凱，楊公明*，余 銘，杜 冰，呂小麗

（1.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東 廣州 510642；2.陽江職業(yè)技術學院 生命科學與技術系，廣東 陽江 529500）

生物被膜（biofilm，BF）是細菌為適應自然環(huán)境在固態(tài)表面生長時所采取的一種保護性的群體生活方式。細菌生物被膜廣泛存在于自然界中，其中金黃色葡萄球菌是較易形成生物被膜的菌種之一，也是食品加工過程中的重要污染源[1]。金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陽性病原菌。在美國，金黃色葡萄球菌是第二大食源性病原菌，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒數(shù)量占細菌性食物中毒的33%[2]。目前，在食品加工中發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌生物被膜存在[3]。生物被膜是自然條件下細菌為適應環(huán)境而形成的與浮游狀態(tài)細菌相對應的一種保護型生長方式，細菌將細胞不可逆的嵌入一個自我分泌的胞外聚合物基質中，該基質由多糖、蛋白質、核酸和芳香族氨基酸組成。生物被膜菌具有不同于浮游菌生長率和基因表達的表型，導致生物被膜表面化學性質的變化，因此BF菌對各種化學殺菌劑的敏感程度只有浮游菌的1/10～1/1 000，其耐熱性也相應增加，對環(huán)境變化不敏感，感染部位難以徹底清除[4-7]。生物被膜的良好適應性可能導致毒力增強，在食品加工過程中增加了交叉污染的可能性，導致食品污染的風險增加[8-9]。通過優(yōu)化金黃色生物被膜體外模型，探討各種因素對金黃色葡萄球菌生物被膜形成的影響，了解該菌生物被膜形成規(guī)律，為研究金黃色葡萄球菌生物被膜的防治措施提供實驗材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC 6538）：廣東省微生物研究所；胰蛋白胨大豆肉湯（trypticase soy broth，TSB）培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆瓊脂（tryptose soya agar，TSA）培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

氫氧化鈉（分析純）：東莞市東旺化玻儀器有限公司；結晶紫（分析純）：廣州精科化玻儀器公司；瓊脂、胰蛋白胨、大豆蛋白胨：上海中科昆蟲生物技術開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設備

96孔酶標板：上海康寧公司；Bio-Rad 680酶標儀：美國Bio-Rad公司；SB32000超聲儀：上海第三分析儀器廠；PYX-250S-A型生化培養(yǎng)箱：上海悅豐儀器儀表有限公司；SHZ-82A全溫震蕩培養(yǎng)箱（臥式）：常州朗越儀器制造有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種活化與菌懸液制備

將凍干保存的金黃色葡萄球菌接種于TSA培養(yǎng)基上，37℃過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)基上直徑＞1mm的菌落一環(huán)于無菌TSB培養(yǎng)基中，37℃條件下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期。將復蘇24h的菌種接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃條件下培養(yǎng)24h，置于超聲儀上重新使菌團分散均勻，參照麥氏比濁法，用pH值為7.3無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）調整菌懸液細菌密度約為108CFU/mL。

1.3.2 生物被膜形成與測定

接入一定量菌懸液于96孔板中，加入TSB培養(yǎng)基，蓋上蓋子，在37℃條件下恒溫恒濕培養(yǎng)。培養(yǎng)一定時間后棄去96孔板中的培養(yǎng)物，用250μL無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）沖洗3次，去除培養(yǎng)基和浮游狀態(tài)的細菌。在孔中加入甲醇250μL加蓋靜置15min，吸除甲醇后在30℃環(huán)境下自然風干，固定吸附緊密的細菌。在每個孔中加入250μL結晶紫（1%結晶紫溶液），靜置染色20min后棄去染色液，無菌磷酸鹽緩沖液（pH 7.3）沖洗直至無色、晾干。在染色的孔中加入250μL、體積分數(shù)為95%的乙醇脫色，用空白孔以250μL TSB培養(yǎng)基作為空白調零，測定595nm波長處光密度值OD595nm，每孔做3個平行，取其平均值[10-13]。

