黃河口鄰近水域中華哲水蚤現(xiàn)場(chǎng)食物組成的分子生物學(xué)檢測(cè)＊

黃有松，徐東暉，2，陳洪舉，3，張 寰，4，林森杰，劉光興，3＊＊

（中國(guó)海洋大學(xué)1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；2.海洋環(huán)境學(xué)院；3.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266100；4.Department of Marine Sciences，University of Connecticut，Groton，CT 06340，USA；5.廈門(mén)大學(xué)近海海洋環(huán)境科學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海洋生物多樣性與全球變化實(shí)驗(yàn)室，福建 廈門(mén)361005）

作為海洋生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的后生動(dòng)物以及浮游植物等的主要攝食者，橈足類(lèi)在海洋食物網(wǎng)中具有重要的生態(tài)意義，其攝食對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)具有重要影響[1－2]。準(zhǔn)確測(cè)定自然海區(qū)中橈足類(lèi)的食物組成及攝食率等是定量理解它們與其它海洋生物之間的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系、有害藻華的生消、水體中有機(jī)物的垂直通量以及近海碳循環(huán)等過(guò)程的關(guān)鍵，也是建立可靠生態(tài)動(dòng)力學(xué)模型，提供準(zhǔn)確海洋漁業(yè)預(yù)測(cè)的重要步驟[3]。

中華哲水蚤（Calanussinicus）廣泛分布于西北太平洋陸架海區(qū)，是該水域的特征性橈足類(lèi)[4]，同時(shí)，也是我國(guó)渤、黃、東海等近岸水域浮游動(dòng)物的優(yōu)勢(shì)種和關(guān)鍵種[5－11]。有關(guān)中華哲水蚤的食物組成已有諸多報(bào)道[12－19]，這些關(guān)于中華哲水蚤攝食的研究主要使用培養(yǎng)法、基于色素測(cè)定和鏡檢鑒定的腸道內(nèi)含物分析法以及脂肪酸標(biāo)記物法等，由于種種局限（培養(yǎng)法脫離現(xiàn)場(chǎng)水體環(huán)境，受到瓶頸效應(yīng)影響；色素測(cè)定受限于色素降解，且只能檢測(cè)有色素食物；顯微鏡檢法需要專(zhuān)門(mén)的形態(tài)分類(lèi)知識(shí)，費(fèi)時(shí)耗力，準(zhǔn)確性受樣品形態(tài)影響很大；脂肪酸法受限于其表征食物種類(lèi)時(shí)的不穩(wěn)定性等）[20－21]，所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確度離得知橈足類(lèi)的現(xiàn)場(chǎng)（insitu）攝食食性還相差較遠(yuǎn)。

分子生物學(xué)技術(shù)在研究攝食[22－23]及寄生[24]等營(yíng)養(yǎng)關(guān)系中具有明顯的優(yōu)勢(shì)，可避開(kāi)許多其它方法的缺點(diǎn)和局限。近些年來(lái)，已有學(xué)者開(kāi)始探索將分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于橈足類(lèi)的攝食習(xí)性分析中[20]，并且通過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)證明了分子生物學(xué)方法是研究橈足類(lèi)攝食和水域食物網(wǎng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)傳遞的有效手段[25－26]。本文使用PCR的分子生物學(xué)技術(shù)，以核糖體小亞基基因（18S rDNA）為目標(biāo)序列，通過(guò)非橈足類(lèi)（non－copepod）引物的運(yùn)用，研究了黃河口鄰近水域中華哲水蚤的現(xiàn)場(chǎng)食物組成。本研究期望通過(guò)優(yōu)化橈足類(lèi)攝食的分子生物學(xué)研究方法，為分析橈足類(lèi)的現(xiàn)場(chǎng)食性提供新的認(rèn)識(shí)，并為深入理解橈足類(lèi)在海洋食物網(wǎng)中的作用提供方法支持和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集及現(xiàn)場(chǎng)處理

