NDV7793促進(jìn)人CD4+T細(xì)胞表達(dá)TRAIL的實驗研究

樊曉暉等

【摘要】 目的：研究新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）弱毒株NDV7793能否促進(jìn)人CD4+ T細(xì)胞表達(dá)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡因子誘導(dǎo)配體（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL）。方法：首先用免疫磁珠分選法（magnetic activated cell sorting， MACS）分選外周血靜止CD4+ T細(xì)胞，然后加抗CD3抗體、抗CD28抗體和白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）使之成為能被NDV激活的CD4+ T細(xì)胞。用流式細(xì)胞技術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測NDV刺激的CD4+ T細(xì)胞的TRAIL的表達(dá)水平。結(jié)果：MACS法分選外周血得到的CD4+ T細(xì)胞純度達(dá)到（97.38±0.28）%；能被NDV激活的CD4+ T細(xì)胞表面分子CD25和CD69雙陽性表達(dá)率可達(dá)（29.30±1.08）%，與PBS陰性對照組（2.40±1.30）%相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；FCM檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，NDV7793刺激的CD4+ T細(xì)胞TRAIL表達(dá)水平均有顯著升高，且在NDV7793效價為25 HU時達(dá)到最大值。結(jié)論：NDV7793可刺激CD3抗體、CD28抗體和IL-2預(yù)先活化的CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL。

【關(guān)鍵詞】 新城疫病毒； CD4+ T細(xì)胞； TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體

NDV是經(jīng)過臨床評估后可以作為載體用于溶瘤治療、基因治療和免疫激活的五種病毒之一[1-3]。全身治療時，只有少部分NDV能到達(dá)腫瘤組織，其發(fā)揮直接的溶瘤作用十分有限[4]。然而NDV在抗腫瘤中卻仍能發(fā)揮重要作用，這與NDV刺激免疫細(xì)胞而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)有關(guān)，這些細(xì)胞包括NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞以及T細(xì)胞等[5-8]。已有實驗證明，NDV可刺激NK細(xì)胞和巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)TRAIL的產(chǎn)生而殺傷腫瘤[5-6]。那么CD4+ T細(xì)胞是否能在NDV的刺激后上調(diào)TRAIL的表達(dá)呢？這方面的研究還未見報道。本研究選用來自江西鄱陽湖野鴨的非溶瘤株NDV7793，探討NDV7793激活人CD4+ T細(xì)胞與TRAIL的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 新城疫病毒W(wǎng)DKX/7793/2004（簡稱NDV7793）分離自江西鄱陽湖的野鴨，由香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)系管軼教授饋贈；細(xì)胞與雞胚CD4+ T細(xì)胞分離自健康人群的外周血（得到捐獻(xiàn)者知情同意）。9～10 d SPF雞胚，購自南寧市良鳳江農(nóng)牧有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購自挪威AXIS-SHIELD公司；CD4+ T細(xì)胞分選試劑盒（130-091-155）購自Miltenyi公司；PE標(biāo)記的鼠抗人CD25（anti-CD25-PE）單克隆抗體、FITC標(biāo)記的鼠抗人CD69（anti-CD69-FITC）單克隆抗體、PE標(biāo)記的鼠抗人TRAIL（anti-TRAIL-PE）單克隆抗體、PE標(biāo)記的Mouse IgG1 κ同型對照、FITC標(biāo)記的Mouse IgG1 κ同型對照、鼠抗人CD3（anti-CD3）單克隆抗體、鼠抗人CD28（anti-CD28）單克隆抗體均購自eBioscience公司；FITC標(biāo)記的鼠抗人CD4（anti-CD4-FITC）單克隆抗體購自BD公司；重組人IL-2、重組人IFNα均購自PEPROTECH公司；RNeasy Mini總RNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；流式細(xì)胞儀（BDFACSCalibur）為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 NDV7793的擴增與純化 取0.2 mL血凝效價為51.2 HU（hemagglutinationuint，血凝單位）的NDV7793接種于9～10日齡的SPF雞胚中。擴增培養(yǎng)48 h后，收取血凝效價≥1：1024的尿囊液，置4 ℃?zhèn)溆谩? ℃離心（1000×g，30 min）初步純化，取上清液于4 ℃超速離心（50000×g，1 h），去上清。用含0.1%EDTA的PBS溶解病毒沉淀，得NDV7793病毒原液，效價51200 HU。將病毒原液用含0.1%EDTA的PBS 10倍稀釋成5120 HU的病毒工作液，置-80 ℃保存，備用。

