新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；i場斷奶仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及臨床防治

齊向濤 許 追 齊亞銀

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；i場斷奶仔豬副豬嗜血桿菌的分離鑒定及臨床防治

齊向濤 許 追 齊亞銀*

（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆石河子 832000)

本試驗從新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；i場采集疑似由副豬嗜血桿菌引起的病變組織，進(jìn)行實驗室分離鑒定，確診為副豬嗜血桿菌致病。對患病的3頭豬進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn)，恩諾沙星、氟苯尼考、林克霉素對該病都有很好的效果，對于感染嚴(yán)重的豬只建議使用頭孢喹肟、頭孢噻呋，同時建議對全群用恩諾沙星和替米考星配合拌料或用氟苯尼考和替米考星配合拌料進(jìn)行藥物預(yù)防。規(guī)?；i場為防止該病的發(fā)生，還應(yīng)選擇正規(guī)廠家的藥物進(jìn)行治療，注意豬場的嚴(yán)格消毒，做好豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒2型的免疫，防止繼發(fā)感染。

副豬嗜血桿菌；斷奶仔豬；細(xì)菌培養(yǎng)；臨床治療

副豬嗜血桿菌病是由副豬嗜血桿菌（HPS）引起的以多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎為特征的細(xì)菌性傳染病[1]，主要引起肺的漿膜、心包、腹腔漿膜和四肢關(guān)節(jié)漿膜的纖維素性炎癥，該病可能引發(fā)高發(fā)病率和高死亡率的全身性疾病，影響豬生長的各個階段，通常早期斷奶的仔豬在母源抗體不存在的情況下，副豬嗜血桿菌的晚期感染可能會導(dǎo)致嚴(yán)重的后果[2]。

有人認(rèn)為副豬嗜血桿菌是機(jī)會致病菌，只在與其他病毒或其他細(xì)菌協(xié)同時才會致病。該病一般多繼發(fā)于其他呼吸道病毒和細(xì)菌感染，并且引起在豬群中常見的呼吸道疾病綜合征，近年來，從患肺炎的豬群中分離出副豬嗜血桿菌的比率越來越高，這與支原體肺炎、病毒性肺炎等疾病的日趨流行有關(guān)。

若要確診該病，可在臨床癥狀和尸體剖檢的基礎(chǔ)上，再結(jié)合實驗室檢測，作出初步判定，咳嗽、呼吸困難、消瘦、跛行和被毛粗亂是主要臨床癥狀[3]。副豬嗜血桿菌病是密集飼養(yǎng)，特別是豬繁殖與呼吸綜合征廣泛流行后才日益嚴(yán)重的一種疾病，在鑒別診斷上應(yīng)注意與豬多發(fā)性漿膜炎與關(guān)節(jié)炎、豬丹毒、豬鏈球菌病相區(qū)別，同時也應(yīng)注意與其他敗血性細(xì)菌病相區(qū)別。

1 材料與方法

1.1 病料

2013年9月6日，新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；i場送檢疑似因呼吸道疾病而引起死亡的仔豬。病死豬關(guān)節(jié)腫大，關(guān)節(jié)剖開后流出蛋清樣液體（圖1、2），可見典型的絨毛心（圖3），無菌-采集其肺臟以及胸腔積液，于20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 菌株及血液

綿羊血采自石河子大學(xué)動物醫(yī)院。將健康綿羊血放入裝有玻璃珠高壓滅菌的三角瓶，搖至纖維蛋白與血清完全分離為止，放冰箱冷藏保存?zhèn)溆谩＝瘘S色葡萄球菌由石河子大學(xué)動物科技學(xué)院傳染病實驗室保存并提供。

1.3 主要儀器

HDX-9162MBE電熱恒溫培養(yǎng)箱、ZHWY-2102C恒溫培養(yǎng)振蕩器、單人雙面超凈工作臺、CX21FS1生物顯微鏡、高速冷凍離心機(jī)、電子天平、隔水式恒溫培養(yǎng)箱、立式電熱壓力蒸汽滅菌鍋等。

1.4 試驗動物

25日齡左右的小白鼠12只（均購于石河子大學(xué)動物養(yǎng)殖中心）。

圖1 關(guān)節(jié)腫大

圖2 關(guān)節(jié)剖開后流出蛋清樣液體

圖3 絨毛心

2 主要培養(yǎng)基的配制

2.1 血瓊脂培養(yǎng)基

按說明書配制普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，121℃高壓滅菌15～20分鐘后，室溫冷卻到50℃左右，加入新鮮的脫纖綿羊血，輕微搖勻，待均勻后倒入高壓滅菌后的平板中。