浮游動(dòng)物樣品于2011年5月在黃河口鄰近水域（37°58′30.20″N，119°33′37.70″E，水深16m）采用淺水Ⅰ型浮游生物網(wǎng)（網(wǎng)口直徑為50cm，篩絹孔徑為0.505 mm）進(jìn)行垂直拖網(wǎng)采得。為避免拖網(wǎng)時(shí)間過(guò)長(zhǎng)以及拖網(wǎng)速度過(guò)快可能造成的誤差（時(shí)間過(guò)長(zhǎng)可能會(huì)使高密度的目標(biāo)橈足類(lèi)在網(wǎng)底管處存在非自然狀態(tài)下的攝食行為，拖網(wǎng)速度過(guò)快可能會(huì)刺激橈足類(lèi)排便）[27]，拖網(wǎng)速度控制在0.5m/s左右。樣品采集后立即使用中性魯哥氏液（Uterm9hl’s solution）[28]固定，并保持魯哥氏液的終濃度為2%。

1.2 中華哲水蚤的室內(nèi)處理

現(xiàn)場(chǎng)固定的浮游動(dòng)物樣品帶回實(shí)驗(yàn)室后，在體視顯微鏡（Lecia，S8APO）下將中華哲水蚤個(gè)體挑出，并置于0.22μm濾膜過(guò)濾的現(xiàn)場(chǎng)海水中（加入中性魯哥氏液，使終濃度為2%）暫存。DNA提取前對(duì)樣品進(jìn)行清洗、去除附肢、鏡檢等處理，以確保在清洗之后中華哲水蚤的體表沒(méi)有其它生物或者碎屑附著。中華哲水蚤個(gè)體在挑選、清洗和去除附肢等DNA提取前處理的過(guò)程中采用無(wú)菌技術(shù)和無(wú)菌操作。

1.3 總基因組DNA的提取

使用 Axygen研磨棒（Fisher Scientific）對(duì)樣品進(jìn)行充分研磨。待樣品研磨至勻漿后加入400μL DNA提取緩沖液[29]（1%SDS，100mmol·L－1EDTA pH 8.0和200μg·mL－1蛋白酶K），55℃溫育2d進(jìn)行細(xì)胞裂解，使用CTAB方法進(jìn)行基因組DNA（以下簡(jiǎn)稱(chēng)DNA）的提取，最終將所獲取的DNA溶解在20～50μL 10mmol/L Tris－Cl（pH 8.0）中，并按照Z(yǔ)hang等報(bào)道的方法對(duì)提取的DNA進(jìn)行純化[29]，獲取的DNA提取儲(chǔ)存于－20℃。

1.4 PCR擴(kuò)增與基因克隆

為了得到橈足類(lèi)以外的盡可能多的其它真核生物（潛在食物）類(lèi)群的序列，本實(shí)驗(yàn)使用18Snon－copepod引物（18Snon－copepod F2 和 non－copepod R2）（見(jiàn)表1）對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25μL反應(yīng)體系包含2.5μL 10× PCR Buffer（含 Mg2＋），2μL 20mmol/L的dNTPs，5μmol/L的正反向引物各0.5，0.2μL的ExTaq酶（Takara），1μL的DNA模板。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性60s；94℃變性30s，68℃退火和延伸70s，10個(gè)循環(huán)；94℃變性15s，58℃退火30s，72℃延伸40s，25個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

表1 本研究中所使用的引物序列Table 1 Information of primer sequences used in this study

另外，使用真核生物通用引物18ScomF1和comR1（見(jiàn)表1）對(duì)中華哲水蚤基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，獲取中華哲水蚤18SrDNA序列，擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性1min；95℃變性20s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min。

PCR產(chǎn)物使用 Agarose Gel DNA Purification Kit v2.0（Takara）進(jìn)行純化?；厥蘸筮M(jìn)行PCR產(chǎn)物末端加A、連接、轉(zhuǎn)化、培養(yǎng)、藍(lán)白斑篩選、質(zhì)粒DNA提取與酶切等一系列基因克隆過(guò)程，具體方法與步驟參見(jiàn)[30]。隨機(jī)挑選一定數(shù)目的陽(yáng)性克隆進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 序列比對(duì)和分析