1.3.3 金黃色葡萄球菌生物被膜活菌量的測定

取出培養(yǎng)一定時間的96孔板，用無菌磷酸緩沖溶液（pH 7.3）漂洗3次，在無菌狀態(tài)下用無菌棉球擦拭培養(yǎng)孔數(shù)次，將棉球轉入裝有10mL PBS溶液的試管中，把試管放入超聲儀中，在50Hz頻率下超聲15min，使棉球上的菌團分散于無菌水中。用無菌磷酸緩沖溶液（pH 7.3）進行梯度稀釋后，在TSA平板上37℃培養(yǎng)24h后計數(shù)，結果以lg（CFU/mL）表示。

1.3.4 金黃色葡萄球菌生物被膜體外模型實驗

（1）金黃色葡萄球菌生物被膜制備單因素實驗

分別選擇細菌接種濃度（105CFU/mL、106CFU/mL、107CFU/mL、108CFU/mL、109CFU/mL、1010CFU/mL）、培養(yǎng)基pH（4、5、6、7、8、9、10）、培養(yǎng)基質量分數(shù)（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%）、培養(yǎng)溫度（20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃），培養(yǎng)時間（12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h）5個因素來研究其對金黃色葡萄球菌成膜的影響，通過結晶紫染色法測定光密度值OD595nm，平行試驗3次。

（2）二次回歸正交旋轉組合設計

綜合考慮單因素實驗結果，確定在細菌接種濃度109CFU/mL、培養(yǎng)基質量分數(shù)6%的條件下，選擇培養(yǎng)溫度（A）、培養(yǎng)時間（B）和培養(yǎng)基pH（C）建立關于生物被膜活菌數(shù)的三元二次回歸模型，并尋求最優(yōu)相應因子水平。二次正交旋轉試驗設計因素水平編碼如表1所示。

1.3.5 金黃色葡萄球菌生物被膜吸光度與活菌數(shù)標準曲線

取兩組不同培養(yǎng)條件培養(yǎng)出的金黃色葡萄球菌生物被膜96孔板，一組用結晶紫染色法測定96孔板的OD值，另一組用實驗方法1.3.3測定金黃色葡萄球菌生物被膜活菌量，建立OD值和活菌量之間的線性關系。

2 結果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌生物被膜制備單因素實驗

2.1.1 細菌接種濃度對金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在培養(yǎng)基pH值為7，培養(yǎng)基質量分數(shù)3%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48h條件下，不同細菌接種濃度對金黃色葡萄球菌生物被膜所測OD值的影響如圖1所示。由圖1可知，隨著細菌接種濃度的增加，生物被膜OD值呈上升趨勢，當細菌接種濃度由105CFU/mL增長到107CFU/mL時，生物被膜OD值顯著增加；當初始菌懸液濃度由107CFU/mL增長到109CFU/mL時，生物被膜OD值緩慢增加；繼續(xù)增加到1010CFU/mL對生物被膜OD值影響不大。當細菌接種濃度為109CFU/mL時，用酶標儀測得的OD值為2.586。說明初始菌懸液濃度增長有利于生物被膜的形成，但增長到一定程度后對生物被膜的生長影響不大。根據(jù)實驗結果以及方便調整菌懸液濃度的原則，確定菌懸液濃度為109CFU/mL。

2.1.2 培養(yǎng)基pH對金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基質量分數(shù)3%，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48h條件下，不同培養(yǎng)基pH值對金黃色葡萄球菌生物被膜所測OD值的影響如圖2所示。由圖2可知，培養(yǎng)基pH值為7，生物被膜的OD值最大，與其他培養(yǎng)基pH下形成的生物被膜的量有極顯著差異（P＜0.01）。說明培養(yǎng)基pH值為7左右最適宜生物被膜的生長。根據(jù)實驗結果確定優(yōu)化的培養(yǎng)基pH值為6～8。