1.2.2 CD4+ T細(xì)胞的分離純化及鑒定 抽取健康志愿者的靜脈血，用肝素鈉抗凝，與生理鹽水等體積稀釋后采用Ficoll密度梯度離心法離心（800×g，離心20 min），以獲取外周血單個核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），之后用生理鹽水充分洗滌所得PBMC并計數(shù)。采用免疫磁珠分選法（陰選法）從PBMC懸液中分選收集CD4+ T細(xì)胞。所得CD4+ T細(xì)胞在2 h內(nèi)以anti-CD4-FITC抗體染色，同時設(shè)立IgG同型對照組和空白對照組，經(jīng)FCM鑒定后，以CD4+ T細(xì)胞的比例為90%～99%作為合格純度。

1.2.3 CD4+ T細(xì)胞的預(yù)先活化及活化水平的檢測 取無菌96孔平底板，每孔加入50 μL（10 μg/mL）的anti-CD3抗體進(jìn)行包被，4 ℃孵育過夜，棄去anti-CD3包被液，用200 μL PBS洗滌兩次，每孔加入2×105個CD4+ T細(xì)胞，再依次加入anti-CD28和IL-2（終濃度分別為2 μg/mL和200 U/mL），作用16 h后，將5×105個anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后的CD4+ T細(xì)胞重懸于PBS中，加入anti-CD69-FITC和anti-CD25-PE抗體進(jìn)行染色，2 h內(nèi)采用FCM法檢測CD4+ T細(xì)胞的活化水平。

1.2.4 FCM檢測不同效價NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化的CD4+ T細(xì)胞16h后對TRAIL蛋白表達(dá)的影響 采用效價分別為25、50、100、200 HU的NDV7793刺激活化的CD4+ T細(xì)胞16 h。設(shè)立四組對照組：陰性對照組（PBS）、IFNα陽性對照組（IFNα，200 U/mL）、25 HU經(jīng)紫外線滅活的NDV7793（ultra-violet inactivated NDV7793，UV-NDV7793 ）刺激組和25 HU NDV刺激的未活化的CD4+ T細(xì)胞組。收集各組CD4+ T細(xì)胞，加入5 μL anti-TRAIL-PE抗體染色（同時設(shè)立IgG同型對照組和空白對照組），4 ℃孵育30 min，加入PBS，200×g離心10 min，洗滌細(xì)胞兩次，加入300 μL PBS重懸細(xì)胞，F(xiàn)CM檢測CD4+ T細(xì)胞表面TRAIL蛋白的表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，計量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，進(jìn)行隨機區(qū)組設(shè)計方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+ T細(xì)胞純度的鑒定 FCM法檢測結(jié)果顯示，經(jīng)過免疫磁珠分選法分選出的CD4+ T細(xì)胞的純度達(dá)到（97.38±0.28）%。

2.2 anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化CD4+ T細(xì)胞的結(jié)果 CD4+ T細(xì)胞經(jīng)anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后，F(xiàn)CM檢測CD4+ T細(xì)胞的活化程度，即CD25和CD69在CD4+ T細(xì)胞膜上表達(dá)率。結(jié)果如圖1所示，活化的CD4+ T細(xì)胞的CD25和CD69的雙陽性表達(dá)率可達(dá)（29.30±1.08）%，遠(yuǎn)高于PBS陰性對照組的（2.40±1.30）%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），見圖1。

2.3 NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化后的CD4+ T細(xì)胞后對CD4+ T細(xì)胞中TRAIL蛋白表達(dá)水平的影響 采用不同效價的NDV7793刺激anti-CD3、anti-CD28和IL-2活化的CD4+ T細(xì)胞16 h后，F(xiàn)CM檢測TRAIL蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果顯示不同效價NDV（25、50、100 HU和200 HU）刺激后的TRAIL蛋白的表達(dá)量分別為（26.59±5.79）%、（22.94±3.23）%、（18.76±2.85）%和（19.56±4.51）%，與PBS陰性對照組的（5.82±2.05）%和未活化組（4.28±1.42）%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。其中25 HU NDV7793刺激組與IFNα陽性對照組（21.36±1.60）%比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。UV-NDV刺激組的TRAIL蛋白表達(dá)率為（14.08±2.62）%，與PBS組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。25 HU NDV7793刺激組與UV-NDV刺激組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01），同時與100、200 HU NDV7793刺激組比較，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），從而可知，25 HU NDV7793刺激活化的CD4+ T細(xì)胞TRAIL蛋白表達(dá)量最高（圖2）。

