芍藥苷對兔退變椎間盤組織中FasL介導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

史立君 吳春雷 王 靖 滕紅林 李 馳 朱旻宇

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州 325000）

·實(shí)驗(yàn)研究·

芍藥苷對兔退變椎間盤組織中FasL介導(dǎo)炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)作用

史立君 吳春雷 王 靖 滕紅林 李 馳 朱旻宇

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江溫州 325000）

目的探討芍藥苷在兔椎間盤內(nèi)紊亂（IDD）發(fā)生過程中對FasL介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的抑制作用。方法取新西蘭大白兔96只，雌雄不限，體質(zhì)量（3±0.5）kg。隨機(jī)分為4組，每組24只。其中3組行纖維環(huán)穿刺造模。造模后各組分別采用芍藥苷高［120mg／（kg·d）］、低［30mg／（kg·d）］劑量及生理鹽水灌胃治療，正常對照組采用生理鹽水灌胃，分籠常規(guī)飼養(yǎng)。分別在術(shù)后3、6、10周將各組大白兔處死取材，每組8只，離斷腰椎，分離椎間盤。免疫組化法檢測FasL、IL－1β及TNF－α的表達(dá)并經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果術(shù)后3、6、10周時，各造模組的FasL及IL－1β表達(dá)均高于正常對照組（均P＜0.01）。芍藥苷高、低劑量組的FasL及IL－1β表達(dá)低于生理鹽水組（均P＜0.05），而高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。3、6、10周時，各造模組的TNF－α表達(dá)均高于正常對照組（均P＜0.01）。3周時，高、低劑量組與生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6、10周時，低、高劑量組的TNF－α陽性細(xì)胞率均低于生理鹽水組（P＜0.05），而高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論芍藥苷可以抑制FasL表達(dá)，進(jìn)而抑制IL－6及TNF－α等炎性因子的分泌，最終起到抑制髓核細(xì)胞凋亡的作用。

椎間盤退變；動物模型；芍藥苷；炎性反應(yīng)；FasL；IL－1β；TNF－α

椎間盤內(nèi)紊亂（Internal disc disruption，IDD）是椎間盤內(nèi)的病理改變，而椎間盤的外形沒有或僅有極小的改變，當(dāng)椎間盤突出時（纖維環(huán)破裂），則會在局部激發(fā)炎癥反應(yīng)，引起髓核退變。髓核細(xì)胞通過自分泌或旁分泌途徑導(dǎo)致FasL表達(dá)增高是可能的機(jī)制之一。芍藥苷在IDD發(fā)生的過程中是否能夠干預(yù)FasL介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，減輕或延緩椎間盤退變，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。本研究旨在通過建立一個兔IDD模型，采用芍藥苷對其進(jìn)行干預(yù)，通過檢測FasL、IL－1β及TNF－α多項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，闡明芍藥苷在兔IDD模型中的影響及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 新西蘭健康大白兔96只，雌雄不限，體質(zhì)量（3±0.5）kg，由浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物實(shí)驗(yàn)中心提供（許可證號：Syxk（浙）2008－ 0114），動物質(zhì)量合格證號（Scxk（浙）2009－0039）。隨機(jī)分為4組，每組24只。

1.2 儀器 石蠟切片機(jī)：德國LAICA公司；OLYMPUS BH－2光學(xué)顯微鏡：日本OLYMPUS公司；OLYMPUS C5060攝像機(jī)：日本OLYMPUS公司；ZHJH－1214超凈臺：蘇州凈化儀器廠。

1.3 試劑與藥物 SABC免疫組化染色試劑盒：福建邁新公司；FasL抗體：Abnova公司；IL－1β及TNF－α抗體：武漢博士德公司；芍藥苷（產(chǎn)品批號：國藥準(zhǔn)字H20055058）：寧波立華制藥有限公司。

2 方 法

2.1 兔IDD模型的建立 取新西蘭健康大白兔72只，10%水合氯醛（3mL／kg）耳緣靜脈注射麻醉，采用腰椎左側(cè)前方倒“八”字入路，鈍性分離椎前軟組織，暴露脊柱的左前外側(cè)。定位后用18G皮膚穿刺針頭分別在L5～6椎間盤（兔的腰椎數(shù)為7節(jié)）進(jìn)行穿刺。深度控制在5mm，刺入后維持5秒。

2.2 分組與給藥 造模后將大白兔隨機(jī)分為三個實(shí)驗(yàn)組，每組24只，術(shù)后第2天開始，分別采用芍藥苷低劑量［30mg／（kg·d）］、高劑量［120mg／（kg·d）］及等量生理鹽水灌胃治療，另取新西蘭健康大白兔24只設(shè)為正常對照組，采用等量生理鹽水灌胃，分籠常規(guī)飼養(yǎng)，溫度18～22℃，濕度50%～60%。

