腎血管平滑肌脂肪瘤中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

孫圣坤，許 勇，宋爾霖，郭 剛，陳光富，符偉軍，徐阿祥，張 旭

解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 100853

腎血管平滑肌脂肪瘤中間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定

孫圣坤，許 勇，宋爾霖，郭 剛，陳光富，符偉軍，徐阿祥，張 旭

解放軍總醫(yī)院 泌尿外科，北京 100853

目的 明確經(jīng)典型腎血管平滑肌脂肪瘤組織中是否存在間充質(zhì)干細(xì)胞。方法收集8例腎血管平滑肌脂肪瘤手術(shù)切除的標(biāo)本，剪碎后PBS洗滌，以膠原酶水解，貼壁培養(yǎng)后傳代，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型，并行體外成骨、成脂肪分化檢測。結(jié)果從8例腎血管平滑肌脂肪瘤組織中均分離出具有間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)特征的貼壁細(xì)胞，該細(xì)胞不表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45、CD144等造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，而表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志如CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等。在體外誘導(dǎo)后具有向骨、脂肪組織分化的能力。結(jié)論腎血管平滑肌脂肪瘤組織中存在具有間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、表型和功能特征的一群細(xì)胞，間充質(zhì)干細(xì)胞可能與腎血管平滑肌脂肪瘤的發(fā)生具有密切關(guān)系。

腎臟；血管平滑肌脂肪瘤；間充質(zhì)干細(xì)胞；病因?qū)W；細(xì)胞分化；錯構(gòu)瘤

腎血管平滑肌脂肪瘤(renal angiomyolipoma，RAML)是腎最常見的良性腫瘤。近年來，隨著醫(yī)學(xué)影像學(xué)的發(fā)展和人們對健康體檢的重視，其檢出率逐漸升高。文獻(xiàn)報道其發(fā)生率為0.3% ～ 3%，其中80%為散發(fā)型，與遺傳無關(guān)，其余20%與結(jié)節(jié)性硬化和散發(fā)型淋巴管肉瘤有關(guān)[1-3]。RAML是腎的良性病變，通常不會發(fā)生轉(zhuǎn)移，但其進(jìn)行性生長會破壞正常腎組織，損害腎功能。此外由于腫瘤血管不成熟，組織結(jié)構(gòu)較脆弱，在輕微外力作用下即可發(fā)生破裂。直徑＞4 cm的腫瘤合并破裂出血的危險性大大增加，絕大部分患者需要急診行血管介入栓塞治療，甚至被迫切除腎，嚴(yán)重時會危及患者生命。目前RAML的病因不明，由于瘤體的主要組成成分血管、平滑肌、脂肪組織均為間質(zhì)成分，可由間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSC)分化而來，這提示我們，該腫瘤可能是一種干細(xì)胞起源性疾病。本研究旨在對RAML組織中的干細(xì)胞進(jìn)行分離、培養(yǎng)并鑒定。

材料和方法

1 材料 8例標(biāo)本來自2009年3月- 2011年5月解放軍總醫(yī)院泌尿外科手術(shù)切除的RAML，其中男性2例，女性6例，年齡16 ～ 48(42.6±14.4)歲。術(shù)后病理HE染色確認(rèn)為經(jīng)典型RAML。

2 自RAML標(biāo)本中分離、培養(yǎng)細(xì)胞 無菌條件下獲取新鮮的RAML標(biāo)本，去除腫瘤表面的組織，將腫瘤切碎成1 ～ 3 mm3大小，PBS充分洗滌，在組織培養(yǎng)皿中將組織研磨，37℃以5 ml 0.075%Ⅰ型膠原酶(Sigma-Aldrich，St. Louis，MO，USA)消化30 min，同時攪拌。加入相同體積的含10% FBS的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)終止消化。將消化后的單細(xì)胞懸液以培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)液為不含核糖核苷和脫氧核苷的α-MEM(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，并含10% FBS、0.45 mmol/L硫代甘油(MTG；Sigma-Aldrich)、100 U/ml青霉素(Hyclone，Logan，UT，USA)、100 ng/ml鏈霉素(Hyclone)、1 ng/ml bFGF(R&D Systems，Minneapolis，MN，USA)，隔日更換培養(yǎng)液，當(dāng)貼壁細(xì)胞生長至80% ～90%融合時，胰酶消化細(xì)胞并按照1∶3傳代擴(kuò)增。