2.2 巧克力瓊脂培養(yǎng)基

稱取營養(yǎng)瓊脂等試劑，調(diào)節(jié)pH值，121℃高壓滅菌15～20分鐘后，室溫冷卻到80℃左右，加入無菌新鮮比例為5%～10%的脫纖綿羊血，輕微搖勻，等培養(yǎng)基變?yōu)榍煽肆ι珪r取出，待溫度降至45℃左右時傾注平板即成。

2.3 TSA和TSB培養(yǎng)基

TSA和TSB培養(yǎng)基均按照相應(yīng)說明書進(jìn)行配制，121℃高壓滅菌20分鐘后，室溫保存?zhèn)溆?。培養(yǎng)胸膜肺炎放線桿菌（APP）用的TSA在傾注平板前加入20 μg/mL的NAD（1-萘乙酰胺）和5%小牛血清，TSB待冷卻后加入20 μg/mL的NAD和5%犢牛血清。

3 試驗方法

3.1 HPS的分離培養(yǎng)

無菌條件下從疑似病豬的肺臟、胸腔積液等病料組織中取樣，分別無菌接種到TSA培養(yǎng)基（含20 μg/mL的NAD、5%小牛血清）、巧克力瓊脂平板、鮮血瓊脂平板中，放入37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24～36小時，挑起單個菌落進(jìn)行純培養(yǎng)和鏡檢。

3.2 細(xì)菌CAMP試驗

在無菌的條件下，用接種環(huán)挑取形態(tài)和培養(yǎng)特性疑似HPS的菌株，接種到無NAD的鮮血瓊脂培養(yǎng)基上，同時用接種環(huán)將金黃色葡萄球菌在培養(yǎng)基上垂直劃兩條平行線，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24小時，再用接種環(huán)挑取純化的可疑菌落在金黃色葡萄球菌的線上交叉劃線，放入37℃恒溫箱培養(yǎng)24小時，觀察結(jié)果。

3.3 生化試驗

將上述衛(wèi)星試驗中未出現(xiàn)溶血的菌株進(jìn)行生化鑒定，進(jìn)行生化鑒定前先在生化鑒定管中加入5%血清和20 μg/mL的NAD，然后將菌株分別加入蔗糖、鳥氨酸、麥芽糖、硝酸鹽、靛基質(zhì)、甘露醇、吲哚、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、木糖、接觸酶、乳糖、葡萄糖、VP、脲酶、核糖、果糖等一系列生化培養(yǎng)基中，置37℃搖床內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，24小時后可以陸續(xù)觀察結(jié)果。

3.4 動物致病試驗

選取小白鼠進(jìn)行感染試驗，將預(yù)先準(zhǔn)備好的12只小公鼠隨機(jī)分為兩組，一組為試驗組另一組設(shè)置為對照組。試驗組每只小鼠腹腔注射菌液0.3 mL，對照組腹腔注射相同體積的生理鹽水LB肉湯，隔離飼養(yǎng)并觀察小鼠的癥狀，對發(fā)病或死亡的小鼠進(jìn)行剖檢，無菌采集其心血進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)鑒定。

4 結(jié)果

4.1 細(xì)菌分離鑒定及生化特性

4.1.1 細(xì)菌的培養(yǎng)特性及形態(tài)

從新疆石河子地區(qū)某規(guī)?；i場送檢的疑似因呼吸道疾病引起病變的病料中分離細(xì)菌，經(jīng)過涂片染色，鏡檢可知均為革蘭氏陰性小短桿菌，與豬多殺性巴氏桿菌相似。該菌為兩極濃染的小球桿菌，菌體形態(tài)多樣，大部分為纖細(xì)桿狀菌，有的為長而彎曲的絲狀菌體，該細(xì)菌在TSA（含5%小牛血清和20μg/mL的NAD）和含有NAD的鮮血平板培養(yǎng)基中生長旺盛，但是在麥康凱瓊脂平板和普通瓊脂平板上未見生長，在TSA（含5%小牛血清和20 μg/mL的NAD）的平板上生長，為露珠狀、半透明、邊緣整齊的光滑小菌落，但是該菌在鮮血平板和巧克力平板上生長不好。

4.1.2 細(xì)菌的生化特性

4.1.2.1 細(xì)菌CAMP試驗結(jié)果

從試驗結(jié)果可知，細(xì)菌CAMP試驗呈陽性，選取的菌株在鮮血平板上出現(xiàn)明顯的衛(wèi)星現(xiàn)象，該菌越靠近金黃色葡萄球菌菌落的地方生長越好；相反，越遠(yuǎn)離金黃色葡萄球菌菌落的地方，其菌落明顯變少變小，再遠(yuǎn)離則沒有菌落生長，試驗中未發(fā)現(xiàn)溶血現(xiàn)象。