對(duì)所獲原始序列進(jìn)行手動(dòng)檢查，并去掉載體和引物序列，得到引物真正擴(kuò)增出的序列。基于BLAST[31]在NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找同源序列信息。使用Clustal X v2.1[32]將所匹配到的最相似序列（代表最佳匹配類(lèi)群或種類(lèi)）與實(shí)驗(yàn)所獲取序列進(jìn)行比對(duì)，然后使用 MEGA 5.0[33]構(gòu)建鄰接樹(shù)（Neighbor Joining tree，N－J tree）。所用核苷酸替代模型為 Kimura 2－parameter模型，Gamma值由jModelTest[34]計(jì)算獲得。自舉值（Bootstrap value）為1 000，其它參數(shù)設(shè)置均為默認(rèn)值。

另外，基于NCBI的分類(lèi)瀏覽器命名法（Taxonomy Browser nomenclature），以所獲取序列BLAST時(shí)匹配到的前幾條（一般為5條左右）序列為基準(zhǔn)，對(duì)每條BLAST時(shí)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中最佳匹配序列的相似性大于94%的序列推定了其所能確定到的最低分類(lèi)階元。

2 研究結(jié)果

2.1 中華哲水蚤的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)中華哲水蚤除進(jìn)行形態(tài)鑒定以外，使用真核生物核糖體小亞基通用引物（18ScomF1和comR1）擴(kuò)增其DNA。所得1.7kb序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已登記的中華哲水蚤序列（GU969174）相似度達(dá)到99%～100%。這也從18SrDNA序列水平上證實(shí)了實(shí)驗(yàn)所用目標(biāo)橈足類(lèi)為中華哲水蚤。

2.2 中華哲水蚤食物18SrDNA序列的擴(kuò)增

使用18Snon－copepod F2和non－copepod R2擴(kuò)增中華哲水蚤現(xiàn)場(chǎng)樣品的總DNA中非中華哲水蚤來(lái)源的DNA（中華哲水蚤的食物等其它種類(lèi)的DNA），所得基因序列豐富多樣，來(lái)源于不同生物類(lèi)群（見(jiàn)表2），表明中華哲水蚤可能有著廣泛的食物譜。

基于18Snon－copepod引物擴(kuò)增出的PCR克隆文庫(kù)共獲取32條序列，其中7條為中華哲水蚤來(lái)源。剩余的25條非中華哲水蚤來(lái)源的序列分屬于硅藻、甲藻、隱藻、綠藻、水螅水母類(lèi)、櫛水母類(lèi)、軟體動(dòng)物和Ichthyosporea等8個(gè)門(mén)類(lèi)。其中，水母類(lèi)（櫛水母類(lèi)、水螅水母類(lèi)）占有顯著優(yōu)勢(shì)地位，各類(lèi)群所占比例見(jiàn)圖1。

表2 2011年5月黃河口鄰近水域中華哲水蚤樣品中擴(kuò)增出的潛在食物Table 2 Taxonomic distribution of potential diets retrieved frominsitufixed Calanussinicus sampled in Yellow River Estuary and adjacent waters in May，2011

圖1 用18Snon－copepod引物擴(kuò)增中華哲水蚤樣品所得非中華哲水蚤來(lái)源序列中各生物類(lèi)群及所占比例Fig.1 Lineages and corresponding proportions of non－Calanussinicus origin 18SrDNA sequences amplified frominsitufixed Calanussinicus

在檢測(cè)出的生物類(lèi)群中，占最優(yōu)勢(shì)地位的是櫛水母類(lèi)（32.0%）。8條櫛水母來(lái)源序列中有5條（YRE－I－15～19）序列可確定的最低分類(lèi)階元為目，屬于櫛水母門(mén)Typhlocoela綱中的球櫛水母目（Cydippida）（相似度為98%～99%），從親緣關(guān)系可以看出（見(jiàn)圖2），這5條序列很可能來(lái)自同一個(gè)屬，甚至是同一種。其余3條櫛水母序列（YRE－I－12～14）與上述5條序列以及GenBank中的已知同源序列相似度較低。其中，序列YRE－I－14的最低分類(lèi)階元可確定到球櫛水母目中的Mertensiidae科，YRE－I－13的最低分類(lèi)階元到櫛水母門(mén)觸手綱（Tentaculata），進(jìn)一步的分類(lèi)階元不能確定，而序列YRE－I－12因與已知序列的相似度較低（90%），故未進(jìn)行最低分類(lèi)階元的推定（見(jiàn)表2）。具有第二優(yōu)勢(shì)的序列來(lái)源于水螅水母類(lèi)，其中3條為水螅水母綱花水母（Anthomedusae）來(lái)源，另外2條來(lái)源于軟水母（Leptomedusae）。樣品中水母類(lèi)（櫛水母類(lèi)和水螅水母類(lèi)）來(lái)源的序列所占比例達(dá)52.0%。

