Ets－1和MMP－9對淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的預(yù)測價值

牟 虹 范京京 陳美蓮

（淳安縣第一人民醫(yī)院，浙江淳安 311700）

Ets－1和MMP－9對淋巴瘤侵襲轉(zhuǎn)移和預(yù)后的預(yù)測價值

牟 虹 范京京 陳美蓮

（淳安縣第一人民醫(yī)院，浙江淳安 311700）

目的評估免疫組織化學(xué)S－P法對E26轉(zhuǎn)錄因子－1（Ets－1）和基質(zhì)金屬蛋白酶－9（MMP－9）檢測用于預(yù)測淋巴瘤侵襲性以及評估預(yù)后的臨床意義。方法150例淋巴瘤病患者取其淋巴瘤手術(shù)標(biāo)本分為侵襲組83例和非侵襲組67例，另選擇20例良性增生性的淋巴結(jié)炎作為對照組，通過免疫組化S－P方法對Ets－1和MMP－9蛋白表達(dá)情況進行檢測，并分析Ets－1和MMP－9在不同臨床和病理特征中的表達(dá)。結(jié)果（1）Ets－1和MMP－9在淋巴瘤組的表達(dá)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。（2）MMP－9的表達(dá)和患者的年齡、性別以及組織學(xué)類型沒有顯著關(guān)系；而MMP－9在侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率（80.7%）顯著高于非侵襲性淋巴瘤組織（38.8%）（P＜0.01）；在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的陽性率（72.0%）顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者（52.0%）（P＜0.05）；Ets－1的表達(dá)和患者的年齡以及組織學(xué)類型無顯著關(guān)系；Ets－1在女性中的陽性表達(dá)率（71.7%）顯著高于男性（36.1%）（P＜0.01），在侵襲性淋巴瘤組織中（62.7%）顯著高于非侵襲性淋巴瘤組織（31.3%）（P＜0.01）；在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的陽性率（82.7%）顯著高于Ⅰ期和Ⅱ期患者（41.3%）（P＜0.05）；（3）Ets－1和MMP－9兩者弱相關(guān)（r＝0.319）。結(jié)論Ets－1和MMP－9在淋巴瘤的侵襲性判斷以及預(yù)后評估方面是比較可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

