過氧化氫誘導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型的建立

常小潔 郭奇桑 李笑天

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科 上海 200011)

過氧化氫誘導(dǎo)人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型的建立

常小潔 郭奇桑 李笑天△

(復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院產(chǎn)科 上海 200011)

目的通過研究不同濃度過氧化氫(H2O2)作用不同時(shí)間對人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激水平的影響,確定建立滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的條件。方法將HTR-8/SVneo用不同濃度(125、250、500μmol/L)H2O2分別處理不同時(shí)間(1、2、4、24 h)后,采用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率；流式細(xì)胞術(shù)分析檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平以及細(xì)胞凋亡情況；紫外分光光度法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性以及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量。結(jié)果隨H2O2濃度增加及作用時(shí)間延長,HTR-8/SVneo細(xì)胞存活率逐漸下降,細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子含量及細(xì)胞凋亡率不斷增加,細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性逐漸降低、LDH含量不斷升高。其中在250μmol/L H2O2作用4 h條件下,SOD活性明顯低于對照組(P＜0.05),細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平及細(xì)胞凋亡率較對照組均顯著增加(P＜0.05),但LDH漏出量無明顯增多(P＞0.05),且該條件下細(xì)胞有較高的存活率(85.13%)。結(jié)論建立人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型的最適條件為250μmol/L H2O2作用4 h。

胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞； HTR-8/SVneo； 過氧化氫(H2O2)； 氧化應(yīng)激； 增殖； 凋亡

氧化應(yīng)激(oxidative stress)是指細(xì)胞內(nèi)氧化和抗氧化系統(tǒng)失衡,導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)自由基產(chǎn)生速率大于清除速率,從而引起細(xì)胞和組織損傷的一種病理狀態(tài)。氧化損傷主要包括生物膜脂質(zhì)過氧化、細(xì)胞內(nèi)蛋白及酶變性、DNA損害,最后導(dǎo)致細(xì)胞死亡或凋亡,并引發(fā)疾?。?］。正常妊娠過程中,機(jī)體的氧化和抗氧化作用保持相對平衡,不會發(fā)生氧化應(yīng)激［2-3］。當(dāng)胎盤缺血缺氧時(shí),胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,產(chǎn)生大量ROS,超過上述抗氧化系統(tǒng)代償能力,從而引起胎盤功能障礙。目前認(rèn)為氧化應(yīng)激在子癇前期、胎兒宮內(nèi)窘迫、胎兒宮內(nèi)生長受限、流產(chǎn)等妊娠疾病的發(fā)病中起重要作用［4-8］。因此構(gòu)建人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型非常重要。

過氧化氫(H2O2)是一種重要的活性氧,極易透過細(xì)胞膜,與細(xì)胞內(nèi)鐵離子通過Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基,導(dǎo)致一系列反應(yīng),其易于獲得,性質(zhì)相對穩(wěn)定,已成為國內(nèi)外研究細(xì)胞氧化損傷的重要工具［9-11］。本研究以人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/ SVneo為研究對象,利用不同濃度H2O2作用不同時(shí)間,通過檢測細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞內(nèi)超氧陰離子含量及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性和LDH含量等指標(biāo),確定構(gòu)建人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/SVneo氧化應(yīng)激模型的最佳條件。

材料和方法

材料人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞株HTR-8/SVneo由加拿大多倫多大學(xué)Graham教授惠贈；H2O2購自美國Sigma-Aldrich公司；CCK-8細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒購自日本株式會社上海同仁化學(xué)研究所；超氧化物歧化酶(SOD)測試盒、乳酸脫氫酶(LDH)測試盒購自南京建成生物工程研究所；超氧化物陰離子熒光探針(Dihydroethidium,DHE)購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所；Alexa FluorR488 Annexin V/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自美國Invitrogen公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清和0.25%胰酶均購自美國Gibco公司。

CCK-8法檢測細(xì)胞存活率取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo,以每孔5×103個(gè)接種于96孔板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,實(shí)驗(yàn)組分別給予不同終濃度的H2O2(125、250、500 μmol/L),同時(shí)設(shè)立對照組,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔。相同條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、24 h后,吸棄培液,PBS洗2遍,加入提前配制好的CCK-8工作液110μL(CCK-8與培養(yǎng)基體積比為1∶10),置于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h,在自動酶標(biāo)儀上檢測450 nm波長處各孔吸光度(D)值。按下述公式計(jì)算細(xì)胞存活率：存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組D/對照組D) ×100%。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平

