二甲雙胍抑制子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠移植瘤生長

謝 婭 孫紅敏 張 穎 史明星

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450052）

二甲雙胍抑制子宮內(nèi)膜癌細胞裸鼠移植瘤生長

謝 婭 孫紅敏 張 穎 史明星

（鄭州大學第一附屬醫(yī)院婦科，河南 鄭州 450052）

二甲雙胍；子宮內(nèi)膜癌；癌細胞；裸鼠；移植瘤

子宮內(nèi)膜癌是常見的婦科惡性腫瘤，占女性腫瘤患者的6%，且近年來其發(fā)病率有上升趨勢[1]。大約80%的子宮內(nèi)膜癌患者診斷為I期并需要行子宮切除術。一些肥胖、糖耐量異常、月經(jīng)不規(guī)則、長期不排卵和多囊卵巢的年輕患者易患子宮內(nèi)膜癌[2]。這部分患者面臨著治療的困境，非常關心生育功能的保留。因此，保留生育功能的治療對這些患者來說至關重要。大量證據(jù)表明肥胖、糖尿病和胰島素抵抗是子宮內(nèi)膜癌的危險因素[3]。

二甲雙胍作為治療2型糖尿病經(jīng)典而有效的藥物，已有近50年的臨床應用歷史。二甲雙胍是一種降血糖藥，具有提高血糖耐受性、降低基礎和餐后血糖的作用[4]。流行病學研究資料表明合并糖尿病的子宮內(nèi)膜癌的患者服用二甲雙胍可降低子宮內(nèi)膜癌的死亡風險[5]。

實驗室研究也表明二甲雙胍有抑制幾種腫瘤細胞生長的作用（包括乳腺癌、結腸癌和子宮內(nèi)膜癌）[6]。我們前期體外研究發(fā)現(xiàn)胰島素樣生長因子-Ⅰ（IGF-Ⅰ）和胰島素樣生長因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）促進細胞增殖，然而二甲雙胍抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生長[7]。二甲雙胍通常是通過STK11（也稱LKB1）激活AMPK[8]，激活過程涉及多個參與細胞增殖調(diào)節(jié)的信號通路，其中包括mTOR通路[9]。然而，在子宮內(nèi)膜癌中，65%的LKB1表達缺失，從而導致mTOR信號通路的過度激活[8]。

本研究是在我們前期研究的基礎上進一步探討在動物水平驗證二甲雙胍是否有抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生長的作用，以期為臨床治療需求新的治療方法。

1 材料與方法

1.1 細胞系和試劑

人子宮內(nèi)膜癌細胞系（HEC-1B）為中分化由北京大學第一醫(yī)院保存。細胞系維持在DMEM/F12添加10%胎牛血清在37 ℃、5%CO2中。細胞系常規(guī)3～5 d傳代。二甲雙胍購自Sigma公司。用PBS將水溶性藥物二甲雙胍配制為濃度10-1M的二甲雙胍儲備液，-20 ℃保存。

1.2 建立裸鼠成瘤模型

實驗選用4～6周齡的雌性BALB/c裸鼠10只，北京維通利華實驗動物技術有限公司提供（SPF級，實驗動物生產(chǎn)許可證號，SCXK（京）2006-0008，體質(zhì)量為18～24克/只）。飼養(yǎng)由科澳協(xié)力飼養(yǎng)有限公司提供的SPF級標準飼料（北京市實驗動物質(zhì)量合格證明編號，SCXK（京）2005-0007）。實驗期間所有動物置于同一室內(nèi)，清潔級飼料飼養(yǎng)，由北京大學醫(yī)學部科學部持上崗證人員負責飼養(yǎng)，自由進食，飲水。

1.3 實驗方案

接種HEC-1B細胞密度5×107/mL，接種前混勻，150 μL細胞/裸鼠，接種于右側腋下。裸鼠接種人子宮內(nèi)膜癌細胞HEC-1B細胞株后每天觀察其種植部位腫瘤生長情況，進食和活動情況，稱重。接種后第7天，把裸鼠隨機分成2組：一組給予二甲雙胍治療，另一組為對照。

