豬瘟病毒分子生物學(xué)及豬瘟防控概述

廖生錢 福建省南靖縣山城鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站 363600

豬瘟病毒分子生物學(xué)及豬瘟防控概述

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豬瘟又稱“爛腸瘟”，是由黃病毒科瘟病毒屬的豬瘟病毒引起的一種傳染病。它具有高度傳染性和致死性，我國1984年就將豬瘟列為一類動(dòng)物疫病[1]。到21世紀(jì)的今天，豬瘟仍是造成世界上大多數(shù)的養(yǎng)豬大國重要經(jīng)濟(jì)損失的疾病之一。

早在1903年，就有學(xué)者確定了豬瘟病毒的病原體是一種濾過性病毒。豬瘟的高免血清最早被成功研制是在1908年的匈牙利，這也從側(cè)面表明豬瘟當(dāng)時(shí)已在歐洲相當(dāng)流行。日本1909年報(bào)道發(fā)生了豬瘟，并開始研究該病。1925年，中國東南大學(xué)農(nóng)科系也開始研制免疫血清用于防治豬瘟[2]。

1 病 原

1.1 形態(tài)與結(jié)構(gòu) 到目前為止，仍只發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒只有一個(gè)血清型，但毒力的強(qiáng)弱卻是有分別的。豬瘟病毒粒子直徑34～50 nm，略呈圓形，具有脂蛋白囊膜。在電鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)病毒粒子表面有脆弱的纖突結(jié)構(gòu)。豬瘟病毒的等電點(diǎn)是4.8，在蔗糖密度梯度中的浮密度是每立方厘米1.15～1.16 g。

1.2 病原的基因結(jié)構(gòu)和功能 豬瘟病毒的基因組長大約12.3 kb，由中間一個(gè)大的開放閱讀框（ORF）和兩端非編碼區(qū) 5'-UTR（untranslated re-gion）及3'-UTR構(gòu)成。ORF編碼一個(gè)多聚蛋白，該多聚蛋白由3 898個(gè)氨基酸殘基組成，并在翻譯后或翻譯過程中，被病毒自身編碼的蛋白酶和宿主細(xì)胞的蛋白水解酶加工切割成 12種蛋白質(zhì)：Npro（p23）、C（p14）、Ems（gp44/48或 E0）、E1（gp33）、E2（gp55）、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B。在非編碼區(qū)結(jié)構(gòu)中，3'-UTR長222～243 bp，具有較高的屬內(nèi)保守性。5'端為一可變區(qū)域，3'端為無poly-A的尾巴，研究表明豬瘟病毒復(fù)制的起始位點(diǎn)就是位于3'端中的一段十分保守的富含ATTT的核苷酸序列中[3]。在該編碼區(qū)通過與復(fù)制相關(guān)的RdRp酶和NS5B及相應(yīng)輔助因子的作用下，以病毒RNA為模板，從3'-UTR起始部位處合成負(fù)鏈RNA，形成雙鏈RNA中間體，緊接著以負(fù)鏈RNA為模板在相應(yīng)病毒RNA的5'-UTR位置起始處以幾何遞增的方式合成病毒基因組RNA。5'-UTR可以構(gòu)成比較復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)，它的5'端缺乏甲基鳥苷帽子結(jié)構(gòu)，長360～374 bp，是毒株間最保守的部分。在豬瘟病毒復(fù)制過程中，5'-UTR作為基因翻譯的重要調(diào)控位點(diǎn)。另據(jù)報(bào)道，5'-UTR的5'-末端保守片段GTATACGAGGTTA還可能影響病毒的復(fù)制，在病毒增殖過程中起著重要的作用[3]。

