PM 10暴露誘導(dǎo)大鼠心肌損傷效應(yīng)研究

苗娟娟，桑楠

（山西大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，山西 太原 030006）

0 引言

近年來，隨著工業(yè)化的快速推進(jìn)，燃料燃燒、交通運(yùn)輸、房屋建設(shè)和冶金煉鋼等帶來了嚴(yán)重的大氣顆粒物污染。而大氣可吸入顆粒物（PM10）是空氣動力學(xué)直徑≤10μm的顆粒物，也是懸浮顆粒物中對環(huán)境和人類健康危害最大的一類。2010年中國環(huán)境公報(bào)顯示［1］，環(huán)境保護(hù)重點(diǎn)城市總體平均的可吸入顆粒物濃度與上年相比仍有上升。2012年聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署發(fā)布的《全球環(huán)境展望5》［2］中顯示每年室外空氣顆粒物污染可導(dǎo)致大約370萬人死亡。因此，大氣可吸入顆粒物污染所引發(fā)的健康問題不容忽視。

流行病學(xué)研究表明，大氣顆粒物污染不僅會使居民呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生率增高，而且對心血管系統(tǒng)也將產(chǎn)生不良影響。Chang［3］和yang［4］等人的研究表明，大氣污染，尤其是PM10、NO2、CO可以提高心血管疾病的住院率和死亡率。Puett［5］研究證實(shí)慢性顆粒物暴露會增加冠心病的發(fā)病率，而且在中老年以上和已患相關(guān)疾病的人群中表現(xiàn)明顯［6］。

到目前為止，PM10與心血管疾病發(fā)病率增加的相關(guān)性研究主要集中在流行病學(xué)領(lǐng)域，利用實(shí)驗(yàn)動物模型確定效應(yīng)發(fā)生的研究還鮮見報(bào)道。為此本文提出研究不同濃度和不同季節(jié)的PM10染毒對大鼠心臟組織的影響，檢測心臟組織中炎癥相關(guān)因子IL-1β、ICAM -1、COX-2和iNOS以及凋亡相關(guān)因子p53 m RNA水平的表達(dá)變化，旨在探討PM10污染與心肌損傷效應(yīng)之間的相關(guān)性，并為揭示顆粒物季節(jié)的差異可能會誘導(dǎo)機(jī)體不同程度的損傷效應(yīng)提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 PM10采集及其懸濁液的制備

1.1.1 PM10的采集

用TH-150C型智能中流量采樣器（武漢天虹）采集山西大學(xué)生活區(qū)的PM10，流量為100 L／min，每天采樣24 h，采樣時(shí)間為2010-03-15－2011-02-20，同時(shí)記錄采樣前后玻璃纖維濾膜的重量。采集完后，將濾膜密封在鋁箔中，4℃儲藏備用。

1.1.2 PM10懸濁液的制備

將載有顆粒物的濾膜剪成1 cm2的小塊于燒杯中，加入適量的超純水于超聲振蕩器上反復(fù)震蕩30 min，同時(shí)加冰以保證水溫在20℃以下，振蕩結(jié)束后用六層紗布過濾，收集濾液真空冷凍干燥并稱重，在4℃儲存。在實(shí)驗(yàn)前，用生理鹽水將顆粒物配制成濃度分別為0.3、1、3、10 mg／kg bw（body weight）的懸濁液，并超聲振蕩混勻。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物和處理方法

1.2.1 采暖期不同濃度PM10染毒處理

實(shí)驗(yàn)用Wistar成年雄性大鼠30只，體重為180～200 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將實(shí)驗(yàn)用大鼠按體重均分為5組（n＝6），即對照組和不同濃度（0.3、1、3、10 mg／kg bw）PM10處理組，對照組注入生理鹽水，每3天染毒1次，共5次。在最后一次染毒48h后斷頭處死，取大鼠心臟組織，在液氮中快速冰凍，隨后在－80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 不同季節(jié)PM10染毒處理

實(shí)驗(yàn)用Wistar成年雄性大鼠30只，體重為180～200 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。將實(shí)驗(yàn)用大鼠按體重均分為5組（n＝6），即對照組和不同季節(jié)（春、夏、秋和冬）PM10處理組（10 mg／kg bw），對照組注入生理鹽水，每3天染毒1次，共5次。在最后一次染毒48 h后斷頭處死，取大鼠心臟組織，在液氮中快速冰凍，隨后在－80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 檢測方法

1.3.1 蘇木素-伊紅染色（H＆E）

對不同濃度PM10染毒處理后的大鼠心臟組織做蘇木素－伊紅染色（H＆E）觀察。將大鼠斷頭處死后，立即取出心臟組織，在PBS溶解的質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛中固定組織，常規(guī)梯度酒精和二甲苯脫水，用石蠟包埋。組織切成5μm厚的切片常規(guī)脫蠟烘干后，蘇木素染色，蒸餾水洗滌，氨水反藍(lán)30 s，蒸餾水洗滌。伊紅染色3 min，蒸餾水洗滌。脫水，晾干，封片，顯微鏡下觀察。

