響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒廢酵母改性特性研究

陳衛(wèi)林，閻曉菲，高 蕾，尹明遠(yuǎn)，王小標(biāo)，苗 森，董新平，武 運*

（1.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 科學(xué)技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052；3.新疆中信國安葡萄酒業(yè)有限公司，新疆 瑪納斯 832200）

隨著工業(yè)的發(fā)展，重金屬污染已經(jīng)成為當(dāng)今最重要的環(huán)境問題之一，生物吸附（biosorption）利用生物體或其衍生物吸附水中的金屬離子，再經(jīng)固液分離，可以達到水體凈化目的，是一種可大量處理低濃度重金屬廢水的理想方法[1]。研究表明，許多藻類、細(xì)菌、真菌以及酵母等微生物都能有效地吸附水溶液中重金屬離子[2-6]。我國是啤酒生產(chǎn)大國，廢酵母的生成量非?？捎^，但我國對廢酵母的利用還不是很充分，大多是經(jīng)過簡單加工制成粗蛋白飼料，甚至不加利用直接排入江河，造成了資源的極大浪費或環(huán)境污染[7-8]，將這些大量易于獲取的廉價的生物材料制備成生物吸附劑，不僅可以減輕這些行業(yè)處理廢棄菌體的負(fù)擔(dān)，還可達到“以廢治廢”的目的[9]。另外，對吸附重金屬后的釀酒廢酵母進行洗脫，不但洗脫后的酵母可以對重金屬進行再次吸附，洗脫液中的重金屬也可以進行回收利用，變害為寶。

生物吸附主要是由于細(xì)胞壁上的官能團——蛋白質(zhì)、肽、羧基、磺酸基等與金屬離子的相互作用[10-11]，啤酒酵母細(xì)胞壁厚度為25～70nm，重量約占細(xì)胞干重的25%，主要成分為葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)和幾丁質(zhì)，另有少量脂質(zhì)[12-14]。為了提高其對重金屬的吸附效率可對其進行簡單的化學(xué)改性，常用的改性劑主要有酸、堿、鹽等。一般而言，酸處理作用不明顯，有時還會降低吸附性能，但劉恒等[15]發(fā)現(xiàn)酸處理過的啤酒酵母其吸附量增大；堿處理的主要作用是使吸附劑表面去質(zhì)子化，減少重金屬離子與氫根產(chǎn)生的斥力。張云松等[16]發(fā)現(xiàn)NaOH修飾菌表面的羧基、氨基、羥基、酰胺基和磷?；炔煌潭鹊貐⑴c了吸附反應(yīng)，NaOH修飾菌具有較高的Cu2+吸附能力。

本實驗以釀酒廢酵母作為生物吸附劑，用HCl和NaOH作為改性劑探討釀酒廢酵母改性特性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

釀酒廢酵母：新疆烏蘇啤酒廠。

硝酸鉛（分析純）：天津市福晨化學(xué)試劑廠；鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）：天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DHG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技儀器有限公司；MAS9000系列原子吸收光譜儀：北京盈安美誠科學(xué)儀器有限公司；THZ-82型氣浴恒溫振蕩器：常州市國立試驗設(shè)備研究所；TD5A-WS臺式低速離心機：長沙湘儀離心機儀器有限公司；AR2130/C型電子精密天平：奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 釀酒廢酵母改性工藝

釀酒廢酵母菌體的制備：用蒸餾水將釀酒廢酵母洗滌、離心數(shù)次，至上清液澄清，棄去上清液，收集菌體，在烘箱中80℃烘至質(zhì)量恒定，冷卻后粉碎成粉，過60目篩，干燥保存?zhèn)溆肹17]。

改性釀酒廢酵母菌體的制備：將獲得的釀酒廢酵母菌體用不同的改性劑，在不同的改性溫度、液料比、改性時間以及改性劑濃度條件下對菌體進行改性，用蒸餾水將改性后的酵母洗滌、離心數(shù)次，至上清液呈中性，棄去上清液，收集菌體，在烘箱中80℃烘至質(zhì)量恒定，冷卻后粉碎成粉，過60目篩，干燥保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 重金屬溶液的配制

精密稱取0.159 8g硝酸鉛，用蒸餾水于100mL容量瓶中定容至刻度，制得1 000μg/mL的Pb2+溶液，將其作為母液。按試驗需要的重金屬濃度對母液進行稀釋。

