肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)及意義

王細(xì)勇 杜開(kāi)齊 張志豪 朱有才

（中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)浙江省武警總隊(duì)醫(yī)院，浙江嘉興 314000）

·臨床研究·

肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)及意義

王細(xì)勇 杜開(kāi)齊 張志豪 朱有才

（中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)浙江省武警總隊(duì)醫(yī)院，浙江嘉興 314000）

目的檢測(cè)TLR4 mRNA在非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)，探討其臨床意義。方法應(yīng)用RTPCR方法檢測(cè)TLR4 mRNA在100例非小細(xì)胞肺癌患者和60例體檢健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的表達(dá)，分析TLR4 mRNA在肺癌患者及體檢健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)差異及TLR4 mRNA在肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)顯著高于體檢健康者（P＜0.05）；腫瘤最長(zhǎng)徑＞5cm的肺癌患者的TLR4 mRNA表達(dá)量高于最長(zhǎng)徑≤5cm的肺癌患者（P＜0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者的TLR4 mRNA表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者（P＜0.05）；TNM分期Ⅰ期、Ⅱ～Ⅲ期、Ⅳ期肺癌患者的TLR4 mRNA表達(dá)量依次升高，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TLR4 mRNA表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌患者的性別、年齡、組織學(xué)類型、腫瘤分化程度及吸煙史均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分期是非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素（P＜0.05）。結(jié)論非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)增高，且TLR4 mRNA表達(dá)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，可作為預(yù)測(cè)腫瘤進(jìn)展的重要指標(biāo)，并提示運(yùn)用TLR4的相關(guān)拮抗劑如Eritoran，作為免疫佐劑用于非小細(xì)胞肺癌治療成為可能。

非小細(xì)胞肺癌；TLR4；逆轉(zhuǎn)錄；PCR

肺癌是一種非免疫原性的腫瘤，可以逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)控。Toll樣受體4（Toll－like receptor 4，TLR4）是連接固有免疫及適應(yīng)性免疫的重要橋梁，表達(dá)于多種免疫細(xì)胞［1］。研究表明，肺癌樹(shù)突狀細(xì)胞（DCs）、巨噬細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞均有TLR4的活化［2］，但肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4的表達(dá)及其與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系，在國(guó)內(nèi)外鮮有報(bào)道。本研究對(duì)非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，觀察其表達(dá)變化并探討其臨床意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2012年1月～2013年12月浙江省武警總隊(duì)醫(yī)院收治的肺癌患者100例，經(jīng)手術(shù)或活檢病理檢查確診為非小細(xì)胞肺癌，并在入組前未經(jīng)過(guò)放化療及免疫治療。100例中男67例，女

33例。年齡35～79歲，平均（59.5±11.3）歲。肺腺癌41例，鱗狀細(xì)胞癌59例。高分化癌19例，中分化癌54例，低分化癌27例。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者62例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例。吸煙者57例，非吸煙者43例；TNM分期根據(jù)2009年國(guó)際抗癌聯(lián)盟（International Union Against Cancer，UICC）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其中Ⅰ期21例，Ⅱ～Ⅲ期47例，Ⅳ期32例。選擇同期本院體檢中心的體檢健康者60例作為對(duì)照組，其中男30例，女30例，年齡34～77歲，平均（58.2± 11.9）歲。

1.2 主要試劑 淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京賽馳生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及DNA ladder均購(gòu)自TAKARA公司；TaqDNA聚合酶，dNTP均購(gòu)自天為時(shí)代公司；TLR4（622 bp）上游引物：5′－CTGCAATGGATCAAGGACCA－3，下游引物：5′－TCCCACTCCAGGTAAGTGTT－3′；β－actin（374bp）上游引物：5′－CGTGACATTAAGGAGAAGCTGTGC－3′，下游引物：5′－CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT－3′。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。

1.3 單個(gè)核細(xì)胞分離 無(wú)菌條件下取試驗(yàn)者外周血5mL，以終濃度為50g／L的肝素抗凝。沿管壁緩慢加入含5mL淋巴細(xì)胞分離液（比重為l.077）至無(wú)菌試管中使兩液面間保持清晰界面。離心20分鐘（2000轉(zhuǎn)／min），吸取血漿和分離液之間的單個(gè)核細(xì)胞層入另一無(wú)菌試管中，加5倍PBS液混勻，離心5分鐘（1000轉(zhuǎn)／min），去上清液，沉淀即為單個(gè)核細(xì)胞。

1.4 RT－PCR檢測(cè)TLR4 mRNA的表達(dá) 按照總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取總RNA，進(jìn)行紫外定量，并鑒定RNA的質(zhì)量。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。25μL PCR體系，β－actin為內(nèi)參。擴(kuò)增參數(shù)：94℃5分鐘；再以94℃40秒、50℃40秒、72℃90秒為1個(gè)循環(huán)，共30個(gè)循環(huán)；72℃5分鐘。PCR產(chǎn)物在含有g(shù)oldview的1.5%瓊脂糖凝膠上95V恒壓電泳35分鐘，最后置于凝膠成像分析儀觀察結(jié)果，TLR4 mRNA和β－actin均能擴(kuò)增成功。