1.3.2 熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR法

稱取0.1g心臟組織，用TRIzol勻漿提取總RNA，通過測定RNA在260 nm處的吸光度來定量。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Ta KaRa Biotechnology Co.Ltd，Dalian）的操作說明將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，于－20℃保存待用。將反轉(zhuǎn)錄后的cDNA稀釋5倍待用。分別取稀釋5倍后的cDNA樣1μL，再分別加入等量的混合液（2μL PCR Buffer，3.5 mmol／L MgCl2，0.2 mmol／L d NTP），每個引物500 nmol／L，200 nmol／L Taq Man探針和1 U Taq DNA聚合酶）。引物和探針序列如表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

用Origin 7.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-way ANOVA檢驗(yàn)染毒組與對照組的差異顯著性（＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）。

2 結(jié)果與分析

2.1 采暖期不同濃度PM 10暴露誘導(dǎo)大鼠心臟組織病理損傷檢測結(jié)果

如圖1所示，對照組心肌細(xì)胞橫紋清楚，結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞質(zhì)分布均勻；隨著PM10暴露濃度的增加，心肌纖維排列紊亂，心肌間質(zhì)腫脹，間隙變寬，心肌細(xì)胞細(xì)胞核染色質(zhì)邊集，心肌細(xì)胞肌漿溶解出現(xiàn)空泡，局部有炎性細(xì)胞浸潤，部分心肌細(xì)胞凋亡。

2.2 采暖期不同濃度PM10暴露對大鼠心臟組織炎癥和凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響

如圖2A所示，較高濃度（3、10 mg／kg）的PM10暴露可增加iNOS的mRNA表達(dá)水平，在10 mg／kg暴露濃度下達(dá)到對照組的1.66倍（P＜0.01）。如圖2B所示，與對照組相比，大鼠心臟組織中p53 mRNA表達(dá)水平在低濃度PM10暴露時(shí)下降，在高濃度暴露時(shí)上升，而且均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2.3 不同季節(jié)PM10暴露對大鼠心臟組織炎癥相關(guān)因子表達(dá)的影響

由圖3可知，春季PM10暴露下均可上調(diào)炎性相關(guān)因子IL-1β、ICAM-1、COX-2和iNOS的mRNA水平，且IL-1β與對照組相比表現(xiàn)有顯著性差異（P＜0.01）。其余季節(jié)PM10暴露下對各炎性相關(guān)因子的mRNA水平影響不大，COX-2 m RNA水平在冬季PM10暴露下出現(xiàn)顯著上調(diào)（P＜0.01）。

3 討論

大氣顆粒物作為一種復(fù)合污染物，對心臟組織的損傷毒性作用是多途徑、多機(jī)制共同作用的結(jié)果。進(jìn)入呼吸系統(tǒng)的顆粒物可引起肺部和全身的氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)，激活凝血機(jī)制，削弱血管功能和增加動脈硬化。顆粒物還可刺激肺部交感神經(jīng)產(chǎn)生次級神經(jīng)反射，改變自主神經(jīng)反射等機(jī)制引發(fā)心律不齊等［7－8］。顆粒物致毒過程的關(guān)鍵階段均是顆粒物進(jìn)入呼吸道后引發(fā)的機(jī)體氧化應(yīng)激和炎癥［9］。研究表明顆粒物進(jìn)入肺部，可以引起局部氧化應(yīng)激，從而激活核轉(zhuǎn)錄因子（NF-κB）、細(xì)胞因子（IL-6、IL-8）的表達(dá)，引發(fā)全身炎癥反應(yīng)［10－11］。

Fig.1 HE staining of morphological characteristics of sections in rat heart after exposure to different concentrations of PM10（注：400×放大）圖1 不同濃度PM 10暴露誘導(dǎo)大鼠心臟組織病理學(xué)變化

Fig.2 mRNA expression of inflammation and apoptosis related factors in rat heart after exposure to different concentrations of PM10（注：與對照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）圖2 不同濃度PM10暴露下大鼠心臟組織炎癥和凋亡相關(guān)因子mRNA表達(dá)結(jié)果

NO是一種新型的信號分子，又是細(xì)胞毒性分子，可作為自由基同氧自由基相互作用，而導(dǎo)致細(xì)胞的損害，而NOS是NO合成的最主要的限速酶。誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）主要分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞中，在正常狀態(tài)下不起作用，當(dāng)受到多種細(xì)胞因子刺激下，其編碼基因被激活導(dǎo)致其爆發(fā)式催化合成，直至細(xì)胞死亡或者底物耗竭［12－13］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在冬季高濃度PM10暴露條件下，iNOS的表達(dá)明顯增高，由此提示，PM10暴露可能通過刺激呼吸系統(tǒng)產(chǎn)生炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子，提高誘導(dǎo)型iNOS的活性，導(dǎo)致NO的產(chǎn)生，引發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成心臟組織的氧化損傷。