2.3 指標(biāo)檢測 分別在術(shù)后的3周、6周和10周將各組大白兔處死取材，每時間段每組各8只，離斷腰椎，分離椎間盤。組織在石蠟切片機(jī)上切片，片厚3～4μm。組織片在展片機(jī)上展開后，貼于預(yù)先涂布10%多聚賴氨酸的載玻片上，貼好的切片在烤片機(jī)上63℃烘烤8小時，以利于組織牢固地貼在載玻片上。貼片經(jīng)上述處理后，室溫防塵保存待染色。免疫組化檢測治療前后椎間盤組織中FasL、IL－1β及TNF－α的表達(dá)。

2.4 結(jié)果判斷 光鏡下觀察髓核組織變化情況。免疫組化染色陽性物定位于細(xì)胞漿，呈棕黃色。所得結(jié)果由兩名病理科醫(yī)師計(jì)數(shù)10個高倍鏡（× 400）下的細(xì)胞總數(shù)及陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值，求出陽性細(xì)胞的百分比。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 FasL的陽性表達(dá) 3、6、10周時，各造模組的FasL表達(dá)均高于正常對照組（均P＜0.01）。高、低劑量組的FasL表達(dá)均低于生理鹽水組（均P＜0.05），而高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 芍藥苷對IDD兔髓核細(xì)胞FasL表達(dá)的影響（±s）

表1 芍藥苷對IDD兔髓核細(xì)胞FasL表達(dá)的影響（±s）

與正常對照組比較**P＜0.01，與生理鹽水組比較△P＜0.05

細(xì)胞陽性率組 別n（%）3周6周10周正常對照組87.993±1.439 8.170±1.175 7.925±1.411生理鹽水組835.154±7.441**36.463±5.836**45.405±5.014**低劑量組831.283±6.128**△34.230±2.016**△39.760±4.290**△高劑量組833.358±5.185**△30.985±3.120**△38.688±3.312**△

3.2 TNF－α的表達(dá) 3、6、10周時，各造模組的TNF－α表達(dá)均高于正常對照組（均P＜0.01）。3周時，高、低劑量組與生理鹽水組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；6、10周時，高、低劑量組的TNF－α細(xì)胞陽性率均低于生理鹽水組（P＜0.05），而3、6、10周時，高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 芍藥苷對IDD兔髓核細(xì)胞TNF－α表達(dá)的影響（±s）

表2 芍藥苷對IDD兔髓核細(xì)胞TNF－α表達(dá)的影響（±s）

與正常對照組比較**P＜0.01，與生理鹽水組比較△P＜0.05

細(xì)胞陽性率組 別n（%）3周6周10周正常對照組85.784±2.3484.936±1.0875.291±1.428生理鹽水組861.979±8.197**67.244±7.405**71.224±10.972**低劑量組863.334±10.442**56.210±13.173**△53.012±13.772**△高劑量組862.980±12.463**53.437±13.041**△51.136±12.961**△

3.3 IL－1β的表達(dá) 3、6、10周時，各造模組的IL－1β表達(dá)均高于正常對照組（均P＜0.01）。3、6、10周時，高、低劑量組的IL－1β細(xì)胞陽性率均低于生理鹽水組（均P＜0.05），而高、低劑量組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 芍藥苷對IDD兔髓核細(xì)胞IL－1β表達(dá)的影響（±s）

表3 芍藥苷對IDD兔髓核細(xì)胞IL－1β表達(dá)的影響（±s）

與正常對照組比較**P＜0.01，與生理鹽水組比較△P＜0.05

組 別n（%）3周6周10周細(xì)胞陽性率正常對照組84.589±1.9855.336±2.1525.457±2.038生理鹽水組872.080±12.272**75.433±11.356**76.876±9.879**低劑量組865.528±9.431**△57.210±12.586**△52.912±9.317**△高劑量組866.331±11.986**△59.471±11.749**△50.011±13.168**△

4 討 論

IDD是椎間盤內(nèi)的病理改變，而椎間盤的外形沒有或僅有極小的改變，是椎間盤退變的主要過程。椎間盤退變是腰椎退行性疾病的一個重要始動因素［1－2］，諸如腰椎管狹窄、腰椎間盤突出、腰椎退行性滑脫、不穩(wěn)等。椎間盤是人體內(nèi)最大的無血管組織，髓核被內(nèi)外層纖維環(huán)及上下軟骨終板緊密包繞，與機(jī)體的免疫系統(tǒng)相隔絕。所以當(dāng)髓核因各種原因與機(jī)體免疫系統(tǒng)相接觸時，就會引發(fā)自身的免疫炎性反應(yīng)［3－4］。如何能夠抑制這種免疫炎性反應(yīng)，延緩椎間退變是現(xiàn)今椎間盤退變性疾病的研究重點(diǎn)。