表1 二次正交旋轉試驗設計因素水平編碼Table 1 Factors and levels of quadratic orthogonal rotary experiment

圖1 細菌接種濃度對金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響Fig.1 Effect of suspension concentration on OD value of S.aureus biofilm

圖2 培養(yǎng)基pH對生物被膜OD值的影響Fig.2 Effect of culture medium pH on OD value of S.aureus biofilm

2.1.3 培養(yǎng)基質量分數(shù)對金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基pH值為7，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間48h條件下，不同培養(yǎng)基質量分數(shù)對金黃色葡萄球菌生物被膜所測OD值的影響結果見圖3。由圖3可知，培養(yǎng)基質量分數(shù)由1%增長到5%時生物被膜OD值逐漸變大，培養(yǎng)基質量分數(shù)由5%增長到7%時生物被膜OD值變化不大。培養(yǎng)基質量分數(shù)為6%時培養(yǎng)出的生物被膜所測OD值為3.037。說明培養(yǎng)基質量分數(shù)增長的有利于生物被膜的形成，但增長到一定程度后生物被膜的生長進入穩(wěn)定期。由此確定培養(yǎng)基質量分數(shù)為6%進行三元二次回歸正交旋轉試驗。

圖3 培養(yǎng)基質量分數(shù)對生物被膜OD值的影響Fig.3 Effect of medium concentration on OD value of S.aureus biofilm

2.1.4 培養(yǎng)溫度對金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基pH 值為7，培養(yǎng)基質量分數(shù)6%，培養(yǎng)時間48h條件下，不同培養(yǎng)溫度對金黃色葡萄球菌生物被膜所測OD值的影響結果見圖4。由圖4可知，培養(yǎng)溫度為35～40℃之間，生物被膜所測的OD值最大，而在培養(yǎng)溫度＞40℃或＜35℃時形成的生物被膜受到抑制，且高溫條件對生物被膜生長抑制更為顯著。由此說明培養(yǎng)溫度為35～40℃最適宜生物被膜的生長，溫度過低或者過高生物被膜都將被抑制。因此確定優(yōu)化的培養(yǎng)溫度為35～40℃，進行三元二次回歸正交旋轉試驗。

圖4 培養(yǎng)溫度對生物被膜OD值的影響Fig.4 Effect of culture temperature on OD value of S.aureus biofilm

2.1.5 培養(yǎng)時間對金黃色葡萄球菌生物被膜OD值的影響

在細菌接種濃度109CFU/mL，培養(yǎng)基pH值為7，培養(yǎng)基質量分數(shù)6%，培養(yǎng)溫度37℃條件下，不同培養(yǎng)時間對金黃色葡萄球菌生物被膜所測OD值的影響結果見圖5。由圖5可知，培養(yǎng)時間由12h增長到36h時，生物被膜OD值顯著增加。培養(yǎng)時間36～60h時，生物被膜OD值緩慢增長。培養(yǎng)時間60～84h時，生物被膜OD值與培養(yǎng)時間呈負相關。原因可能是隨著培養(yǎng)時間的延長大量消耗底物，當?shù)孜锕蛔銜r，為適應不利環(huán)境，孔壁的生物被膜態(tài)菌會脫落、死亡或休眠一部分。根據(jù)試驗結果，確定優(yōu)化的培養(yǎng)時間為48～72h進行三元二次回歸正交旋轉試驗。

圖5 培養(yǎng)時間對生物被膜OD值的影響Fig.5 Effect of culture time on OD of S.aureus biofilm

2.2 金黃色葡萄球菌生物被膜制備優(yōu)化

二次正交旋轉試驗方案及結果如表2所示。采用Design Expert 8.0軟件，通過其對其回歸過程進行數(shù)據(jù)分析，尋求最優(yōu)相應因子水平，并建立多元回歸模型。