甲藻來(lái)源的5條序列處于第三優(yōu)勢(shì)地位，其中4條（YRE－I－07～10）很可能來(lái)源于寄生性的甲藻Syndiniales（見(jiàn)表2），系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析顯示，它們以較高的自舉值（85）和已知的Syndiniales類(lèi)群聚在一起。其中YRE－I－09與 YRE－I－10可確定的最低分類(lèi)階元到Syndiniales中的Euduboscquella屬（這2條序列與Euduboscquellasp.JN934989 的相似度為 96%）。序列YRE－I－08因與已知序列的相似度較低（93%），故未進(jìn)行可確定的最低分類(lèi)階元的推定。序列YRE－I－07可確定的最低分類(lèi)階元為Syndiniales中的另一個(gè)寄生性類(lèi)群Ichthyodinium屬。第5條甲藻序列（YRE－I－06）可確定的最低分類(lèi)階元為甲藻綱（Dinophyceae），可能來(lái)源于裸甲藻目（Gymnodiniales）中的裸甲藻科（Gymnodiniaceae）。

此外還檢測(cè)到硅藻的序列，占總非中華哲水蚤序列的12.0%，它們均來(lái)源于中心硅藻綱（Coscinodisco－phyceae）海鏈藻目（Thalassiosirales）海鏈藻科（Thalassiosiraceae）海鏈藻屬（Thalassiosira）。剩余4條序列中有2條分別隸屬于綠藻門(mén)（Chlorophyta）石莼綱（Ulvophyceae）石莼目（Ulvales）石莼科（Ulvaceae）石莼屬（Ulva）（與UlvarigidaAJ005414的相似度為99%）和軟體動(dòng)物（與RissoellarissoaformisFJ917214的相似度為85%）。另外的2條序列分別來(lái)源于隱藻和Ichthyosporea，一種介于原生生物和真菌之間的寄生生物。

3 討論

浮游動(dòng)物與其食物之間的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系是海洋生源要素循環(huán)的重要影響因子，理解這類(lèi)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系有助于提高和完善對(duì)生態(tài)系統(tǒng)、氣候和漁業(yè)預(yù)測(cè)及管理模型等的認(rèn)識(shí)[20]。在傳統(tǒng)測(cè)定方法（如解剖法和腸道色素分析法）受到局限時(shí)，分子生物學(xué)手段提供了一個(gè)能夠準(zhǔn)確認(rèn)識(shí)浮游動(dòng)物現(xiàn)場(chǎng)食物組成的新方法。

以往基于鏡檢法的中華哲水蚤攝食研究表明，渤海中華哲水蚤成體[13]和橈足幼體[14]的食物組成類(lèi)似，均是以圓篩藻為代表的硅藻占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，推測(cè)中華哲水蚤為植食性橈足類(lèi)，并且對(duì)圓篩藻表現(xiàn)出明顯的攝食選擇性。也有研究指出，廈門(mén)海域的中華哲水蚤也營(yíng)植食性生活，以硅藻為主要食物，但是對(duì)餌料基本沒(méi)有選擇性攝食[12]。需要注意的是，基于鏡檢的腸道內(nèi)含物分析法常常會(huì)因?yàn)榉椒ū旧砭窒扌裕ɡ纾簣A篩藻具有厚硅質(zhì)外殼，不易消化，更容易殘留在消化道內(nèi)而被檢出，而甲藻等其它類(lèi)群卻因?yàn)闃镒泐?lèi)的消化產(chǎn)生出很多難以辨認(rèn)的殘留，有些種類(lèi)例如纖毛蟲(chóng)等甚至沒(méi)有殘余留下）造成誤差。類(lèi)似情況也發(fā)生在使用掃描電鏡分析中華哲水蚤食物的研究中。雖然通過(guò)可辨認(rèn)的生物成分表明臺(tái)灣東北部海域中華哲水蚤的食物組成是以當(dāng)?shù)馗∮沃参镏械墓柙鍨橹?，但是有很大部分是不可辨認(rèn)的食糜、海雪和浮游植物的殘留[18]。另外，Liu等基于脂肪酸組成研究了膠州灣中華哲水蚤的食物組成，認(rèn)為中華哲水蚤除了浮游植物之外還可能攝食有機(jī)碎屑、細(xì)菌及小型橈足類(lèi)等[19]。