取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo,以每孔5×104個(gè)接種于12孔板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,實(shí)驗(yàn)組分別給予不同終濃度的H2O2(125、250、500μmol/L),同時(shí)設(shè)立對照組,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。相同條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、24 h后,用不含EDTA的0.25%胰酶消化,收集細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm),PBS洗2遍,用1 mL DHE(5μmol/L)重懸,37℃避光孵育30 min, 1 000 r/min離心5 min(離心半徑10 cm),PBS洗2遍,用300μL PBS重懸,用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。結(jié)

果用平均熒光強(qiáng)度(mean fluorescence intensity,MFI)及MFI Fold of control表示(即實(shí)驗(yàn)組MFI/對照組MFI)。

流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo,以每孔1×105個(gè)接種于6孔板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,實(shí)驗(yàn)組分別給予不同終濃度的H2O2(125、250、500μmol/ L),同時(shí)設(shè)立對照組,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。相同條件分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、24 h后,用不含EDTA的0.25%胰酶消化,收集細(xì)胞,1 000 r/min離心5 min,冰PBS洗2遍,用100μL 1×結(jié)合緩沖液重懸,分別加入2.5μL Annexin V-FITC和1μL PI,混勻,室溫(25℃)避光孵育15 min,加入200μL 1 ×結(jié)合緩沖液,樣品置冰上,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性及LDH含量取對數(shù)生長期的HTR-8/SVneo,以每孔2.5×104個(gè)加于24孔板中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,實(shí)驗(yàn)組分別給予不同終濃度的H2O2(125、250、500μmol/L),同時(shí)設(shè)立對照組,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。相同條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)1、2、4、24 h后,按試劑盒說明書分別檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性及LDH含量。

倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變?nèi)?shù)生長期的HTR-8/SVneo,以每孔1×105個(gè)接種于6孔板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后,實(shí)驗(yàn)組分別給予不同終濃度的H2O2(125、250、500μmol/L),同時(shí)設(shè)立對照組。相同條件下分別繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,PBS洗2遍,立即于倒置相差顯微鏡下,以同樣倍數(shù)(10×)觀察細(xì)胞形態(tài)改變并拍照。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析,數(shù)據(jù)以x—±s表示,多組比較用單因素方差分析,兩兩比較采用最小顯著差異(LSD)法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

CCK-8法檢測H2O2對HTR-8/SVneo細(xì)胞存活率的影響從圖1可以看出,125、250μmol/L H2O2對HTR-8/SVneo細(xì)胞增殖的抑制作用不明顯,細(xì)胞存活率均在80%以上。其中250μmol/L H2O2作用4 h的細(xì)胞存活率為85.13%；125μmol/L H2O2作用4、24 h的細(xì)胞存活率＞100%,但其D均值較對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。500 μmol/L H2O2對HTR-8/SVneo細(xì)胞殺傷性較大,細(xì)胞存活率明顯下降,且呈現(xiàn)出時(shí)間依賴性。

H2O2對HTR-8/SVneo細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平的影響對照組在不同時(shí)間點(diǎn)的MFI值基本相同,取平均值后對照組MFI為83.54。結(jié)果顯示,H2O2對細(xì)胞MFI水平的影響呈現(xiàn)出明顯的濃度和時(shí)間依賴性。與對照組比較,只有125μmol/L H2O2作用1、2 h細(xì)胞MFI無顯著升高(P＞0.05)；250μmol/L H2O2作用4 h細(xì)胞MFI為103.66,明顯高于對照組(P＜0.05),說明細(xì)胞內(nèi)ROS生成增多,細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激。500μmol/L H2O2作用24 h造成大部分細(xì)胞死亡,無法進(jìn)行流式檢測,故數(shù)據(jù)缺如(圖2A、B)。