表2 二次正交旋轉試驗方案及結果Table 2 Design and results of quadratic orthogonal rotating test

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3可知，模型顯著性檢驗P＜0.05，表明該模型具有統(tǒng)計學意義。由圖4知其自變量一次項A、B、C和二次項AB、AC、BC、A2、B2、C2顯著（P＜0.05）。校正決定系數(shù)R2adj（0.987 0＞0.80）和變異系數(shù)（cofficient of variation，CV）為0.54%，說明該模型只有0.54%的變異能由該模型解釋。利用Design-Expert 8.5 軟件對試驗結果進行統(tǒng)計分析，得到OD值與各因素之間的回歸方程如下：

通過對各個變量求偏導，得出各參數(shù)的最優(yōu)值為：A=37.49，B=64.9，C=7.3，此時的理論優(yōu)化值為3.113 8。在此條件下進行驗證試驗，OD值為3.108，與測定值相差0.186%，說明結果真實可靠。

2.3 響應面立體圖及分析

由圖6可知，當培養(yǎng)時間為一定值時，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)溫度的增加呈先上升后下降的趨勢。當培養(yǎng)溫度在較低水平時，培養(yǎng)時間對生物被膜OD值影響不大。當培養(yǎng)溫度為37℃時，培養(yǎng)時間從48～72h，生物被膜OD值先顯著增加，當達到最佳水平后，培養(yǎng)時間繼續(xù)增大時，生物被膜OD值漸漸下降。

圖6 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)時間對OD值影響的響應面圖及等高線Fig.6 Response surface plot and contour line of interaction between culture temperature and culture time on OD value

由圖7可知，當培養(yǎng)基pH為一定值時，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)溫度的增加呈先上升后下降的趨勢。當培養(yǎng)溫度在較低水平時，培養(yǎng)基pH對生物被膜OD值影響不大。當培養(yǎng)溫度為37℃時，培養(yǎng)基pH6.0～8.0，生物被膜OD值先呈顯著增加趨勢，當達到最佳水平后，培養(yǎng)時間繼續(xù)增大時，生物被膜OD值逐漸下降。

圖7 培養(yǎng)溫度及培養(yǎng)基pH對OD值影響的響應面圖及等高線Fig.7 Response surface plot and contour line of interaction between culture temperature and medium pH on OD value

由圖8可知，當培養(yǎng)基pH在較低水平時，培養(yǎng)時間對生物被膜OD值影響不大。當培養(yǎng)基pH在7.0～7.5左右時，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)時間的增加呈先顯著上升，到達最佳水平后緩慢下降的趨勢。當培養(yǎng)時間在66h左右時，生物被膜OD值隨著培養(yǎng)基pH的增加呈先顯著上升，到達最佳水平后緩慢下降的趨勢。

圖8 培養(yǎng)時間及培養(yǎng)基pH對OD值影響的響應面圖及等高線Fig.8 Response surface plot and contour line of interaction between culture time and medium pH on OD value

2.4 金黃色葡萄球菌生物被膜吸光度與活菌數(shù)標準曲線測定

如圖9所示，實驗測定的金黃色葡萄球菌生物被膜OD值（X）與活菌數(shù)（Y）間關系為Y=2.115X+0.0474，R2=0.996 2。結果表明，金黃色葡萄球菌生物被膜OD值（X）與活菌數(shù)（Y）呈線性相關。

圖9 生物被膜OD值與活菌數(shù)標準曲線Fig.9 Standard curve of biofilm OD value and living bacterium number