與以往研究中中華哲水蚤攝食食物的種類(lèi)和范圍相比，基于18Snon－copepod引物對(duì)黃河口鄰近水域中華哲水蚤食物的分子生物學(xué)分析檢測(cè)出屬于8個(gè)門(mén)的生物，揭示了多樣化的潛在食物類(lèi)群（見(jiàn)圖2）。這一結(jié)果拓展了對(duì)于中華哲水蚤食物范圍的認(rèn)識(shí)。同時(shí)，多樣化生物類(lèi)群的檢出也顯示出分子生物學(xué)技術(shù)在橈足類(lèi)攝食研究中的強(qiáng)大效用和優(yōu)勢(shì)。

3.1 水母——中華哲水蚤可能的食物類(lèi)群

圖2 黃河口鄰近水域中華哲水蚤現(xiàn)場(chǎng)樣品使用18S通用引物和non－copepod引物所獲取的序列與在GenBank中匹配到的同源序列比對(duì)后構(gòu)建的鄰接樹(shù)（N－J樹(shù)）Fig.2 Neighbor joining tree of 18SrDNA sequences we obtained by 18Snon－copepod primers and their top－h(huán)it sequences from GenBank

基于18Snon－copepod引物的分子生物學(xué)分析檢測(cè)到了包括櫛水母和水螅水母在內(nèi)的水母類(lèi)來(lái)源的序列。其中，櫛水母來(lái)源的序列屬于櫛水母門(mén)中的球櫛水母目（相似度為98%～99%）（見(jiàn)表2）。同步的大面調(diào)查資料顯示，黃河口及其鄰近水域分布的櫛水母僅記錄到球櫛水母目中的球形側(cè)腕水母（Pleurobrachia globosa）一種，在淺水I和淺水II型浮游生物網(wǎng)采集的浮游動(dòng)物樣品中均有發(fā)現(xiàn)[35]。馬喜平和高尚武對(duì)渤海水母類(lèi)的研究表明，渤海有2種櫛水母——球形側(cè)腕水母和兜水母（Bolinopsis）中的瓜水母（Boroecucumis）[36]。作者在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中沒(méi)有檢索到瓜水母的18SrDNA序列信息，這可能是櫛水母來(lái)源的序列匹配的最相近種類(lèi)中沒(méi)有瓜水母的原因。

水螅水母來(lái)源的序列主要屬于花水母和軟水母?；ㄋ负蛙浰甘屈S河口及其鄰近水域[35]和渤海[37]常見(jiàn)的水螅水母，其中，八斑芮氏水母（Rathkeaoctopunctata）和和平水母屬（Eirene）是渤海水母類(lèi)的優(yōu)勢(shì)種屬[36]。特別是八斑芮氏水母，同步的大面積調(diào)查資料顯示，調(diào)查區(qū)域內(nèi)八斑芮氏水母可占到水母總生物量的95%以上[35]。對(duì)渤海水母類(lèi)的研究也表明，八斑芮氏水母的密度在5月份可占到水母類(lèi)總密度的80%以上[38]，且主要出現(xiàn)在萊州灣。由此可見(jiàn)，中華哲水蚤潛在的食物類(lèi)群——水螅水母和櫛水母在調(diào)查時(shí)間和區(qū)域內(nèi)均具有豐富的分布，意味著中華哲水蚤可能和它們有著很高的遭遇率。