本文研究發(fā)現(xiàn)，纖維環(huán)穿刺法不會造成髓核組織的丟失，而且本實(shí)驗(yàn)中HE染色提示正常髓核組織中有著大量的髓核細(xì)胞，到了造模后的第3、6周髓核細(xì)胞則不斷減少，到第10周時髓核中主要為纖維軟骨組織殘留。證實(shí)了通過纖維環(huán)穿刺可以誘導(dǎo)大白兔椎間盤退變，而且這種退變是一個緩慢漸進(jìn)的過程，能夠較好地模擬人類椎間盤退變［5］。

退變的椎間盤內(nèi)炎癥介質(zhì)的含量非常高，炎癥介質(zhì)作用于竇椎神經(jīng)末端的傷害感受器可直接導(dǎo)致電生理變化，或使其極其敏感，在輕微的機(jī)械壓力刺激下也可產(chǎn)生神經(jīng)沖動。諸如腫瘤壞死因子（TNF）、白細(xì)胞介素－1（IL－1）及前列腺素（PGE2）等炎癥介質(zhì)在盤源性腰痛中發(fā)揮著重要的作用［6－7］。

在正常髓核中FasL與椎間盤免疫豁免機(jī)制有關(guān)，而髓核組織的免疫豁免效應(yīng)是由生理學(xué)屏障與FasL共同維持的，當(dāng)這一屏障受損時，髓核組織會與機(jī)體免疫系統(tǒng)接觸，F(xiàn)asL表達(dá)水平升高，髓核細(xì)胞凋亡增加，激發(fā)炎癥反應(yīng)。在前期的研究中作者成功構(gòu)建了兔IDD模型，并且發(fā)現(xiàn)正常與退變的兔髓核組織中均存在著FasL的表達(dá)，而且纖維環(huán)破裂會明顯上調(diào)FasL表達(dá)水平，髓核細(xì)胞凋亡增加［8］。FasL是一個具有多重效應(yīng)的細(xì)胞因子，除了免疫豁免外，F(xiàn)asL還具有促進(jìn)炎癥反應(yīng)的作用。當(dāng)椎間盤生理解剖學(xué)屏障受到損傷時，F(xiàn)asL與IL－6及TNF－α的表達(dá)程度增強(qiáng)，F(xiàn)asL所介導(dǎo)的免疫炎性反應(yīng)可能是引起椎間盤退變的一個重要機(jī)制［9］。

中醫(yī)認(rèn)為，盤源性腰痛在祖國醫(yī)學(xué)屬于“痹癥”的范疇，主要因“氣滯血瘀、不通則痛”所致，治療上應(yīng)以活血化瘀、理氣止痛為主。赤芍具有活血化瘀功效，白芍具有抗炎止痛等作用，臨床治療腰痛的中藥方劑中，有不少含有赤芍、白芍成份。陳尹等［10］發(fā)現(xiàn)，白芍總苷可以明顯抑制佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)巨噬細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞的IL－1分泌，并且抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞內(nèi)MAPK信號通路中ERK等的磷酸化、減弱成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖。

本文通過穿刺法構(gòu)建了兔IDD模型，經(jīng)芍藥苷灌胃治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過芍藥苷干預(yù)后，在造模后的3、6、10周，F(xiàn)asL、IL－1β及TNF－α的陽性表達(dá)率明顯低于未經(jīng)芍藥苷干預(yù)的組別?？梢娚炙庈湛梢砸种艶asL表達(dá)，進(jìn)而抑制IL－6及TNF－α等炎性因子的分泌，為臨床采用芍藥苷治療IDD提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但本組實(shí)驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)高、低劑量組之間存在差異，是否與兔機(jī)體無法吸收過高濃度有關(guān)，需要通過血清藥理學(xué)及細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

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［9］ 王靖，唐天駟，滕紅林，等．FasL在家兔退變髓核組織中的表達(dá)及其與白細(xì)胞介素－6和腫瘤壞死因子的相關(guān)性．中華實(shí)驗(yàn)外科雜志，2010，27（1）：114

［10］ 陳尹，魏偉，吳虹，等．芍藥苷對佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生抗體和cAMP水平的影響．藥學(xué)學(xué)報(bào)，2007，42（11）：1147

1．國家自然科學(xué)基金（081202711）

2．浙江省自然科學(xué)基金（LY12H06004）

3．浙江省中醫(yī)藥科學(xué)研究基金（2010ZA083）