3 流式細(xì)胞術(shù) 取對數(shù)生長期3×105個細(xì)胞以PBS洗滌3次，分別加入相應(yīng)抗體，4℃孵育30 min，按照說明書操作，使用BD FACSCalibur(BD Biosciences，San Jose，CA，USA)進(jìn)行檢測。FITC或PE標(biāo)記的抗人單克隆抗體CD14、CD19、CD34、CD73、CD105、CD166、HLA-DR購自BD公司，CD29、CD44購自BioLegend(San Diego，CA，USA)公司，CD31、CD144購自eBioscience(San Diego，CA，USA)公司。

4 成骨分化及檢測 細(xì)胞按照104個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，棄去培養(yǎng)液，分為誘導(dǎo)組和對照組，誘導(dǎo)組加入成骨細(xì)胞培養(yǎng)液(含10%的高糖DMEM+0.2 mmol/L維生素C+10-7mol/L地塞米松+10 mmol/L β甘油磷酸鈉)，對照組僅加入普通培養(yǎng)液。每組設(shè)3復(fù)孔，每3 d換液1次，培養(yǎng)2周后，以PBS洗滌，甲醛固定，堿性磷酸酶染色評價成骨分化。

5 脂肪分化及檢測 細(xì)胞按照104個/孔的密度接種于6孔板中，待細(xì)胞生長至對數(shù)生長期時，棄去培養(yǎng)液，分為誘導(dǎo)組和對照組，誘導(dǎo)組加入脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液(含10% FBS的高糖DMEM+10%馬血清+10-6mol/L地塞米松+0.5 μmol/L甲基黃嘌呤+ 5 ng/ml胰島素+60 μmol/L吲哚美辛+10-4mol/L氫化可的松)，對照組僅加入普通培養(yǎng)液，培養(yǎng)1周后，PBS洗滌，以10%多聚甲醛固定，加入1 ml油紅O工作液，用60%異丙醇去除多余染液，蒸餾水洗滌5 min后，顯微鏡下觀察。

結(jié) 果

1 組織切片 石蠟包埋組織后切片，進(jìn)行HE染色，顯示腫瘤由大量脂肪細(xì)胞、厚壁血管及平滑肌組成，符合經(jīng)典型RAML的組織學(xué)特點，見圖1。

2 細(xì)胞形態(tài) 貼壁培養(yǎng)1 d后，去除培養(yǎng)液中的懸浮細(xì)胞，即可見小簇狀生長的細(xì)胞，培養(yǎng)4 d后，細(xì)胞即達(dá)到90%融合，1代后細(xì)胞形態(tài)即均一，顯示為典型的紡錘樣外觀。見圖2。

3 細(xì)胞表型 對數(shù)生長期的細(xì)胞抗體標(biāo)記后進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測，該細(xì)胞不表達(dá)CD14、CD31、CD34、CD45、CD144等造血細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞表面標(biāo)志，而表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志如CD29、 CD44、CD73、CD90、CD105等。見圖3。

4 細(xì)胞多向分化功能 成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸由紡錘樣外觀轉(zhuǎn)變?yōu)楸馄叫螤?，胞體寬大，堿性磷酸酶染色可見大量細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶表達(dá)，對照組為陰性。細(xì)胞進(jìn)行脂肪誘導(dǎo)分化后，細(xì)胞內(nèi)逐漸出現(xiàn)細(xì)小脂滴，1周后油紅染色可見明顯細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，對照組為陰性。見圖4。