一般認(rèn)為，水母是水域生態(tài)系統(tǒng)重要的攝食者，是浮游植物、浮游動(dòng)物、魚(yú)類(lèi)卵和仔稚魚(yú)的主要消費(fèi)者之一。關(guān)于八斑芮氏水母等與橈足類(lèi)的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系研究中皆是八斑芮氏水母攝食橈足類(lèi)的報(bào)道[39－40]。其它種類(lèi)的水母（杯水母（Phialidiumlomae，P.gregarium）、薩氏水母（Sarsiapsinceps）、囊水母（Euphysatentaculata）、半口壯麗水母（Aglaurahemistoma）、海月水母（Aureliaaurita））等的攝食研究中也發(fā)現(xiàn)它們對(duì)橈足類(lèi)的攝食[40－46]，并且有研究指出橈足類(lèi)是某些水母種類(lèi)的主要食物來(lái)源[45]。本文基于分子生物學(xué)技術(shù)的分析在中華哲水蚤的潛在食物類(lèi)群中檢測(cè)出櫛水母類(lèi)和水螅水母類(lèi)，而且這2個(gè)類(lèi)群在所有非中華哲水蚤來(lái)源的生物類(lèi)群中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)地位（52.0%）。除此之外，作者在青島近海的中華哲水蚤（2004年1月和2010年6月）、以及膠州灣的太平洋紡錘水蚤（2010年9月）樣品中均檢出數(shù)量豐富的水母類(lèi)來(lái)源的序列（占潛在食物類(lèi)群18SrDNA文庫(kù)的比例分別為44.4%、41.2%和68.4%）。潛在食物類(lèi)群中水母類(lèi)的普遍檢出和豐富比例意味著中華哲水蚤對(duì)這2類(lèi)水母可能存在很強(qiáng)的攝食作用。

中華哲水蚤是一種雜食性橈足類(lèi)?；谖改c內(nèi)含物電鏡分析的研究表明，其主要攝食以硅藻為主的浮游植物，還有少量的原生動(dòng)物以及細(xì)菌等[18]。另外，基于脂肪酸組成分析的研究表明，中華哲水蚤除主要攝食浮游植物之外，還可能攝食有機(jī)碎屑、細(xì)菌及小型橈足類(lèi)等[19]。盡管如此，以前的研究從未在其動(dòng)物性餌料中發(fā)現(xiàn)水螅水母和櫛水母類(lèi)生物，迄今為止，作者也未發(fā)現(xiàn)有關(guān)浮游橈足類(lèi)對(duì)水母類(lèi)生物攝食的報(bào)道?；跀z食者和食物大小關(guān)系的考慮，作者認(rèn)為中華哲水蚤對(duì)櫛水母和水螅水母類(lèi)中某些種類(lèi)的攝食可能發(fā)生在卵到浮浪幼蟲(chóng)階段。據(jù)此推測(cè)，橈足類(lèi)可能在控制水母暴發(fā)、影響海洋生態(tài)系統(tǒng)平衡中具有重要的潛在作用。

3.2 寄生性甲藻類(lèi)群與中華哲水蚤的關(guān)系

Syndiniales是甲藻中的一大類(lèi)群，其中許多均為寄生性種類(lèi)。它們具有廣泛的宿主，包括其它甲藻、纖毛蟲(chóng)、放射蟲(chóng)、魚(yú)卵以及橈足類(lèi)在內(nèi)的甲殼動(dòng)物等[47－48]。5條甲藻來(lái)源的序列中4條屬于寄生性的Syndiniales，其中3條隸屬于其中的Euduboscquella屬，1條可能來(lái)源于Ichthyodinium屬。作為Syndiniales中的一個(gè)類(lèi)群，Euduboscquella屬的研究較少，在已被描述的種類(lèi)中，多是它們遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究[49]，未見(jiàn)有其與橈足類(lèi)營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的報(bào)道。Ichthyodinium屬則經(jīng)常被發(fā)現(xiàn)寄生于魚(yú)卵的卵黃囊內(nèi)[50]。