1.3 蛋白質(zhì)組成 豬瘟病毒的ORF編碼含有3 898個(gè)氨基酸殘基的多聚前體蛋白，這個(gè)多聚前體蛋白在宿主細(xì)胞蛋白酶的作用或病毒的作用下能夠裂解為12種病毒成熟蛋白，其中8種為非結(jié)構(gòu)蛋白，4種為結(jié)構(gòu)蛋白。八個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白分別為Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B，4個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白為衣殼蛋白c和3種囊膜糖蛋白。 對(duì)3種囊膜糖蛋白的命名存在一定的爭議，但主要有以下兩種命名辦法：一是命名為E0、E1、E2；二是命名為E2、E3、El。有研究人員認(rèn)為前一種命名方式既能夠與同一病毒科不同屬的類丙型肝炎病毒屬丙型肝炎病毒E1和E2蛋白相對(duì)應(yīng)，又能體現(xiàn)出它們?cè)诨蚪M的順序。許多文獻(xiàn)表明，E0、E1、E2這三種病毒粒子是通過二硫鍵的作用以二聚體結(jié)構(gòu)的形式存在于病毒粒子和感染的細(xì)胞中。研究發(fā)現(xiàn)，不同的糖蛋白結(jié)構(gòu)在病毒復(fù)制中的作用也不同。

1.4 復(fù)制 豬瘟病毒在進(jìn)入宿主體內(nèi)后，通過以下兩種方式進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)：一種通過囊膜糖蛋白E0和E2的作用下細(xì)胞膜融合；二是受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入宿主細(xì)胞。豬瘟病毒在實(shí)驗(yàn)室中體外培養(yǎng)感染豬瘟病毒的細(xì)胞時(shí)，豬瘟病毒一般不引起培養(yǎng)細(xì)胞的病理變化。但在培養(yǎng)豬瘟病毒感染的豬腎細(xì)胞進(jìn)行傳代時(shí)，卻能夠?qū)е履夷ぬ堑鞍譋0的C端的Ser476突變?yōu)锳rg殘基。在豬瘟病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞后，豬瘟病毒的RNA是怎么樣從核衣殼中釋放的目前還不太明確。

豬瘟病毒為有囊膜的ssRNA病毒，其基因組是單股正鏈的。豬瘟病毒的復(fù)制和普通正鏈RNA病毒是一樣的，就是豬瘟病毒在進(jìn)入宿主細(xì)胞后，首先釋放核酸作為RNA，然后合成酶和蛋白，最后在依賴于RNA的RNA聚合酶的作用下，從基因組的3'到 5'方向復(fù)制合成負(fù)鏈RNA，與正鏈RNA形成復(fù)制中間體，然后復(fù)制中間體產(chǎn)生大量子代正鏈RNA，參與后續(xù)的蛋白質(zhì)合成和病毒粒子裝配過程。

調(diào)控豬瘟病毒基因組復(fù)制最關(guān)鍵的序列在于5'-UTR和3'-UTR，豬瘟病毒的復(fù)制主要包括以下兩步：首先以正鏈RNA為模板合成負(fù)鏈RNA，然后以新合成的負(fù)鏈RNA為模板合成正鏈RNA。3'-UTR是豬瘟病毒基因組的第一調(diào)控位點(diǎn)，5'-UTR是豬瘟病毒以新合成的負(fù)鏈RNA為模板合成正鏈RNA時(shí)的重要調(diào)控位點(diǎn)，此外，5'-UTR還是豬瘟病毒基因翻譯的主要調(diào)控位點(diǎn)。5'-UTR和3'-UTR中各存在一段17個(gè)堿基的區(qū)域，除了四個(gè)堿基錯(cuò)配外，其余彼此完全互補(bǔ)配對(duì)，這兩個(gè)區(qū)域可能參與基因組的環(huán)化。依賴RNA的RNA聚合酶與正鏈RNA的3'-UTR的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合后，不需要引物的作用，以正鏈RNA為模板合成負(fù)鏈RNA。在依賴RNA的RNA聚合酶接觸到位于5'-UTR內(nèi)的復(fù)制起始識(shí)別單位的同時(shí)，就為合成第2條鏈做構(gòu)象上的準(zhǔn)備。依賴RNA的RNA聚合酶在到達(dá)5'終端時(shí)，由于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的作用，繼續(xù)延長正在合成的RNA鏈。然后以負(fù)鏈RNA為模板通過copy-back的機(jī)制合成正鏈RNA，連接處的單鏈部分后來被水解。在BVDV的NS5B蛋白試驗(yàn)中證明了核苷酸轉(zhuǎn)移酶活性，同時(shí)，試驗(yàn)中復(fù)制產(chǎn)物的雙價(jià)RNA遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于模板的雙價(jià)RNA，也為證明copy-back機(jī)制的存在提供依據(jù)[4]。