1.4 給藥方案

二甲雙胍組：將二甲雙胍加入飲用水中，二甲雙胍的劑量為250 mg/（kg·d）。對照組：給予相同體積的PBS加于裸鼠的飲用水中。每4 d用游標卡尺測量腫瘤體積，每4 d測裸鼠體質(zhì)量。每天連續(xù)給藥30 d后終止試驗（終止給藥）。在第30天，將裸處死，腫瘤組織剝出，腫瘤組織石蠟包埋，做HE染色。由北京大學醫(yī)學部分子心血管實驗室包埋。在體腫瘤體積的計算：V=π/6（長×寬2）。

1.5 統(tǒng)計學方法

所有的數(shù)據(jù)都用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)分析用SPSS13.0獨立樣本t檢驗，P＜0.05視為有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 腫瘤大小的比較

連續(xù)30 d分別給予兩組裸鼠飲用二甲雙胍250 mg/（kg·d）（二甲雙胍組）或等量的飲用水（對照組）。30 d后終止試驗，取出腫瘤組織，測量腫瘤的大小：計算腫瘤體積：V=π/6 （長×寬×高），并拍照（圖1）。統(tǒng)計兩組裸鼠腫瘤體積的差異。每4 d測量裸鼠體質(zhì)量并測量計算移植瘤的體積，測量重復3次，結果取平均值。結果如圖2。

統(tǒng)計結果發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組體內(nèi)移植瘤體積顯著小于對照組（P＜0.05）。

圖1 兩組裸鼠的腫瘤組織圖示

圖2 兩組裸鼠給藥天數(shù)與腫瘤體積的變化

2.2 裸鼠體質(zhì)量的比較

在連續(xù)給藥的30 d中，每天檢測裸鼠體質(zhì)量，實驗重復3次，結果取平均值，結果如圖3（圖為對照組和二甲雙胍組每組裸鼠體質(zhì)量平均值的變化）所示：可以看出，二甲雙胍組裸鼠體質(zhì)量較正常對照組有下降的趨勢，但差別沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

圖3 裸鼠體質(zhì)量的比較

2.3 裸鼠體內(nèi)移植瘤HE染色

如圖4所示，將剝出的腫瘤組織做HE染色觀察腫瘤組織結構的變化，可以看出，二甲雙胍組腫瘤組織中見細胞形態(tài)消失，大片壞死細胞，細胞核碎裂。而對照組腫瘤組織中腫瘤細胞核大深染，見多個核分裂相。

3 討 論

圖4 裸鼠體內(nèi)移植瘤HE染色

我們第一次體內(nèi)實驗驗證了二甲雙胍有抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生長的作用。持續(xù)給予裸鼠二甲雙胍能夠顯著抑制體內(nèi)子宮內(nèi)膜癌細胞移植瘤的生長。且在二甲雙胍組和對照組的瘤組織HE染色片上我們可以看出，二甲雙胍組的瘤組織內(nèi)出現(xiàn)大片的壞死細胞，核碎裂。而正常對照組瘤組織生長活躍，核大且可見多個和分裂相。根據(jù)我們之前的研究結果：①二甲雙胍只在高濃度時在誘導子宮內(nèi)膜癌細胞的凋亡。②二甲雙胍能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細胞增殖。因此我們推測：二甲雙胍的作用主要是導致子宮內(nèi)膜癌細胞的壞死，而不是主要通過誘導其凋亡來抑制子宮內(nèi)膜癌細胞生長的。

二甲雙胍對體質(zhì)量的影響目前存在爭議。我們的結果表明二甲雙胍組的裸鼠體質(zhì)量有減輕的趨勢，但差別沒有統(tǒng)計學意義。在臨床觀察發(fā)現(xiàn)二甲雙胍除了有降糖效應外，還有顯著的減輕體質(zhì)量作用。但其作用機制不明。有研究發(fā)現(xiàn)，在前脂肪細胞的培養(yǎng)基中加入二甲雙胍后，AMPK磷酸化，抑制細胞內(nèi)的脂質(zhì)聚集，從而抑制了脂肪合成。這一機制可能與二甲雙胍具有潛在的的減輕體質(zhì)量重作用有關[11]。