H2O2對HTR-8/SVneo細(xì)胞凋亡的影響由圖3A、B可見,與對照組比較,125μmol/L H2O2作用1、2、4 h引起的細(xì)胞凋亡率只有輕度增加(P＞0.05),其中2 h和4 h凋亡率較1 h不僅沒有升高反而有所下降,但三者之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1 h vs.2 h,P=0.071；1 h vs.4 h,P=0.315；2 h vs. 4 h,P=0.387)。隨作用時(shí)間延長,250μmol/L H2O2處理組的細(xì)胞凋亡率不斷增加,其中250 μmol/L H2O2作用4 h的細(xì)胞凋亡率為7.72%。由圖2A/C-2可以看出,500μmol/L H2O2作用4 h引起的HTR-8/SVneo早期凋亡率只有2.37%,但晚期凋亡+壞死率高達(dá)39.44%,說明該處理對細(xì)胞損傷較大,導(dǎo)致細(xì)胞壞死。隨500μmol/L H2O2作用時(shí)間延長,大部分細(xì)胞壞死漂浮在培養(yǎng)上清液中,無法進(jìn)行凋亡檢測,故500μmol/L H2O2組只檢測了作用1、4 h的細(xì)胞凋亡情況。

H2O2對HTR-8/SVneo細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性及LDH含量的影響如圖4A所示,與對照組和125μmol/L H2O2處理組相比,250和500 μmol/L H2O2明顯降低了細(xì)胞培養(yǎng)上清液中SOD活性(P＜0.05)；與對照組相比,125μmol/L H2O2作用2、4 h未引起SOD活性顯著下降,其中4 h組SOD活性反而升高,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P= 0.22)。如圖4B所示,當(dāng)H2O2作用2 h時(shí),雖然組間存在差異(F=4.617,P=0.037),但與對照組相比,各處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量均無明顯變化(P＞0.05)。當(dāng)H2O2作用4 h時(shí),125 μmol/L處理組LDH含量明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；500μmol/L處理組LDH含量則顯著升高(P＜0.05),而250μmol/L處理組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中LDH含量升高仍不明顯(P=0.067),說明250μmol/L H2O2作用4 h對細(xì)胞膜的損傷較小。

細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變由圖5可見,對照組HTR-8/SVneo細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)正常、細(xì)胞輪廓清晰；125μmol/L H2O2處理組細(xì)胞形態(tài)無明顯改變；250和500μmol/L H2O2處理組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯改變,細(xì)胞皺縮、間隙增寬、體積縮小,有些呈片狀壞死脫落,存活細(xì)胞相應(yīng)減少。

討 論

氧化應(yīng)激反映了細(xì)胞內(nèi)ROS生成和清除的不平衡狀態(tài)。生理狀態(tài)下,ROS產(chǎn)生的毒性能夠被抗氧化酶如SOD、谷胱甘肽過氧化物酶(GHPx)、過氧化氫酶及其他非酶類抗氧化物質(zhì)清除。一旦ROS生成超過清除速率時(shí),細(xì)胞就會發(fā)生氧化損傷。研究表明,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激參與多種妊娠疾病的發(fā)生,包括流產(chǎn)、子癇前期、胎兒生長受限等［7,12］。因此建立胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激模型有重要意義。

SOD是機(jī)體抗氧化損傷防御體系中最重要的抗氧化酶之一,具有抗自由基損傷作用。在病理狀態(tài)下,機(jī)體抗氧化能力不同程度增強(qiáng),表現(xiàn)為SOD活性代償性增高；當(dāng)自由基大量產(chǎn)生時(shí),SOD被大量消耗而合成發(fā)生障礙,導(dǎo)致其水平下降且活性受到抑制,因而檢測SOD活性可反映機(jī)體清除氧自由基的能力。LDH在氧化應(yīng)激致細(xì)胞膜受損時(shí)漏到細(xì)胞外的上清液中,因此細(xì)胞上清液中LDH含量越高,說明細(xì)胞氧化損傷越嚴(yán)重。DHE被細(xì)胞攝入后,在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生溴化乙錠,后者與RNA或DNA結(jié)合產(chǎn)生紅色熒光,熒光強(qiáng)度反映了細(xì)胞內(nèi)ROS水平,是細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激的直接標(biāo)志。細(xì)胞凋亡率也是反映細(xì)胞氧化損傷程度的重要指標(biāo),但當(dāng)氧化損傷非常嚴(yán)重時(shí),細(xì)胞不發(fā)生凋亡而是直接壞死［13］。本實(shí)驗(yàn)中,500μmol/L H2O2作用4 h時(shí),細(xì)胞早期凋亡率僅為2.37%,反而低于較低濃度H2O2組,但細(xì)胞壞死率高達(dá)39.44%,亦證明了細(xì)胞凋亡率高低與氧化損傷嚴(yán)重程度并非完全正相關(guān)。

