水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌CW9的鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化＊

夏振強(qiáng)，朱 明

（1.中國礦業(yè)大學(xué) 環(huán)測學(xué)院，江蘇 徐州 222116；2.淮海工學(xué)院 江蘇省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 連云港 222005）

藥物殘留問題一直困擾著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。從長遠(yuǎn)來看，必須改變傳統(tǒng)的養(yǎng)殖和病害防治模式。篩選益生菌制成微生物制劑來取代抗生素等抗菌類化學(xué)藥品，能夠避免抗生素所帶來的幼苗免疫力下降、藥物殘留、二次污染等負(fù)面影響，實(shí)現(xiàn)清潔和環(huán)境友好的水產(chǎn)養(yǎng)殖模式，被聯(lián)合國糧農(nóng)組織確定為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)疾病控制的主要研究領(lǐng)域之一［1］。目前已有一些微生物活性制劑應(yīng)用于魚、蝦、蟹、軟體動物的養(yǎng)殖和餌料生物的培養(yǎng)，顯示出良好的經(jīng)濟(jì)效益［2－3］。常見的水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌包括各種光合細(xì)菌、硝化菌、反硝化菌、乳酸細(xì)菌、弧菌屬、芽孢桿菌屬及假單胞菌屬等微生物［4－5］。

本課題組從連云港對蝦養(yǎng)殖水體分離到一株細(xì)菌CW9，養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)證明，該菌的投放能夠有效提高南美白對蝦和中華絨螯蟹蝦蚤狀一期幼體的變態(tài)率和存活率［6］。本文通過16SrDNA序列同源性分析和生理生化反應(yīng)對該菌進(jìn)行了鑒定，并以生物量為考察因素，對菌株N6的發(fā)酵培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，為該菌株的規(guī)?；瘧?yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌種

益生菌CW9，由筆者所在課題組篩選及保存。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基：蛋白胨5g／L，酵母膏1g／L，NaCl 20g／L，瓊脂18g／L，pH 7.0。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨5g／L，酵母膏1g／L，NaCl 20g／L，pH 7.0。

出發(fā)培養(yǎng)基：葡萄糖6g／L，硫酸銨4g／L，酵母膏1g／L，NaCl 20g／L，pH 7.0。

以上培養(yǎng)基121℃，滅菌20min。

1.3 種子培養(yǎng)

取新鮮菌種1環(huán)，接入裝有60mL新鮮種子培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，于28℃、180r／min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24h。

1.4 初始發(fā)酵培養(yǎng)條件

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要配制發(fā)酵培養(yǎng)基置于500mL三角瓶中，裝液量為100mL，接入上述新鮮種子液1 mL，于28℃、180r／min培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)24h。

1.5 菌種鑒定

16SrDNA的測定由上海生物工程有限公司完成；生理生化反應(yīng)管購自杭州天和微生物有限公司。

1.6 細(xì)胞濃度與吸光度關(guān)系曲線

取10mL新鮮菌液在5 000r／min離心10min，倒去上清液，沉淀菌體用生理鹽水溶液重新懸浮，還原體積，再將此菌懸液分別稀釋4，6，8，10，12，14倍，在波長630nm測定OD值，生理鹽水作為參比，重復(fù)3次。同時平板稀釋涂布法計(jì)數(shù)測定原菌液的細(xì)胞濃度，繪制細(xì)胞濃度與吸光度關(guān)系曲線，得細(xì)胞濃度C＝（3.610 6×OD630－0.307 4）×109（cfu／mL），r＝0.997 6。此后實(shí)驗(yàn)過程中的細(xì)胞濃度通過測定OD630，再依據(jù)此公式換算得出。

2 結(jié)果與分析

2.1 益生菌的鑒定

2.1.1 形態(tài)特征 該菌株為革蘭氏陽性菌，無芽孢，無莢膜，不運(yùn)動；在平板上菌落黃色，圓形，中間突起，光滑，濕潤；靜止期細(xì)胞多數(shù)呈球形，φ（0.5～1）μm，少量呈短桿狀，φ（0.2～0.4）μm×（1.4～2.0）μm；旺盛生長期全部呈桿狀，端圓，常呈“V”字形排列；球狀菌時期革蘭氏陽性，桿狀菌時期革蘭氏弱陽性甚至陰性。