Ets－1；MMP－9；免疫組織化學(xué)；侵襲性；預(yù)后

單核苷酸的多態(tài)性（single nucleotidepolym orphism，SNP）指的是在基因組內(nèi)某一特定位置上的核苷酸出現(xiàn)了堿基的改變，而發(fā)生改變的基因型在整個族群中出現(xiàn)的頻率需在1%以上，這是人類基因組的主要變異形式，對腫瘤的治療效果以及易感性會造成影響［1］。近年來，基質(zhì)金屬的蛋白酶類基因逐漸成為熱點研究對象，是遺傳中的一組重要候選基因?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrimetall oproteinases，MMPs）可將細(xì)胞外的各基質(zhì)組分進行切斷，例如蛋白聚糖、纖維性結(jié)合蛋白、層黏連蛋白和膠原蛋白等，密切相關(guān)于惡性腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移和侵襲。MMP－9是降解基底膜以及細(xì)胞外部基質(zhì)的關(guān)鍵性蛋白酶，在眾多惡性腫瘤當(dāng)中均有表達(dá)上升的情況。而Ets－1為Ets轉(zhuǎn)錄因子的家族成員之一，Ets－1基因編碼的Ets－1蛋白分子量是54kD，其通過結(jié)合MMPs啟動子的增強區(qū)域內(nèi)的特定DNA序列而達(dá)到對其轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)的調(diào)控作用，從而參與到血管生成、細(xì)胞增殖等多種生理進程［2］。本研究通過免疫組織化學(xué)S－P法對Ets－1和MMP－9檢測用于預(yù)測淋巴瘤侵襲性，以及評估預(yù)后的臨床價值進行探討，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 淋巴瘤組標(biāo)本取自本院2013年5月～2014年5月150例淋巴瘤患者，其中男97例，女53例，年齡11～79歲，平均（51.3±2.5）歲。按照Ann Arbor分期原則分為Ⅰ期48例，Ⅱ期27例，Ⅲ期45例，Ⅳ期30例。通過免疫學(xué)檢查可分為T細(xì)胞淋巴瘤55例，B細(xì)胞淋巴瘤87例，霍奇金淋巴瘤8例。根據(jù)《歐洲－美國淋巴組織腫瘤分類方法》侵襲性的判斷標(biāo)準(zhǔn)［3］分為侵襲組83例，非侵襲組67例。另取同時期20例良性增生性的淋巴結(jié)炎作為對照組，其中男13例，女7例，年齡15～73歲，平均（45.5±6.2）歲。兩組年齡、性別比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法 標(biāo)本處理：將手術(shù)獲取的組織一部分放入甲醛溶液進行固定，在脫水后使用石蠟進行包埋，剩余部分使用生理鹽水將積血洗凈，并立刻置于由焦碳酸二乙酯處理后的凍存管，充入液氮留作備用。檢測試劑：兔抗人MMP－9多克隆抗體購自上海領(lǐng)成生物科技有限公司；鼠抗人Est－1單克隆抗體購自上海信則生物科技有限公司；DAB顯色劑以及SP試劑盒購自北京北瑞達(dá)醫(yī)藥科技有限公司。免疫組化S－P檢測：將石蠟包埋的組織標(biāo)本做5μm的連續(xù)切片，其中一張用于HE染色以對病理結(jié)果進行進一步確認(rèn)，免疫組化操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。使用PBS代替一抗作為陰性對照。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)［4］Ets－1和MMP－9免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：鏡下對血管內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞和淋巴細(xì)胞進行觀察。光鏡下對組織切片顯色情況進行觀察，每例隨機選擇4個高倍鏡的視野。Ets－1和MMP－9的陽性標(biāo)準(zhǔn)均為胞漿中有棕黃色的顆粒出現(xiàn)，陰性標(biāo)準(zhǔn)均為沒有出現(xiàn)。Ets－1的主要表達(dá)位點是淋巴瘤細(xì)胞，MMP－9不僅在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)，還可于間質(zhì)的巨噬細(xì)胞、纖維母細(xì)胞以及新生的血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。按照陽性細(xì)胞所占比例以及陽性反應(yīng)程度打分，可分為：（1）陽性細(xì)胞：＞75%記4分，＞50%～75%記3分，＞25%～50%記2分，5%～25%記1分，＜5%記0分；（2）陽性反應(yīng)程度：棕黃色記3分，黃色記2分，淡黃色記1分，沒有著色記0分；陽性細(xì)胞所占比例和染色強度的乘積在10～12分記（＋＋＋），7～9分記（＋＋），2～6分記（＋），＜2分記（－）。陽性表達(dá)包括（＋）、（＋＋）和（＋＋＋），陰性表達(dá)為（－）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0統(tǒng)計分析軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，線性相關(guān)分析采用Sperman分析。

2 結(jié) 果

2.1 MMP－9與Ets－1的表達(dá) MMP－9和Ets－1在淋巴瘤組的表達(dá)均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.01）。詳見表1。

表1 兩組MMP－9和Ets－1的表達(dá)情況（%）

2.2 MMP－9、Ets－1與患者基本特征及淋巴瘤侵襲性的關(guān)系 MMP－9的表達(dá)和患者的年齡、性別以及組織學(xué)類型沒有顯著關(guān)系；而MMP－9在侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為80.7%，在非侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為38.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；MMP－9在Ⅰ期和Ⅱ期患者中的陽性率為52.0%，在Ⅲ期和Ⅳ期患者中的陽性率為72.0%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Ets－1的表達(dá)和患者的年齡以及組織學(xué)類型無顯著性關(guān)系；Ets－1在女性陽性率為71.7%，男性陽性率為36.1%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Ets－1在侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為62.7%，在非侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為31.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Est－1在Ⅰ～Ⅱ期患者中的陽性率為41.3%，在Ⅲ～Ⅳ期患者中的陽性率為82.7%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 MMP－9與Ets－1的表達(dá)與患者基本特征及病理學(xué)特征的關(guān)系

2.3 Ets－1和MMP－9的相關(guān)性 150例接受檢測的淋巴瘤組織當(dāng)中，57例為Ets－1和MMP－9均表達(dá)為陽性；42例為Ets－1和MMP－9均表達(dá)為陰性；35例為Ets－1表達(dá)陰性而MMP－9表達(dá)陽性；16例為Ets－1表達(dá)陽性而MMP－9表達(dá)陰性。通過Sperman進行相關(guān)分析，r＝0.319，Ets－1和MMP－9兩者呈弱相關(guān)。