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞是來源于中胚層的具有自我更新和多向分化潛能的干細(xì)胞，幾乎存在于人體所有組織。MSC具有向成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞分化的能力，此外還能分化產(chǎn)生成肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等間質(zhì)細(xì)胞，最近研究認(rèn)為MSC甚至可以向非間質(zhì)性細(xì)胞分化，如分化成上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞[4]。本研究從手術(shù)切除的標(biāo)本中分離培養(yǎng)出的貼壁細(xì)胞具備傳統(tǒng)MSC的形態(tài)特征，細(xì)胞表型分析與骨髓來源的MSC類似。多向分化功能是MSC重要的功能特征，體外分化研究表明，該類細(xì)胞經(jīng)成骨分化培養(yǎng)液誘導(dǎo)后，能夠表達(dá)堿性磷酸酶，在脂肪誘導(dǎo)分化培養(yǎng)體系中細(xì)胞內(nèi)會出現(xiàn)脂滴，表明此類細(xì)胞具有向成骨、脂肪細(xì)胞分化的潛能，符合MSC的多向分化功能特征。由于MSC的多向分化性，并且其產(chǎn)生的間質(zhì)是腫瘤的重要組成部分，因此其與腫瘤的發(fā)生、生長的關(guān)系受到重視。研究發(fā)現(xiàn)，MSC產(chǎn)生的間質(zhì)促進(jìn)腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移，全身注射MSC會向腫瘤部位聚集并通過自分泌和旁分泌方式促進(jìn)腫瘤生長、轉(zhuǎn)移[4]。值得注意的是，MSC本身即具有致瘤作用，比如Ewing's肉瘤就起源于MSC，因為腫瘤來源的細(xì)胞能夠分化成骨、脂肪組織[5]。此外，Wilms瘤細(xì)胞系也與MSC表型高度類似，并同樣具有MSC的多樣分化功能[6]。體外培養(yǎng)的食蟹猴MSC在長期傳代后可以發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后的MSC具有很強的致瘤性，注射入非肥胖糖尿病/重癥聯(lián)合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠皮下后會形成腫瘤[7]。

目前，MSC研究主要集中在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展、組織工程、組織器官移植、造血發(fā)育等方面，很少關(guān)注其在良性腫瘤中的存在以及發(fā)揮的作用[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有成體組織中的MSC都位于血管旁，甚至有研究發(fā)現(xiàn)血管周細(xì)胞即具有MSC的表型和功能特征，如周細(xì)胞體內(nèi)和體外可以分化為血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞[9-11]。因此我們推測，RAML中的MSC可能位于血管壁中，研究發(fā)現(xiàn)，MSC可以通過多種途徑促進(jìn)新生血管形成進(jìn)而促進(jìn)腫瘤生長。MSC能夠產(chǎn)生、分泌多種血管生成因子如VEGF-A、血管生成素、EGF、KGF、IGF-1、凝集素-1等，并通過募集內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)新生血管成熟[12-13]。此外，MSC自身可以分化為內(nèi)皮樣細(xì)胞，直接參與腫瘤血管的形成[14]。

圖 1 RAML石蠟切片(HE, ×40)圖 2 RAML組織中分離的貼壁細(xì)胞(×10)Fig. 1 HE-stained paraffin sections of renal angiomyolipoma(HE, ×40)Fig. 2 Adherent cells isolated from renal angiomyolipoma tissue(×10)

圖 3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表型Fig. 3 Flow cytometry showing MSC phenotypes

圖 4 細(xì)胞成骨分化和脂肪分化(×20) A：成骨分化對照ALP染色; B： 成骨分化ALP染色； C： 脂肪分化對照； D： 脂肪分化油紅O染色Fig. 4 ALP staining showing osteogenesis (A, B) and adipogenesis (C), and oil red-O staining showing adipogenesis(D)

目前已在正常腎組織中發(fā)現(xiàn)了多種干細(xì)胞。自妊娠晚期的腎發(fā)生區(qū)域可分離出多能的胚胎干細(xì)胞，從人類胚胎和正常嚙齒類腎中發(fā)現(xiàn)了具有間質(zhì)表型的干細(xì)胞[15-16]。正常成人腎皮質(zhì)中分離出的CD133+腎細(xì)胞表達(dá)胚胎腎標(biāo)志PAX-2，表明其來源于腎。這類細(xì)胞能夠擴(kuò)增并具有一定的自我更新能力，在體外可以分化為上皮或內(nèi)皮細(xì)胞，接種SCID小鼠體內(nèi)可形成腎小管樣結(jié)構(gòu)，表達(dá)腎上皮標(biāo)志[17]。Sagrinati等[18]自腎小囊中分離出多能的CD133+/CD24+細(xì)胞，具有自我更新潛能和很強的克隆形成能力，可以被誘導(dǎo)產(chǎn)生成熟的功能性腎小管細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞，植入急性腎衰的SCID小鼠體內(nèi)可再生腎小管樣結(jié)構(gòu)。