3 結論

實驗表明，細菌接種濃度與金黃色葡萄球菌生物被膜的生長有關，細菌接種濃度大于107CFU/mL時更容易生成生物被膜。根據(jù)陳強等[14]研究，細菌粘附量與生物被膜的生長呈正比，初細菌接種濃度越高越有利于細菌的粘附；培養(yǎng)基的濃度越高越有利于生物被膜的形成，但培養(yǎng)基濃度達到一定濃度后生物被膜生長趨于穩(wěn)定；培養(yǎng)基pH值在7.3左右時生物被膜最有利于生物被膜的生長，而pH值為7.4也是浮游態(tài)金黃色葡萄球菌的最適生長環(huán)境，這個結論與段韻涵等[15]的研究相符合；金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)36h時既能形成較穩(wěn)定的生物被膜，隨著培養(yǎng)時間的增加生物被膜生長量先升后降，可能是因為隨著培養(yǎng)時間的增加，營養(yǎng)物質被消耗，在不利環(huán)境中，生物被膜態(tài)菌會脫落、死亡一部分；培養(yǎng)溫度在37.5℃時，最利于生物被膜生長。根據(jù)優(yōu)化實驗得出當溫度為37.49℃，培養(yǎng)時間為64.9h，培養(yǎng)基pH值為7.3時生物被膜生長最佳，此時的理論優(yōu)化值為3.113 8。該模型變異系數(shù)（CV）為0.54%，進一步說明模型擬合度較好，可用來對生物被膜生長情況進行初步分析和預測。通過建立金黃色葡萄球菌生物被膜吸光度值與活菌數(shù)標準曲線，改良微孔板法可以定量分析生物被膜的活菌數(shù)，實驗擬合度較高。

[1]孫紀錄，韓小雪，韓北忠.金黃色葡萄球菌生物被膜的控制方法研究進展[J].中國釀造，2011，30（6）：1-3.

[2]丁 嵐，侯曉彥，王小紅，等.張永霞乳糖誘導葡萄球菌腸毒素A 基因在大腸桿菌中的表達[J].食品與生物技術學報，2011，30（2）：255-260.

[3]SHARMA M,ANAND S K.Characterization of constitutive microflora of biofilms in dairy processing lines[J].Food Microbiol,2002,19(9):627-636.

[4]COSTERTON J W.Introduction to biofilm[J].Int J Antimicrob Agents,1999,11(3-4):217-221.

[5]SIBONI N,LIDOR M,KRAMARSKY-WINTER E,et al.Conditioning film and initial biofilm formation on ceramics tiles in the marine environment[J].FEMS Microbiol Lett,2007,274(1):24-29.

[6]DONLAN R M,COSTERTON J W.Biofilms:survival mechanisms of clinically relevant microorganisms[J].Clin Microbiol Rev,2002,15(2):167-193.

[7]LELIéVRE C,LEGEGENTILHOMME P,GAUCHER C,et al.Cleaning in place:effect of local wall shear stress variation on bacterial removal from stainless steel equipment[J].Chem Eng Sci,2002,57 (8):1287-1297.

[8]李燕杰，杜 冰，董吉林，等.食品中細菌生物被膜及其形成機制的研究進展[J].現(xiàn)代食品科技，2009，25（4）：435-438.

[9]WIRTAAEN G,SALO S.Disinfection in food processing efficacy testing of disinfectants[J].Rev Environ Sci Biotechnol,2003,2(2-4):293-306.

[10]錢群英.嗜水氣單胞菌生物被膜形成和估算方法[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學碩士論文，2006.

[11]O'TOOLE G A,KOLTER R.Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development[J].Mol Microbiol,1998,30(2):295-304.

[12]HEILMANN C,GERKE C,PERDREAU-REMINGTON F,et al.Characterization of Tn917 insertion mutants of Staphylococcus epidermidis affected in biofilm formation[J].Infect Immun,1996,64(1):277-282.

[13]STEPANOVIC S,VUKOVIC D,DAKIC I,et al.A modified microtiter-plate test for quantification of staphylococcal biofilm formation[J].J Microbiol Meth,2000,40(2):175-179.

[14]陳 強，鄢慶枇，鄒文政，等.環(huán)境因子對溶藻弧菌粘附大黃魚表皮粘液影響的研究[J].海洋與湖沼，2007，38（4）：361-366.

[15]段韻涵，韓北忠，楊葆華，等.培養(yǎng)條件對金黃色葡萄球菌生物被膜生長的影響[J].中國釀造，2008，27（3）：17-20.