二甲雙胍是一種用于治療2型糖尿病的雙胍類降糖藥，近來體外實驗報道二甲雙胍有抑制腫瘤細胞生長的作用，二甲雙胍以一種非胰島素介導的方式直接調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡。二甲雙胍調(diào)節(jié)的機制是通過激活AMPK，激活的AMPK調(diào)節(jié)多個信號通路，其中包括mTOR和MAPK信號通路[12]。在我們的體外實驗中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌移植瘤的裸鼠給予二甲雙胍后導致腫瘤細胞壞死增多、核碎裂增多，說明二甲雙胍可能導致子宮內(nèi)膜癌細胞壞死，其機制可能是通過激活AMPK信號通路實現(xiàn)的，關于具體的調(diào)節(jié)機制是我們下一階段研究的目標。

二甲雙胍治療2型糖尿病的藥物劑量是每天2550 mg。在我們的體內(nèi)實驗中給予裸鼠每天250 mg/kg，相當于成人每天1075 mg/70kg的劑量。因此，在本研究中的劑量不超過二甲雙胍人體最大給藥濃度，說明二甲雙胍能夠抑制裸鼠體內(nèi)人子宮內(nèi)膜癌細胞移植瘤生長并促進其壞死的結果，對于今后二甲雙胍應用于臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供了實驗室依據(jù)。本研究為臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供了新的思路。

[1] Purdie DM,Green AC,Purdie DM,et al.Epidemiology of endometrial cancer.Best practice & research[J].Clinical obstetrics & gynaecology,2001,15(3):341-354.

[2] Benedet JL,Bender H,Ngan HY,et al.FIGO staging classifications and clinical practice guidelines in the management of gynecologic cancers[J].Int J Gynaecol Obstet,2000,70(2):209-262.

[3] Pitson G,Colgan T,Levin W,et al.Stage II endometrial carcinoma: prognostic factors and risk classification in 170 patients[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys,2002,53(4):862-867.

[4] Liu H,Scholz C,Zang C,et al.Metformin and the mTOR inhibitor everolimus (RAD001) sensitize breast cancer cells to the cytotoxic effect of chemotherapeutic drugs in vitro[J].Anticancer Res,2012,32(5):1627-1637.

[5] Cui X,Zhang P,Deng W,et al.Insulin-like growth factor-I inhibits progesterone receptor expression in breast cancer cells via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin pathway: progesterone receptor as a potential indicator of growth factor activity in breast cancer[J].Mol Endoc rinol,2003,17(4):575-588.

[6] Iliopoulos D,Hirsch HA,Struhl K.Metformin decreases the dose of chemotherapy for prolonging tumor remission in mouse xenografts involving multiple cancer cell types[J].Cancer Res,20 11,71(9):3196-3201.

[7] Cui X,Zhang P,Deng W,et al.Insulin-like growth factor-I inhibits progesterone receptor expression in breast cancer cells via the phosphatidylinositol 3-kinase/Akt/mammalian target of rapamycin pathway: progesterone receptor as a potential indicator of growth factor activity in breast cancer[J].Mol Endoc rinol,2003,17(4):575-588.

[8] Alexandre KB,Smit AM,Gray IP,et a1.Metformin inhibits intracellular lipid accumulation in the murine preadipocyte cell line,3T3-L1[J].Diabetes Obes Metah,2008,10(7):688-690.

[9] Rocha GZ,Dias MM,Ropell ER,et al.Metformin amplifies chemotherapy-induced AMPK activation and antitumoral growth[J].Clin Canc Res,2011,17(10):3993-4005.

[10] Calle EE,Rodriguez C,Walker-Thurmond K,et al.Overweight ,obesity,and mortality from cancer in a prospectively studied cohort of U.S. adults[J].N Engl J Med,2003,348 (17):1625-1638.

[11] Fryer LG,Parbu-Patel A,Carling D.The Anti-diabetic drugs rosiglitazone and metformin stimulate AMP-activated protein kinase through distinct signaling pathways[J].J Biol Chem,2002,277(28): 25226-25232.

[12] Musi N,Hirshman MF,Nygren J,et al.Metformin increases AMP-activated protein kinase activity in skeletal muscle of subjects with type 2 diabetes[J].Diabetes,2002,51(7): 2074-2081.

R737.33；R-33

B

1671-8194（2014）14-0064-02

國家自然科學基金（81202070）資助