自腎癌組織中發(fā)現(xiàn)的CD133+/CD34-細(xì)胞，其數(shù)量很少，不到整個腎癌組織的1%[19]。但腎癌的腫瘤干細(xì)胞并非來源于正常腎的CD133+細(xì)胞，而是源于分化階段更早期的具有間質(zhì)表型的細(xì)胞，其具有自我更新能力、克隆形成能力、體內(nèi)成瘤能力，并具有多向分化功能，不僅能產(chǎn)生腫瘤的上皮成分，也能產(chǎn)生腫瘤的內(nèi)皮細(xì)胞[20]。自腎癌組織中分離出的CD105+細(xì)胞，在SCID小鼠體內(nèi)具有100%成瘤功能，并且表達(dá)CD44、CD90、CD146、CD73、CD29、波形蛋白等MSC標(biāo)志，以及Nanog、Oct4、Musashi、Nestin、Pax2等干細(xì)胞標(biāo)志，體外可以分化為上皮和內(nèi)皮細(xì)胞，因此認(rèn)為腎癌干細(xì)胞具備MSC表型特征，這也與腎的間質(zhì)起源相符合[21]。2010年P(guān)ark研究小組發(fā)現(xiàn)腎包膜組織中存在MSC樣細(xì)胞，該細(xì)胞群在腎包膜中的密度為0 ～ 10個/mm2，其具有自我更新能力并能多向分化，能夠向缺血的腎間質(zhì)以30μm/h的速度移動，體外傳代50代以上仍保持增殖能力。研究認(rèn)為，腎包膜中的MSC樣細(xì)胞在腎損傷修復(fù)中發(fā)揮作用[22]。我們注意到，臨床上幾乎所有RAML均為外生性生長(即腫瘤大部分體積突出于腎包膜)。這提示我們，RAML很可能從腎包膜或者淺表腎皮質(zhì)發(fā)生，而這一區(qū)域經(jīng)Park證實為富含MSC的區(qū)域，這與我們的發(fā)現(xiàn)不謀而合，因此我們推測，RAML的發(fā)生可能起源于MSC。

綜上所述，自RAML中分離出的MSC可能在RAML形成中發(fā)揮重要作用。明確RAML的發(fā)病原因，能夠為RAML的預(yù)防及治療提供新的思路。但MSC的來源以及在RAML中的定位，其具體在RAML發(fā)生中的作用，都需要進(jìn)一步的研究。

1 Steiner MS， Goldman SM， Fishman EK， et al. The natural history of renal angiomyolipoma［J］. J Urol， 1993， 150（6）： 1782-1786.

2 Eble JN. Angiomyolipoma of kidney［J］. Semin Diagn Pathol，1998， 15（1）：21-40.

3 Lienert AR， Nicol D. Renal angiomyolipoma［J］. BJU Int， 2012，110（S4）：25-27.

4 Cuiffo BG， Karnoub AE. Mesenchymal stem cells in tumor development： emerging roles and concepts［J］. Cell Adh Migr，2012， 6（3）： 220-230.

5 Johann PD， Vaegler M， Gieseke F， et al. Tumour stromal cells derived from paediatric malignancies display MSC-like properties and impair NK cell cytotoxicity［J］. BMC Cancer， 2010， 10： 501.

6 Li H， Fan X， Kovi RC， et al. Spontaneous expression of embryonic factors and p53 point mutations in aged mesenchymal stem cells： a model of age-related tumorigenesis in mice［J］. Cancer Res， 2007，67（22）： 10889-10898.

7 Ren Z， Wang J， Zhu W， et al. Spontaneous transformation of adult mesenchymal stem cells from cynomolgus macaques in vitro［J］. Exp Cell Res， 2011， 317（20）： 2950-2957.

8 孫圣坤，徐阿祥，張旭.腎臟血管平滑肌脂肪瘤的診斷及治療進(jìn)展［J］.微創(chuàng)泌尿外科雜志，2013，2（3）：213-216.

9 Crisan M， Yap S， Casteilla L， et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs［J］. Cell Stem Cell， 2008， 3（3）： 301-313.

10 Covas DT， Panepucci RA， Fontes AM， et al. Multipotent mesenchymal stromal cells obtained from diverse human tissues share functional properties and gene-expression profile with CD146+ perivascular cells and fibroblasts［J］. Exp Hematol， 2008， 36（5）：642-654.