1.5 致病機(jī)理 豬瘟病毒可以感染豬的許多器官，如腦、腎、舌、扁桃體、淋巴結(jié)等器官和腺體均能夠檢測(cè)到豬瘟病毒。

豬瘟病毒感染豬只后能夠引起豬只產(chǎn)生免疫抑制，能夠引起白細(xì)胞的減少特別是淋巴細(xì)胞的減少。這是由于豬瘟病毒對(duì)豬淋巴組織、血液、回腸等組織具有親嗜性，在易感豬只感染豬瘟病毒時(shí)，豬瘟病毒首先進(jìn)入豬的扁桃體、扁桃體外周淋巴結(jié)的上皮細(xì)胞和B濾泡，并在其內(nèi)復(fù)制。急性豬瘟一般導(dǎo)致死亡的原因之一就是豬只感染豬瘟病毒后自身的免疫系統(tǒng)被破壞。

人工給豬只接種豬瘟強(qiáng)毒后發(fā)現(xiàn)，豬瘟病毒能夠引起αβ-TCR+T細(xì)胞、γδ-TCR+T細(xì)胞的缺失。此外，豬瘟病毒能夠?qū)е滤拗鱐淋巴細(xì)胞的增殖能力明顯降低和B細(xì)胞的急劇減少。有研究表明，宿主感染豬瘟病毒后自身淋巴細(xì)胞的減少激活了細(xì)胞程序性死亡[5]。

2 豬瘟的診斷與防控

目前，豬瘟的診斷主要有臨床綜合診斷和實(shí)驗(yàn)室診斷。臨床診斷主要通過豬瘟的臨床癥狀、解剖后的病理變化以及流行病學(xué)調(diào)查等幾方面進(jìn)行綜合考慮后進(jìn)行斷定。由于豬病越來越復(fù)雜，豬病的發(fā)生往往不是單一的而是多種疾病并發(fā)。所以，臨床診斷存在一定的困難，要確診一般依靠實(shí)驗(yàn)室診斷。

2.1 實(shí)驗(yàn)室診斷 目前，我國進(jìn)行豬瘟的實(shí)驗(yàn)室確診方法主要有以下幾種。

2.1 .1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） ELISA發(fā)展到今天，產(chǎn)生了許多種方法，如間接法、雙抗體夾心法。需要指出的是，我國普遍用兔化弱毒苗進(jìn)行強(qiáng)制免疫，豬血清中幾乎都有豬瘟抗體，這給豬瘟抗體的檢測(cè)帶來一定的困難。

2.1 .2 免疫熒光（IFA） IFA有直接和間接兩種。用免疫熒光實(shí)驗(yàn)診斷豬瘟最大的優(yōu)點(diǎn)就是能夠檢測(cè)到帶有豬瘟強(qiáng)毒的隱性豬，這對(duì)豬場進(jìn)行豬瘟的凈化具有重要的意義。

2.1 .3 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) （AGPT） 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)有單向和雙向兩類，它的特點(diǎn)是操作簡單，易于判定可測(cè)抗原或抗體。但敏感度低。

2.1 .4 兔體交互免疫試驗(yàn) 兔體交互免疫試驗(yàn)專門用于檢測(cè)豬瘟病毒，它能準(zhǔn)確可靠檢測(cè)出送檢病料中是否存在豬瘟病毒或者兔化弱毒，而且該實(shí)驗(yàn)方法對(duì)技術(shù)、實(shí)驗(yàn)設(shè)備等都要求不高。