2.1.2 生理生化反應(yīng) CW9菌的生理生化反應(yīng)結(jié)果如表1所示。

表1 CW9菌生理生化反應(yīng)結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical characteristic analysis of CW9

圖1 基于16SrDNA序列的進(jìn)化樹分析Fig.1 Phylogenetic trees inferred from 16SrDNA sequence using neighbor－joining method

進(jìn)化樹分析表明：益生菌CW9與Arthrobactersp.TCCC23001的親緣關(guān)系最近，但兩者的相似性也只有96%。經(jīng)對比《伯杰氏細(xì)菌手冊》，該菌與手冊描述的菌落形態(tài)及顯微特征一致，生理生化反應(yīng)特征基本一致。因此，可以確定CW9為一株節(jié)桿菌，故將其命名為Arthrobactersp.CW9。但該菌屬于哪個種還待進(jìn)一步確認(rèn)。

2.2 發(fā)酵條件優(yōu)化

2.2.1A.sp.CW9的生長曲線 配制出發(fā)培養(yǎng)基，分裝12個500mL三角瓶，每瓶100mL，28℃、搖床180r／min培養(yǎng)，定時取樣，波長630nm測定OD值，根據(jù)公式換算成細(xì)胞濃度。結(jié)果如圖2所示。綜合考慮效率與產(chǎn)量兩個因素，確定在培養(yǎng)到21h結(jié)束發(fā)酵，此時細(xì)胞濃度為5.47×109cfu／mL。

2.2.2 溫度對A.sp.CW9生長的影響 其他條件不變，改變培養(yǎng)溫度，搖床保溫21h后，考察A.sp.CW9的生長情況，在波長630nm測定OD值，根據(jù)公式換算成細(xì)胞濃度，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，26℃時A.sp.CW9長得最好，溫度超過30℃則生長率急劇下降。

圖2 A.sp.CW9生長時間曲線Fig.2 Growth curve of A.sp.CW9

2.2.3 初始pH對A.sp.CW9生長的影響 其他條件不變，改變培養(yǎng)基的初始pH，搖床培養(yǎng)21h后，測定菌體生長情況。如圖4所示，有利于A.sp.CW9生長的培養(yǎng)基初始pH為7.5。

圖3 溫度對A.sp.CW9生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of A.sp.CW9

圖4 pH對A.sp.CW9生長的影響Fig.4 Effect of pH on the growth of A.sp.CW9

2.2.4 接種量對A.sp.CW9生長的影響 保持出發(fā)培養(yǎng)基不變，初始pH調(diào)為7.5，改變接種量，搖床培養(yǎng)21h后，測定菌體生長情況。圖5數(shù)據(jù)顯示，在實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)，接種量對最終細(xì)胞濃度影響不是太大，其中2%的接種量相對較好。

圖5 接種量對A.sp.CW9生長的影響Fig.5 Effect of inoculation volume on the growth of A.sp.CW9

2.2.5 搖床轉(zhuǎn)速對A.sp.CW9生長的影響 其他條件不變，接種量為2%，改變轉(zhuǎn)速分別為160，180，200以及220r／min，搖床培養(yǎng)21h后，測定菌體生長情況。圖6顯示，搖床轉(zhuǎn)速200r／min最有利于A.sp.CW9的生長。

2.2.6 碳源種類及其質(zhì)量濃度的優(yōu)化 其他條件不變，改變碳源種類，質(zhì)量濃度都為6g／L。搖床培養(yǎng)21h后，測定菌體生長情況。結(jié)果顯示，葡萄糖的利用效果最好，效果顯著優(yōu)于其他（圖7）。進(jìn)一步的質(zhì)量濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，8g／L的葡萄糖質(zhì)量濃度有利于A.sp.CW9的生長（圖8）。

圖6 搖床轉(zhuǎn)速對A.sp.CW9生長的影響Fig.6 Effect of rotation speed on the growth of A.sp.CW9