H2O2是目前建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型最常用的物質(zhì),已被廣泛應(yīng)用于各個(gè)領(lǐng)域的研究［10-11,14-15］。本研究使用H2O2成功誘導(dǎo)HTR-8/SVneo細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激,從整體趨勢來看,隨H2O2濃度增加、作用時(shí)間延長,細(xì)胞存活率及SOD活性逐漸降低, LDH漏出量及細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子等活性氧物質(zhì)逐漸增加,細(xì)胞凋亡及壞死率亦不斷增加,提示細(xì)胞氧化應(yīng)激程度及損傷程度不斷加劇。此外本研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)125μmol/L H2O2作用時(shí)間延長至4 h時(shí),抑制細(xì)胞增殖的作用反而變得不明顯,SOD活性也有所增強(qiáng)。推測這是細(xì)胞內(nèi)氧化-抗氧化平衡系統(tǒng)中的抗氧化物質(zhì)生成增加并逐漸占據(jù)主導(dǎo)作用的結(jié)果,該現(xiàn)象及其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。目前已有研究表明,較低程度的氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化可以通過不同機(jī)制促進(jìn)細(xì)胞增殖［16］。綜上所述,考慮選用250μmol/L H2O2作用4 h作為建立HTR-8/ SVneo細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的條件。該條件下,細(xì)胞內(nèi)超氧化物陰離子水平及細(xì)胞凋亡率顯著增加(P＜0.05),SOD活性亦明顯降低(P＜0.05),說明細(xì)胞發(fā)生了一定程度氧化應(yīng)激。同時(shí),LDH漏出量無明顯增多(P＞0.05),表明細(xì)胞膜損傷不嚴(yán)重；且該條件下細(xì)胞有較高的存活率(85.13%),便于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

由于獲得和培養(yǎng)胎盤原代滋養(yǎng)細(xì)胞比較困難,并且在分離和短期應(yīng)用中,細(xì)胞功能可發(fā)生一些潛在的變化,因此原代滋養(yǎng)細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用受到限制。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用的人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞系HTR-8/ SVneo是最接近于原代滋養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞系。既往有研究發(fā)現(xiàn)原代細(xì)胞和HTR-8/SVneo細(xì)胞系對H2O2的反應(yīng)有一定差異［17］。因此,用HTR-8/ SVneo細(xì)胞系代替原代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)仍存在一定局限性。

綜上所述,本研究使用H2O2成功誘導(dǎo)HTR-8/ SVneo細(xì)胞發(fā)生了氧化應(yīng)激,并且確立250μmol/L H2O2作用4 h是建立人胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞HTR-8/ SVneo氧化應(yīng)激模型的最佳條件。該模型能夠進(jìn)一步應(yīng)用于胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究,有望在子癇前期、流產(chǎn)、胎兒生長受限等妊娠疾病的發(fā)病機(jī)制和治療方法研究方面作出貢獻(xiàn)。

［1］ Burton GJ,Jauniaux E.Oxidative stress［J］.Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol,2011,25(3)：287-299.

［2］ Lunghi L,Ferretti ME,Medici S,et al.Control of human trophoblast function［J］.Reprod Biol Endocrinol, 2007,5：6.

［3］ Poston L,Igosheva N,Mistry HD,et al.Role of oxidative stress and antioxidant supplementation in pregnancy disorders［J］.Am J Clin Nutr,2011,94(6)：1980S -1985S.

［4］ Hansen JM.Oxidative stress as a mechanism of teratogenesis［J］.Birth Defects Res C Embryo Today, 2006,78(4)：293-307.

［5］ Wells PG,Mccallum GP,Chen CS,et al.Oxidative stress in developmental origins of disease：teratogenesis, neurodevelopmental deficits,and cancer［J］.Toxicol Sci, 2009,108(1)：4-18.

［6］ Burton GJ,Jauniaux E.Placental oxidative stress：from miscarriage to preeclampsia［J］.J Soc Gynecol Investig, 2004,11(6)：342-352.

［7］ Harma M,Harma M,Erel O.Oxidative stress in women with preeclampsia［J］.Am J Obstet Gynecol,2005,192 (2)：656-657.