1.3.3 改性釀酒廢酵母對Pb2+吸附率的測定方法

改性釀酒廢酵母對Pb2+的吸附：移取20mL Pb2+（30μg/mL）溶液于三角瓶中，在水浴鍋中預(yù)熱至30℃，加入0.02g干燥改性酵母，于氣浴恒溫振蕩器中30℃恒溫振蕩60min，取樣過濾，用原子吸收光譜儀測定濾液中Pb2+濃度。Pb2+吸附率計算方法如下：

式中：ρ0為吸附前溶液中Pb2+濃度，mg/L；ρ1為吸附后溶液中Pb2+濃度，mg/L。

1.3.4 改性試驗

改性劑的選擇：將釀酒廢酵母分別置于濃度為0.1mol/L、0.5mol/L、1.0mol/L的NaOH溶液和HCl溶液中，在改性溫度30℃、改性時間60min、液料比為20∶1（mL∶g）條件下進行改性，用蒸餾水將改性后的酵母洗滌、離心數(shù)次，至上清液呈中性，棄去上清液，收集菌體，在烘箱中80℃烘至質(zhì)量恒定，冷卻后粉碎成粉，過60目篩，用改性后的釀酒廢酵母粉吸附Pb2+并計算吸附率。

單因素試驗：

（1）液料比對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響：改性劑由改性劑的選擇試驗確定，濃度為0.3mol/L，液料比分別為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1（mL∶g），其他條件同1.3.4 進行改性并計算其對Pb2+的吸附率。

（2）改性溫度對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響：料液比由（1）確定，改性溫度分別為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃其他條件同（1）進行改性并計算其對Pb2+的吸附率。

（3）改性時間對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響：改性溫度由（2）確定，改性時間分別為30min、90min、150min、210min、270min、330min，其他條件同（2）進行改性并計算其對Pb2+的吸附率。

（4）改性劑濃度對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響：改性時間由（3）確定，改性劑濃度分別為0.1mol/L、0.3mol/L、0.5mol/L、0.8mol/L、1.1mol/L，其他條件同（3）進行改性并計算其對Pb2+的吸附率。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗：在單因素試驗的基礎(chǔ)上，綜合考慮各單因素對釀酒廢酵母對Pb2+吸附的影響，采用統(tǒng)計分析軟件建立4因素3水平的Box-Behnken模型，確定最優(yōu)改性工藝。以釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率為響應(yīng)值，改性時間、改性溫度、料液比及改性劑濃度為自變量，變量因素編碼及水平見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平及編碼Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果與分析

2.1.1 改性劑的選擇

表2 不同改性劑對吸附率的影響Table 2 Effect of different modifier on adsorption rate

由表2可知用NaOH改性可以提高釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率，用HCl改性可以降低釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率，因此選擇NaOH作為最優(yōu)改性劑。用NaOH改性可以提高釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率可能是由于酵母細(xì)胞壁中的酰胺鍵及酯鍵在堿性條件下水解出氨基、羥基和羧基等，從而提高了其吸附能力[18]。

2.1.2 液料比對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響

圖1 液料比對吸附率的影響Fig.1 Effect of liquid-solid ratio on adsorption rate

由圖1可知，釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率隨著液料比的增加而逐漸提高，當(dāng)液料比為40∶1（mL∶g）時吸附率達到最大值，此后隨著液料比的增加釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率反而降低。這可能是由于吸附率在未達到最大值之前，改性劑的相對量不夠，釀酒廢酵母表面吸附位點沒有完全暴露，隨著液料比的增加而逐漸暴露，吸附率也隨之提高，吸附率達到最大值之后，隨著液料比的增加，改性劑的量相對過剩，反而破壞了能夠與Pb2+結(jié)合的官能團，從而降低了吸附率。因此確定最佳液料比為40∶1（mL∶g）。

2.1.3 改性溫度對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響

圖2 改性溫度對吸附率的影響Fig.2 Effect of modification temperature on adsorption rate

由圖2可知，釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率隨著改性溫度的增高而逐漸提高，當(dāng)改性溫度為40℃時吸附率達到最大值，此后隨著改性溫度的升高釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率反而降低。這可能是由于過高的溫度破壞了能夠與Pb2+結(jié)合的官能團，從而降低了吸附率。因此確定最佳改性溫度為40℃。

2.1.4 改性時間對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響

由圖3可知，改性時間在30～150min期間釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率變化不大，在150～270min期間吸附率隨著改性時間的延長而逐漸提高，當(dāng)改性時間為270min時吸附率達到最大值，此后隨著改性時間的延長釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率降低。這可能是由于改性時間過長，能夠與Pb2+結(jié)合的官能團被破壞而造成的。因此確定最佳改性時間為270min。