3 討 論

惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移與侵襲是最基本的病理特征，也是影響患者預(yù)后的主要因素，而淋巴瘤在病變發(fā)展過程中常在多個器官以及淋巴結(jié)區(qū)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移和侵襲［5］。因此，對淋巴結(jié)是否存在侵襲轉(zhuǎn)移的正確判斷對臨床治療及預(yù)后非常重要。

MMPs為依賴鋅離子并高度保守的酶家族，主要功效是水解內(nèi)切蛋白，可以對細(xì)胞外部基質(zhì)以及基底膜的大部分蛋白質(zhì)進行降解。近年研究顯示［6］，MMP－9為腫瘤細(xì)胞以及周圍的基質(zhì)細(xì)胞所分泌，其對于腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移灶生成以及腫瘤血管化均產(chǎn)生了重要影響。MMP－9主要與生理pH下，通過鋅離子的作用，參與到降解和重建胞外基質(zhì)的進程。有研究表明，腫瘤的轉(zhuǎn)移侵襲相關(guān)潛能和腫瘤細(xì)胞分泌MMP－9蛋白能力為正性相關(guān)，MMP－9不僅參與到胞外基質(zhì)降解，同時也會影響腫瘤細(xì)胞能動和粘附能力。結(jié)腸癌、乳腺癌和胃癌等惡性腫瘤組織中MMP－9的表達(dá)都有顯著升高。已有研究表明［7］，MMP－9在非霍奇金淋巴瘤組織中陽性率為84.3%，顯著高于良性的增生淋巴結(jié)炎組織，且Ⅲ～Ⅳ期患者陽性表達(dá)率顯著高于Ⅰ～Ⅱ期患者，提示其可能是非霍奇金淋巴瘤預(yù)后以及轉(zhuǎn)移侵襲預(yù)測的有關(guān)因素。本研究中MMP－9在淋巴瘤組織中（淋巴瘤組）的陽性率為62.0%，顯著高于對照組的20.0%，此外，MMP－9在侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為80.7%，在非侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為38.8%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

Ets－1基因為原型Ets基因，具有多個結(jié)構(gòu)功能區(qū)域，其中處于羧基末端的即為Ets結(jié)構(gòu)區(qū)域，分子中央位置為反式激活的結(jié)構(gòu)區(qū)域，兩側(cè)位置是抑制結(jié)構(gòu)區(qū)域，對Ets－1同DNA的結(jié)合進行負(fù)性調(diào)節(jié)。胚胎發(fā)育過程中結(jié)締組織的重塑、新生血管的形成、神經(jīng)嵴的遷移、器官形成和組織塑形等環(huán)節(jié)均有Ets－1的參與。成人的Ets－1主要優(yōu)勢表達(dá)于淋巴細(xì)胞。目前通過多種檢驗方法發(fā)現(xiàn)眾多惡性侵襲性的腫瘤中出現(xiàn)Ets－1再次表達(dá)［8］。本研究結(jié)果顯示，Ets－1在淋巴瘤組織中（淋巴瘤組）的陽性率為48.7%，顯著高于對照組中的15.0%，且男性患者的Ets－1陽性率（36.1%）遠(yuǎn)低于女性患者（71.7%），兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Ets－1在侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為62.7%，在非侵襲性淋巴瘤組織中的陽性率為31.3%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），提示Ets－1對淋巴瘤的侵襲轉(zhuǎn)移以及預(yù)后也具有一定的預(yù)測作用。

Ets－1通過結(jié)合MMPs啟動子的增強區(qū)域內(nèi)的特定DNA序列而達(dá)到對其轉(zhuǎn)錄以及表達(dá)的調(diào)控作用，從而參與到血管生成、細(xì)胞增殖等多種生理進程。本研究顯示，Ets－1和MMP－9表達(dá)的相關(guān)系數(shù)r＝0.319，具有弱相關(guān)性，是否提示淋巴瘤組織中MMP－9表達(dá)水平的調(diào)控還可能有其它因子的參與［9］，有待進一步研究。

綜上所述，在淋巴瘤的侵襲性判斷以及預(yù)后評估方面，Ets－1和MMP－9是比較可靠的生物學(xué)指標(biāo)。

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