有許多生物與橈足類(lèi)形成共生關(guān)系[51]，Syndiniales便是其中一個(gè)類(lèi)群。較傳統(tǒng)方法，分子生物學(xué)方法的使用讓作者發(fā)現(xiàn)了更多與橈足類(lèi)有關(guān)聯(lián)的生物類(lèi)群，這些類(lèi)群可能與橈足類(lèi)形成共生關(guān)系，而與橈足類(lèi)有著復(fù)雜的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系。雖然作者以研究橈足類(lèi)的食物為目的，但認(rèn)為基于序列分析檢出的Syndiniales這2個(gè)屬（Euduboscquella和Ichthyodinium）的種類(lèi)與橈足類(lèi)真實(shí)的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系尚不能判定為簡(jiǎn)單的攝食與被攝食的關(guān)系，而需要借助其他手段進(jìn)行更加深入地研究。

3.3 大型藻類(lèi)在中華哲水蚤食物類(lèi)群中的出現(xiàn)

通常，浮游食物網(wǎng)中有機(jī)物總是從小個(gè)體生物向較大個(gè)體生物依次傳遞，“小個(gè)體”的浮游動(dòng)物對(duì)“大個(gè)體”的大型水生植物攝食的研究報(bào)道相對(duì)較少。曾有研究將大型水生植物Thalassiatestudinum的碎屑作為餌料，在實(shí)驗(yàn)室條件下驗(yàn)證了湯氏紡錘水蚤（Acartia tonsa）對(duì)這種海草碎屑的攝食[52]，但未見(jiàn)自然海區(qū)中有橈足類(lèi)對(duì)大型水生植物攝食的報(bào)道。然而，曾有學(xué)者觀察到并且使用分子生物學(xué)手段證明了近岸潮間帶池塘中營(yíng)混合營(yíng)養(yǎng)的纖毛蟲(chóng)Strombidiumoculatum和S.stylifer對(duì)大型綠藻中滸苔（Ulva）屬種類(lèi)的攝食[53]，發(fā)現(xiàn)纖毛蟲(chóng)可以攝食綠藻釋放的游動(dòng)孢子細(xì)胞。作者在樣品中檢測(cè)到綠藻來(lái)源的序列，屬綠藻門(mén)石莼屬。石莼一般生長(zhǎng)在海灣內(nèi)中低潮帶的巖石上或石沼中，廣泛分布于我國(guó)黃渤海沿岸[54]，在潮間帶的低、中、高潮帶均有分布[55]。石莼的生活史存在世代交替，隨環(huán)境變化，藻體能釋放大量孢子?；趯?shí)驗(yàn)結(jié)果，本文認(rèn)為中華哲水蚤可能是石莼屬藻類(lèi)孢子或配子細(xì)胞的潛在攝食者，雖然也有可能攝食DNA未被完全降解的綠藻碎屑。

傳統(tǒng)認(rèn)識(shí)中，大型藻類(lèi)和海草等的歸宿是進(jìn)入到碎屑食物鏈或被大型底棲生物所攝食[56]，進(jìn)入到底棲食物鏈。本研究基于分子生物學(xué)檢測(cè)的結(jié)果與McManus等[53]關(guān)于纖毛蟲(chóng)對(duì)大型藻類(lèi)的攝食研究類(lèi)似，展示了一個(gè)別樣的營(yíng)養(yǎng)關(guān)系，表明大型藻類(lèi)可以進(jìn)入到浮游食物網(wǎng)中。作為一種繁殖策略，在有外界壓力脅迫或處于有利擴(kuò)散條件時(shí)，綠藻可快速產(chǎn)出大量的孢子細(xì)胞。有研究表明大型石莼屬綠藻Ulvalactuca在生長(zhǎng)季節(jié)可以釋放其生物量20%～60%的游動(dòng)孢子細(xì)胞[57]。對(duì)于潮間帶池塘或近岸水域中的浮游生物，這種大型植物孢子的釋放可能給它們提供了周期性的重要食物來(lái)源。

致謝：感謝本課題組的房靜和李自尚等同學(xué)協(xié)助采集樣品。

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