圖7 不同碳源對A.sp.CW9生長的影響Fig.7 Effects of carbon sources on the growth of A.sp.CW9

圖8 葡萄糖質(zhì)量濃度對A.sp.CW9生長的影響Fig.8 Effect of glucose concentration on the growth of A.sp.CW9

2.2.7 氮源種類及其質(zhì)量濃度的優(yōu)化 其他條件不變，改變氮源種類，質(zhì)量濃度都為4g／L。搖床培養(yǎng)21h后，測定菌體生長情況。結(jié)果顯示，有機(jī)氮源中的牛肉膏和蛋白胨作為氮源，A.sp.CW9的生長效果最好，遠(yuǎn)優(yōu)于無機(jī)氮源。豆餅粉作為無機(jī)氮源的效果不好，可能與其難以利用有關(guān)（圖9）。進(jìn)一步的質(zhì)量濃度優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，5g／L的蛋白胨質(zhì)量濃度為最佳（圖10）。

圖9 不同氮源對A.sp.CW9生長的影響Fig.9 Effects of nitrogen sources on the growth of A.sp.CW9

圖10 蛋白胨質(zhì)量濃度對A.sp.CW9生長的影響Fig.10 Effect of peptone concentration on the growth of A.sp.CW9

2.2.8 酵母膏質(zhì)量濃度的優(yōu)化 在發(fā)酵培養(yǎng)基中，酵母膏不僅作為氮源，而且是重要的生長因子提供者。優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11所示，酵母膏的最佳質(zhì)量濃度為3g／L。

圖11 酵母膏質(zhì)量濃度對A.sp.CW9生長的影響Fig.11 Effect of yeast extract concentration on the growth of A.sp.CW9

2.2.9 NaCl質(zhì)量濃度的優(yōu)化 如圖12所示，NaCl質(zhì)量濃度為10g／L時，A.sp.CW9的生長情況最好，細(xì)胞濃度達(dá)6.90×1010cfu／mL。隨著NaCl質(zhì)量濃度的升高，最終的細(xì)胞濃度緩慢降低，說明該菌對NaCl質(zhì)量濃度有較強(qiáng)的耐受性。

圖12 NaCl質(zhì)量濃度對A.sp.CW9生長的影響Fig.12 Effect of NaCl concentration on the growth of A.sp.CW9

3 結(jié)論

經(jīng)過菌落形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)分析以及16SrDNA的鑒定，確定益生菌CW9是節(jié)桿菌屬的一個種，命名為Arthrobactersp.CW9。進(jìn)化樹分析未發(fā)現(xiàn)與該菌遺傳特征特別相近的菌種，是否新種有待深入研究。發(fā)酵條件及培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果為：葡萄糖8g／L，蛋白胨5g／L，酵母膏3g／L，NaCl 10 g／L，pH 7.5，溫度26℃，接種量為2%以及搖床轉(zhuǎn)速為200r／min，培養(yǎng)21h后，獲得最大的細(xì)胞濃度達(dá)6.90×1010cfu／mL。與出發(fā)條件相比，細(xì)胞濃度提升顯著，為該菌株的工業(yè)化應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

［1］ SUBSNGHE R.FAO Fisheries Circular No.886［R］.Rome：Food and Agriculture Organization of the United Nations，1997：45－49.

［2］ 劉忠穎，劉洋，鮑相渤，等.水產(chǎn)養(yǎng)殖益生菌的研究進(jìn)展［J］.水產(chǎn)科學(xué)，2010，28（8）：500－504.

［3］ 樓丹，楊季芳，謝和.益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的作用［J］.浙江萬里學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，22（2）：78－83.

［4］ 劉君，宋曉玲，陳志鑫.益生菌對水產(chǎn)動物的作用研究進(jìn)展［J］.動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009，30（9）：78－81.

［5］ 周國勤，陳樹橋，茆建強(qiáng)，等.益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究 進(jìn) 展 ［J］.安 徽 農(nóng) 業(yè) 科 學(xué)，2006，34（11）：2421－2425.

［6］ 朱明，莫照蘭，閻斌倫，等.節(jié)桿菌CW9及其用途：CN，201010572426.6［P］.2013－08－28.