11 Kida Y， Duffield JS. Pivotal role of pericytes in kidney fibrosis［J］. Clin Exp Pharmacol Physiol， 2011， 38（7）： 467-473.

12 Oskowitz AZ， Penfornis P， Tucker A， et al. Drosha regulates hMSCs cell cycle progression through a miRNA Independent mechanism［J］. Int J Biochem Cell Biol， 2011， 43（11）： 1563-1572.

13 Suzuki K， Sun R， Origuchi M， et al. Mesenchymal stromal cells promote tumor growth through the enhancement of neovascularization［J］. Mol Med， 2011， 17（7/8）： 579-587.

14 Razban V， Lotfi AS， Soleimani M， et al. HIF-1α overexpression induces angiogenesis in mesenchymal stem cells［J］. Biores Open Access， 2012， 1（4）： 174-183.

15 Pleniceanu O， Harari-Steinberg O， Dekel B. Concise review：Kidney stem/progenitor cells： differentiate， sort out， or reprogram?［J］. Stem Cells， 2010， 28（9）：1649-1660.

16 O’neill JD， Freytes DO， Anandappa AJ， et al. The regulation of growth and metabolism of kidney stem cells with regional specificity using extracellular matrix derived from kidney［J］. Biomaterials，2013， 34（38）： 9830-9841.

17 Bussolati B， Bruno S， Grange C， et al. Isolation of renal progenitor cells from adult human kidney［J］. Am J Pathol， 2005， 166（2）：545-555.

18 Sagrinati C， Netti GS， Mazzinghi B， et al. Isolation and characterization of multipotent progenitor cells from the Bowman’s capsule of adult human kidneys［J］. J Am Soc Nephrol， 2006， 17（9）：2443-2456.

19 Bruno S， Bussolati B， Grange C， et al. CD133+renal progenitor cells contribute to tumor angiogenesis［J］. Am J Pathol， 2006， 169（6）：2223-2235.

20 Bussolati B， Brossa A， Camussi G. Resident stem cells and renal carcinoma［J/OL］. http：//dx.doi.org/10.4061/2011/286985

21 Bussolati B， Bruno S， Grange C， et al. Identification of a tumorinitiating stem cell population in human renal carcinomas［J］. FASEB J， 2008， 22（10）： 3696-3705.

22 Park HC， Yasuda K， Kuo MC， et al. Renal capsule as a stem cell niche［J］. Am J Physiol Renal Physiol， 2010， 298（5）： F1254-F1262.

Isolation and identifcation of mesenchymal stem cells in renal angiomyolipoma

SUN Sheng-kun, XU Yong, SONG Er-lin, GUO Gang, CHEN Guang-fu, FU Wei-jun, XU A-xiang, ZHANG Xu
Department of Urinary Surgery, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China

XU A-xiang. Email：xuaxiang301@sina.com

ObjectiveTo establish whether mesenchymal stem cells (MSC) exist in classic renal angiomyolipoma (RAML) tissue.MethodsRAML tissue samples were taken from 8 patients during surgery, washed in PBS, hydrolyzed in collagenase, and incubated in adherent and passage culture. Their phenotype, parallel in vitro osteogenesis, and fat tissue differentiation were detected by fow cytometry.ResultsMSC-characterized adherent cells, isolated from the RAML tissue samples, did not express the surface markers of blood cells or endothelial cells such as CD14, CD31, CD34, CD45, and CD144, but expressed the surface markers of MSC such as CD29, CD44, CD73, CD90, and CD105, and could differentiate into osteogenic and fat tissue after incubated in vitro.ConclusionThere exist a group of cells with morphology phenotype and features of MSC, and MSC are closely related with the development of RAML.

kidney; angiomyolipoma; mesenchymal stem cells; etiology; cell differentiation; hamartoma

R 342

A

2095-5227(2014)07-0751-04

10.3969/j.issn.2095-5227.2014.07.029

時間：2014-03-19 08:31

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.3275.R.20140417.1506.009.html

2013-11-04

孫圣坤，男，博士，副主任醫(yī)師。研究方向：泌尿生殖系統(tǒng)干細(xì)胞。Email：ssk301@sina.com

徐阿祥，男，碩士，副主任醫(yī)師。Email：xuaxiang301@sina.com