［8］ Fujimaki A,Watanabe K,Mori T,et al.Placental oxidative DNA damage and its repair in preeclamptic women with fetal growth restriction［J］.Placenta,2011, 32(5)：367-372.

［9］ 張斌,夏作理,趙曉民,等.氧化應(yīng)激模型的建立及其評價(jià)［J］.中國臨床康復(fù),2006,10(44)：112-114.

［10］ Chen T,Guo ZP,Jiao XY,et al.Protective effects of peoniflorin against hydrogen peroxide-induced oxidative stress in human umbilical vein endothelial cells［J］.Can J Physiol Pharmacol,2011,89(6)：445-453.

［11］ Park KJ,Kim YJ,Kim J,et al.Protective effects of peroxiredoxin on hydrogen peroxide induced oxidative stress and apoptosis in cardiomyocytes［J］.Korean Circ J, 2012,42(1)：23-32.

［12］ Gupta S,Agarwal A,Banerjee J,et al.The role of oxidative stress in spontaneous abortion and recurrent pregnancy loss：a systematic review［J］.Obstet Gynecol Surv,2007,62(5)：335-347.

［13］ Baigi MG,Brault L,Neguesque A,et al.Apoptosis/ necrosis switch in two different cancer cell lines：influence of benzoquinone-and hydrogen peroxide-induced oxidative stress intensity,and glutathione［J］.Toxicol In Vitro, 2008,22(6)：1547-1554.

［14］ Abd MN,Mohamed N,Shuid AN.Effects of low-dose versus high-dose gamma-tocotrienol on the bone cells exposed to the hydrogen peroxide-induced oxidative stress and apoptosis［J］.Evid Based Complement Alternat Med, 2012：680834.

［15］ Lee JH,Lee JS,Kim Y R,et al.Hispidin isolated from Phellinus linteus protects against hydrogen peroxideinduced oxidative stress in pancreatic MIN6N beta-cells［J］.J Med Food,2011,14(11)：1431-1438.

［16］ Galli A,Svegliati-Baroni G,Ceni E,et al.Oxidative stress stimulates proliferation and invasiveness of hepatic stellate cells via a MMP2-mediated mechanism［J］.Hepatology, 2005,41(5)：1074-1084.

［17］ Liu L,Xie H,Chen X,et al.Differential response of normal human epidermal keratinocytes and HaCa T cells to hydrogen peroxide-induced oxidative stress［J］.Clin Exp Dermatol,2012,37(7)：772-780.

Establishment of hydrogen peroxide-induced oxidative stress model in HTR-8/SVneo cells

CHANG Xiao-jie,GUO Qi-sang,LI Xiao-tian△
(Department of Obstetrics,Obstetrics and Gynecology Hospital,Fudan University,Shanghai 200011,China)

Objective To establish the oxidative stress model of human trophoblast cells by studying the effects of hydrogen peroxide(H2O2)on the cell line HTR-8/SVneo.MethodsHTR-8/SVneo cells were treated with different concentrations(125,250,500μmol/L)of H2O2for different time(1, 2,4,24 hours).Cell viability was measured by CCK-8 assay.Superoxide dismutase(SOD)activity and lactate dehydrogenase(LDH)leakage in cell culture supernatant were detected by ultraviolet spectrophotometry.Intracellular superoxide anion and apoptosis proportion were measured by flow cytometry.ResultsFollowing the increasing of H2O2concentration and the lengthening of the action time,cell viability and SOD activity decreased.Meanwhile,LDH leakage,apoptosis proportion andintracellular superoxide anion production increased.When treated with 250μmol/L H2O2for 4 hours, SOD activity significantly decreased(P＜0.05),apoptosis proportion and intracellular superoxide anion production significantly increased compared with the control group(P＜0.05).However,the increase of LDH leakage was not that significant(P＞0.05),and cell viability could reach to 85.13%in the above-mentioned condition.ConclusionsThe most appropriate condition of establishing the oxidative stress model of HTR-8/SVneo is treatment with 250μmol/L H2O2for 4 hours.

human trophoblastic cells； HTR-8/SVneo； hydrogen peroxide(H2O2)； oxidative stress； proliferation； apoptosis

R 71

A

10.3969/j.issn.1672-8467.2014.01.007

2013-03-02；編輯：張秀峰)

國家自然科學(xué)基金(81000278)

△Corresponding author E-mail：xiaotianli555@163.com

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81000278).