4.1.2.2 生化試驗結(jié)果

從生化試驗結(jié)果可知（表1），分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、蔗糖等碳水化合物，不能發(fā)酵甘露醇、鼠李糖、山梨醇，硝酸鹽，脲酶試驗、吲哚試驗等顯陰性。

4.2 動物接種試驗結(jié)果

試驗組小鼠腹腔注射稀釋好的菌液，4小時之后，陸續(xù)有小鼠開始震顫，小鼠相互擁擠，24小時后兩只小鼠死亡，另外兩只小鼠基本恢復(fù)正常。對死亡的小鼠進(jìn)行解剖，采集其心血進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)過鏡檢可以看出分離菌的形態(tài)特征和接種前的特征基本一致，對照組沒有明顯變化。

5 治療方案

試驗選擇某廠家主要成分為恩諾沙星、氟苯尼考和林可霉素的3種臨床上常用的抗生素，對臨床出現(xiàn)典型癥狀的3頭病豬進(jìn)行治療。經(jīng)過3天的治療，病豬的癥狀明顯減輕，7天后病豬痊愈。對于嚴(yán)重患病的豬可考慮用頭孢喹肟、頭孢噻呋進(jìn)行治療，會取得更好的效果。

如果遇上副豬嗜血桿菌病的嚴(yán)重暴發(fā)，建議對全群用恩諾沙星和替米考星配合拌料，或者用氟苯尼考和替米考星配合拌料，進(jìn)行藥物預(yù)防，而不只是對表現(xiàn)出臨床癥狀的豬用藥。用藥時選擇正規(guī)廠家生產(chǎn)的藥物，按照說明書合理用藥，以減少致病菌耐藥現(xiàn)象的出現(xiàn)。

表1 生化試驗結(jié)果

6 分析與討論

6.1 HPS的生物學(xué)特性

根據(jù)發(fā)病豬群的流行病學(xué)特征、臨床征狀、實驗室檢驗結(jié)果，綜合鑒定此分離菌為副豬嗜血桿菌。經(jīng)過與豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌發(fā)病豬的臨床征狀、剖檢病變和流行病學(xué)特征進(jìn)行對比，可知副豬嗜血桿菌和豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌有相似的致病特征，故臨床上經(jīng)常發(fā)生對該病的誤診，造成治療失敗。

由于副豬嗜血桿菌飼養(yǎng)較難，對營養(yǎng)要求高，很難分離到，所以建議從全身各重點組織或體液中采取新鮮樣品作為試驗組織病料。本試驗從釆集病料到送檢不超過12小時，這樣可以提高該菌的分離效率。

該菌在鮮血平板和巧克力平板上生長不好，在TSA（含5%小牛血清和20 μg/mL的NAD）培養(yǎng)基和含有NAD的鮮血平板培養(yǎng)基中生長旺盛，在麥康凱瓊脂平板和普通瓊脂平板上未見生長，這為該菌培養(yǎng)條件的選擇提供了參考。

6.2 HPS的臨床治療方法

HPS一年四季均可引發(fā)，常伴隨著豬繁殖與呼吸綜合征和豬圓環(huán)病毒2型的發(fā)病而產(chǎn)生繼發(fā)感染，根據(jù)臨床實踐發(fā)現(xiàn)，患有副豬嗜血桿菌病的豬一般都伴有豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染。本試驗送檢豬場的病變豬只是否存在原發(fā)性病毒感染，仍需做進(jìn)一步檢測。

6.3 HPS的防治措施

預(yù)防副豬嗜血桿菌病要盡量減少各種應(yīng)激，控制溫度及飼養(yǎng)密度，注意產(chǎn)房及保育舍的溫度不能過低。仔豬在斷尾、斷牙、去勢時，如果消毒不徹底也可以造成該病的發(fā)生。豬場還應(yīng)同時做好豬繁殖與呼吸綜合征和圓環(huán)病毒病的免疫。

[1] 王平利,梁宏德,陳福偉.豬副豬嗜血桿菌感染的病理學(xué)觀察[J].河南農(nóng)業(yè)科學(xué), 2005(12):82-85.

[2] 林雪玲,黃耿森,冼瓊珍.副豬嗜血桿菌分離鑒定與PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2006(3):321-324.

[3] 蔡旭旺,劉正飛,陳煥春,等.副豬嗜血桿菌的分離培養(yǎng)和血清型鑒定[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2005,24(1):55-58.

S858.28

B

1673-4645(2014)02-0047-03

2013-11-23

齊向濤（1987-），男，漢族，陜西西安縣人，碩士研究生，從事獸醫(yī)技術(shù)服務(wù)

*通信作者：齊亞銀（1980-），博士研究生，副教授，主要從事動物傳染病的診斷與防治工作