2.1 .5 病毒學(xué)診斷 主要檢測(cè)在組織中或組織細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒。將病毒分離培養(yǎng)后，進(jìn)行免疫酶染或免疫熒光染色，鏡檢。

2.2 防治 目前尚無針對(duì)豬瘟的特效藥物，主要采取以預(yù)防為主、治療為輔的綜合性防治措施。根據(jù)我國有關(guān)法律法規(guī)，發(fā)生豬瘟并確診后應(yīng)對(duì)疫點(diǎn)進(jìn)行全部撲殺和無害化處理。但結(jié)合我國國情和養(yǎng)豬業(yè)特點(diǎn)，顯然不可能達(dá)到消滅和控制豬瘟病毒的目的。在我國現(xiàn)階段，主要采取加強(qiáng)科學(xué)的飼養(yǎng)管理、因地制宜結(jié)合自身情況制定個(gè)性化的免疫程序、建立免疫監(jiān)測(cè)淘汰感染豬逐步凈化豬群、盡量做到自繁自養(yǎng)實(shí)行“全進(jìn)全出”的飼養(yǎng)模式、截?cái)鄠魅驹础⒍ㄆ诤侠硐炯盁o害化處理等相結(jié)合的綜合防控措施。

3 存在問題

3.1 現(xiàn)場診斷困難 近年來，由于豬病越來越復(fù)雜和許多類似豬瘟臨床癥狀的出現(xiàn)，加上豬瘟病毒毒力發(fā)生變化使得豬瘟越來越不好被診斷。要確診是否被豬瘟病毒感染越來越依賴于實(shí)驗(yàn)室診斷，但實(shí)驗(yàn)室診斷需要具備一定的條件和設(shè)備，具有一定的局限性，目前也還未有現(xiàn)場就可以操作進(jìn)行確診豬瘟的辦法。

3.2 豬瘟疫苗本身無法消滅豬瘟 不可否認(rèn)，現(xiàn)在廣泛使用的三大品系豬瘟弱毒疫苗（中國的C2株、法國的Thiverval株和日本的CPE2株）對(duì)控制豬瘟發(fā)揮了巨大的作用[6]。疫苗的使用，只是對(duì)機(jī)體產(chǎn)生防護(hù)層，只能降低豬瘟病毒的循環(huán)力度和傳播范圍，豬瘟疫苗本身是無法消滅豬瘟病毒的。而且致弱疫苗本身也存在基因突變或與野毒發(fā)生重組而造成毒力逆強(qiáng)的機(jī)率，同時(shí)豬瘟野毒仍然存在并以低水平在傳播。

亞單位疫苗應(yīng)用的先決條件是需要一個(gè)高效的表達(dá)系統(tǒng)。因?yàn)橹挥凶銐蛄靠乖嬖跁r(shí)才能誘導(dǎo)出保護(hù)性的免疫應(yīng)答反應(yīng)。但是現(xiàn)在能夠高表達(dá)的亞單位疫苗很少[7]。

3.3 傳統(tǒng)的飼養(yǎng)方式不利消滅豬瘟 我國養(yǎng)豬業(yè)的特點(diǎn)是規(guī)?；?、散養(yǎng)戶多。散養(yǎng)戶的豬只感染豬瘟后，往往沒有進(jìn)行科學(xué)的處理，導(dǎo)致成為持續(xù)的傳染源。而且這些散養(yǎng)戶在飼養(yǎng)的同時(shí)往往也配合泔水飼喂，而泔水往往攜帶豬瘟病毒。

3.4 免疫監(jiān)測(cè)和早期預(yù)警困難 免疫后不管不問是消滅豬瘟病毒的主要障礙之一，我國還未有科學(xué)的免疫監(jiān)測(cè)方法，使得疫苗注射和免疫監(jiān)測(cè)嚴(yán)重脫鉤。目前，也尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)豬瘟進(jìn)行早期預(yù)警行之有效的方法，我國也未有相關(guān)機(jī)構(gòu)或個(gè)人對(duì)豬瘟早期預(yù)警工作進(jìn)行深入系統(tǒng)的研究。

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