本實(shí)驗(yàn)以采暖期不同濃度PM10暴露染毒處理后，高濃度PM10暴露下iNOS mRNA水平顯著增加，表明高濃度PM10暴露顯著誘導(dǎo)大鼠心臟組織炎癥反應(yīng)的發(fā)生，而對應(yīng)的HE染色觀察結(jié)果與此結(jié)果一致。凋亡相關(guān)因子p53的表達(dá)隨PM10暴露濃度的增加呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢，提示高濃度PM10暴露也可能會伴隨有凋亡反應(yīng)的發(fā)生，但還有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明。

Fig.3 mRNA expression of inflammation related factors in rat heart after exposure to different seasons of PM10（注：與對照組相比，＊P＜0.05，＊＊P＜0.01）圖3 不同季節(jié)PM10暴露下大鼠心臟組織炎癥相關(guān)因子mRNA表達(dá)結(jié)果

有文獻(xiàn)指出，顆粒物的生物效應(yīng)與其自身的粒徑大小、化學(xué)組成、比表面積、來源和濃度等有關(guān)［14］，而進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)不同季節(jié)產(chǎn)生的顆粒物引起的生物效應(yīng)也有差異。在顆粒物誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的發(fā)生中，主要參與的炎癥相關(guān)因子有IL-1β、ICAM-1、COX-2和iNOS。IL-1β作為體內(nèi)炎性因子級聯(lián)反應(yīng)的始動因子，在維持正常機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和致心血管及其他疾病方面發(fā)揮著重要調(diào)節(jié)作用［15－16］，是一種敏感和特異的急性期炎性指標(biāo)，主要由活化的巨噬細(xì)胞產(chǎn)生。ICAM-1屬于黏附分子中免疫球蛋白超家族成員，是炎癥介導(dǎo)物質(zhì)，通過介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞間，細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）之間的相互粘連，促使白細(xì)胞貼壁、外滲、聚集，并增強(qiáng)抗原表達(dá)和淋巴細(xì)胞活化，促進(jìn)炎癥的發(fā)生和發(fā)展。正常情況下，ICAM-1呈低水平表達(dá)，當(dāng)發(fā)生免疫反應(yīng)時(shí)受各種刺激因素影響后表達(dá)上調(diào)，參與各種免疫炎性反應(yīng)。ICAM-1表達(dá)增強(qiáng)對于免疫炎癥反應(yīng)的發(fā)生是必需的［17］。COX-2是炎癥過程中一個重要的誘導(dǎo)酶，誘導(dǎo)產(chǎn)生前列腺素類和自由基等［18］，靜息狀態(tài)下在正常組織中無表達(dá)或者弱表達(dá)，當(dāng)受到細(xì)胞內(nèi)外各種因素的刺激時(shí)，其合成與表達(dá)就會增強(qiáng)。iNOS作為炎性反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，在生理狀態(tài)下不表達(dá)，在病理狀態(tài)下（如缺氧缺血和神經(jīng)損傷后）表達(dá)明顯增加。

由采暖期不同濃度PM10對大鼠染毒處理的實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出，顆粒物的最大效應(yīng)濃度為10 mg／kg。為了進(jìn)一步探討顆粒物毒性的季節(jié)差異，我們使大鼠暴露于春夏秋冬不同季節(jié)（濃度均為10 mg／kg）PM10下，并檢測了心臟中各炎癥因子的表達(dá)。結(jié)果顯示，春季和冬季PM10可以上調(diào)COX-2和iNOS的mRNA表達(dá)，表明春季和冬季PM10誘導(dǎo)了大鼠心臟組織中炎癥反應(yīng)發(fā)生。而其他季節(jié)PM10暴露下，各炎癥因子表達(dá)變化不明顯。上述結(jié)果提示，春季和冬季PM10可能通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)而導(dǎo)致心肌損傷，這種效應(yīng)與顆粒物的季節(jié)有關(guān)。春季位于采暖后期，大氣中顆粒物污染依然十分嚴(yán)重，這可能是造成春季顆粒物產(chǎn)生明顯生物損傷效應(yīng)的重要原因。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，高濃度PM10暴露可顯著誘導(dǎo)大鼠心臟組織炎癥反應(yīng)發(fā)生進(jìn)而造成心肌損傷，而不同季節(jié)PM10暴露造成的損傷效應(yīng)也不同，以春季和冬季的效應(yīng)最明顯，這提示人們采暖期間和采暖后期顆粒物污染嚴(yán)重，應(yīng)注意適當(dāng)防護(hù)。

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