圖3 改性時間對吸附率的影響Fig.3 Effect of modification time on adsorption rate

2.1.5 改性劑濃度對釀酒廢酵母吸附Pb2+能力的影響

圖4 改性劑濃度對吸附率的影響Fig.4 Effect of modifier concentration on adsorption rate

由圖4可知，釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率隨著改性劑濃度的增大而逐漸提高，當(dāng)改性劑濃度為0.3mol/L時吸附率達到最大值，此后隨著改性劑濃度的增大釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率降低。這可能是由于過高的改性劑濃度破壞了能夠與Pb2+結(jié)合的官能團，從而降低了吸附率。因此確定最佳改性劑濃度為0.3mol/L。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化釀酒廢酵母改性條件

2.2.1 Box-Benhnken 的中心組合設(shè)計試驗

對釀酒廢酵母改性工藝進行響應(yīng)面分析，具體試驗方案及結(jié)果見表3。

利用Design Expert軟件對各因素進行二次多元回歸擬合，得到二次多項回歸方程：

表4為回歸模型方差分析結(jié)果，回歸方差分析顯著性檢驗表明該回歸模型極顯著（P=0.000 8＜0.01），失擬項不顯著（P=0.104 7＞0.05），并且該模型R2=0.862 1，R2adj=0.724 2，模型信噪比（adeq precision=8.961）大于臨界值4，說明該模型與試驗擬合情況良好，可以用該回歸方程代替試驗真實點對試驗結(jié)果進行分析和預(yù)測。

表3 響應(yīng)面試驗方案與試驗結(jié)果Table 3 Experimental design and result of response surface methodology

由表4方差分析結(jié)果可知，對方程影響程度由大到小依次為改性溫度、液料比、改性劑濃度和改性時間，改性溫度對方程影響最顯著，說明改性溫度直接關(guān)系釀酒廢酵母對Pb2+吸附率的大小，而液料比、改性劑濃度和改性時間對釀酒廢酵母吸附Pb2+的吸附率影響不顯著。A、A2對模型的影響極顯著（P＜0.001），B2和C2項對模型的影響高度顯著（P＜0.01）；交互項BC對模型的影響也達到了顯著水平（P＜0.05），表明各因素之間不是簡單的線性關(guān)系，而是二次關(guān)系。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

2.2.2 響應(yīng)面結(jié)果分析

由圖5的響應(yīng)曲面可以看出，在所選參數(shù)范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點及極值，說明參數(shù)所選范圍合理；吸附率隨著改性溫度的變化其變化率最大，液料比次之，改性劑濃度和改性時間不明顯，說明改性溫度對吸附率的改變貢獻最大，直接關(guān)系釀酒廢酵母對Pb2+吸附率的大小。

2.2.3 響應(yīng)面結(jié)果驗證試驗

由模型方程計算可得，最優(yōu)改性方案為改性溫度43.09℃，液料比40.62∶1（mL∶g），改性時間270.02min，改性劑濃度0.32mol/L，理論最大吸附率為90.24%。根據(jù)操作的可行性將以上條件調(diào)整為改性溫度43℃，液料比41∶1（mL∶g），改性時間270min，改性劑濃度0.32mol/L，重復(fù)3次試驗，平均Pb2+吸附率為89.96%，與預(yù)測值基本一致。

3 結(jié)論

為提高釀酒廢酵母對重金屬的吸附能力，對釀酒廢酵母進行改性，通過改性劑的選擇試驗發(fā)現(xiàn)，用NaOH作為改性劑可以提高釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率，HCl反而降低釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率，因此選擇NaOH作為最優(yōu)改性劑。

以NaOH作為最優(yōu)改性劑，通過單因素試驗和響應(yīng)面試驗對釀酒廢酵母改性工藝條件進行優(yōu)化，研究結(jié)果表明改性溫度對改性效果影響最大，并且料液比與改性時間存在交互作用。得到二次多項式回歸模型為：吸附率=89.49+4.51A+1.18B-0.14C+0.19D-2.12AB-0.46AC+0.93AD+3.72BC+60.27BD+0.6CD-7.23A2-4.49B2-4.77C2-2.4D2。最佳改性條件為改性溫度43℃，液料比41∶1(mL∶g)，改性時間270min，改性劑濃度0.32mol/L。經(jīng)過驗證試驗可知在此條件下制得的改性釀酒廢酵母對Pb2+的吸附率可達89.96%，與預(yù)測值基本一致，可為以后的酵母改性提供理論指導(dǎo)。

圖5 各因素相互作用對吸附率影響的響應(yīng)曲面及等高線圖Fig.5 Response surface plot and contour line of interaction among each factors on adsorption rate

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