3 討論

T細(xì)胞是人體重要的免疫細(xì)胞之一。根據(jù)其表面的白細(xì)胞分化抗原的不同，又可以分為CD4+ T細(xì)胞、CD8+ T細(xì)胞等亞群。根據(jù)T淋巴細(xì)胞的功能可將其分為細(xì)胞毒性T細(xì)胞（cytotoxic T cell，CTL）、輔助性T細(xì)胞（helper T cell）、調(diào)節(jié)/抑制T細(xì)胞（regulatory/suppressor T cell）和記憶T細(xì)胞（memory T cell）。長期以來，在抗腫瘤細(xì)胞免疫中，人們一直把重點放在CD8+ T CTL上，而忽視了CD4+ T CTL和CD4+ Th細(xì)胞的作用。已有研究表明活化的CD4+ CTL細(xì)胞可直接殺傷腫瘤細(xì)胞[9]，然而NDV通過對CD4+ T細(xì)胞的免疫刺激進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的研究較少報道，因此，筆者選擇用NDV7793弱毒株刺激CD4+ T細(xì)胞，探討CD4+ T細(xì)胞活化的初步機制，為后續(xù)研究NDV7793活化CD4+ T細(xì)胞對癌細(xì)胞的殺傷及機制研究奠定基礎(chǔ)。

關(guān)于活化CD4+ T細(xì)胞的表型，筆者選擇了TRAIL。TRAIL是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第3個TNF家族的凋亡因子，在大多數(shù)的正常組織細(xì)胞都有顯著表達(dá)，但并不殺傷大多數(shù)的正常細(xì)胞，其首要的作用是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。在腫瘤生物治療中，TRAIL作為腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）超家族成員之一，已經(jīng)成非常有潛力的腫瘤生物治療因子之一[10-11]。

實驗中筆者用流式細(xì)胞術(shù)（FMC）檢測到了受NDV7793刺激的活化的CD4+ T細(xì)胞顯著表達(dá)了TRAIL蛋白，與IFNα陽性對照組及PBS為陰性對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），證實了NDV7793可以上調(diào)活化的CD4+ T細(xì)胞TRAIL的表達(dá)。NDV7793在刺激未活化的CD4+ T時，TRAIL蛋白并沒有得到顯著表達(dá)，在此筆者推測NDV7793不能激活CD4+ T細(xì)胞，并且只能通過活化后的CD4+ T發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)。另外，被滅活的NDV7793（UV-NDV）在刺激活化的CD4+ T時，TRAIL蛋白的表達(dá)高于PBS陰性對照組，卻低于IFNα陽性對照組和未被滅活的NDV7793組（圖2），說明TRAIL的上調(diào)過程可能存在多個途徑，需要進(jìn)行進(jìn)一步研究。

在NDV刺激CD4+ T細(xì)胞分泌TRAIL蛋白的實驗中，筆者還發(fā)現(xiàn)，NDV刺激CD4+ T細(xì)胞分泌TRAIL，隨著NDV效價的增高到一定的濃度（25 HU），CD4+ T細(xì)胞分泌TRAIL反而下降（圖2），可能的原因是25 HU的NDV是刺激CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL的合適濃度，當(dāng)提高NDV濃度后，過多的NDV將通過抑制CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL過程的某個機制而下調(diào)TRAIL的表達(dá)，NDV與CD4+ T細(xì)胞表達(dá)TRAIL這種負(fù)相關(guān)的詳細(xì)機制，值得去深入探討。

綜上，筆者證實了NDV7793刺激活化的CD4+ T細(xì)胞后，上調(diào)了TRAIL蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步完善NDV通過TRAIL發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng)的免疫機制奠定基礎(chǔ)，也為NDV應(yīng)用于抗腫瘤的免疫治療提供一些基礎(chǔ)研究的實驗線索。

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（收稿日期：2014-02-19） （本文編輯：蔡元元）

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（收稿日期：2014-02-19） （本文編輯：蔡元元）