1.5 計(jì)算機(jī)圖像處理 RT－PCR用bandscan4.3，對(duì)每個(gè)目的條帶進(jìn)行總光密度值的分析，以目的產(chǎn)物條帶OD值與β－actin產(chǎn)物條帶的OD值的比值，代表目的基因mRNA表達(dá)的相對(duì)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 所有的結(jié)果用SPSS19.0分析。兩樣本均數(shù)間的比較首先運(yùn)用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行兩樣本方差的齊性檢驗(yàn)，如兩樣本方差相等，則采用兩獨(dú)立樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)，如兩樣本方差不等，則采用近似t檢驗(yàn)；多樣本均數(shù)間的比較采用方差分析，運(yùn)用Levene檢驗(yàn)進(jìn)行多樣本方差的齊性檢驗(yàn)，如方差相等，則運(yùn)用Student－Newman－Keuls進(jìn)行兩兩比較，如方差不等，則運(yùn)用Dunnett T3進(jìn)行兩兩比較。采用多元線性回歸進(jìn)行多因素分析。

2 結(jié) 果

2.1 TLR4 mRNA在非小細(xì)胞肺癌患者和體檢健康者中的表達(dá) 非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)相對(duì)量為（0.51±0.16），體檢健康者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)相對(duì)量為（0.33±0.12）。非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)量顯著高于體檢健康者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2.2 TLR4 mRNA的表達(dá)與臨床特征的關(guān)系 腫瘤最長(zhǎng)徑＞5cm的肺癌患者TLR4 mRNA表達(dá)量高于最長(zhǎng)徑≤5cm的肺癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.05）；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者TLR4 mRNA表達(dá)量高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TNM分期I期、II～I(xiàn)II期、IV期肺癌患者的TLR4 mRNA表達(dá)量依次升高，兩兩比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。TLR4 mRNA表達(dá)量與非小細(xì)胞肺癌患者的性別、年齡、組織病理學(xué)類型、腫瘤分化程度及吸煙史均無(wú)關(guān)（均P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

圖1 TLR4 mRNA在非小細(xì)胞肺癌患者和健康體檢者外周血單個(gè)核細(xì)胞表達(dá)

表1 TLR4 mRNA 的表達(dá)與非小細(xì)胞肺癌臨床特征的關(guān)系

2.3 TLR4 mRNA表達(dá)的多因素分析 將單因素分析具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期）進(jìn)行多元線性回歸分析（直接進(jìn)入法）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果如下：（1）方差分析：F＝17.253，P＜0.05，表示多元線性回歸具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；（2）擬合優(yōu)度：R2＝0.35，表示自變量可以解釋因變量變化的35%；（3）各自變量偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)說(shuō)明TLR4 mRNA在非小細(xì)胞肺癌患者的表達(dá)只和腫瘤TNM分級(jí)存在顯著線性關(guān)系，而與腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移不存在顯著線性關(guān)系。建立的多元回歸方程為Y＝0.373＋0.047X1＋0.106X2＋0.032X3，詳見(jiàn)表2。

表2 各自變量偏回歸系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

3 討 論

Toll樣受體是最具特征性的模式識(shí)別受體，目前至少發(fā)現(xiàn)了13種TLRs，其中最重要、研究最成熟的是TLR4。TLR4能識(shí)別病原相關(guān)分子模式（如LPS）及損傷相關(guān)分子模式（如HMGB1），在參與固有免疫［3］及適應(yīng)性免疫的細(xì)胞［4］中都有不同程度的表達(dá)。TLR4與相關(guān)配體結(jié)合后，可啟動(dòng)兩條截然不同的信號(hào)通路，一條為髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路，最終導(dǎo)致前炎性細(xì)胞因子的表達(dá)；另一條為MyD88非依賴的信號(hào)傳導(dǎo)通路，從而促進(jìn)抗細(xì)菌、抗病毒及抗腫瘤免疫［5］。

腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體免疫功能下降及免疫監(jiān)視作用的減弱密切相關(guān)，鑒于TLR4在免疫功能的重要作用，本文觀察了肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)及其與臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系。本研究表明，非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)顯著高于體檢健康者。Pries等［6］發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞能調(diào)節(jié)不同免疫細(xì)胞TLR4蛋白的表達(dá)和功能，而在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌患者，腫瘤免疫抑制可能與T－reg的TLR4受體激活有關(guān)［7］，因此推測(cè)在非小細(xì)胞肺癌患者肺癌細(xì)胞能通過(guò)分泌細(xì)胞因子或其他方式促進(jìn)免疫細(xì)胞表達(dá)TLR4。本研究還發(fā)現(xiàn)TLR4 mRNA的表達(dá)與腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，說(shuō)明肺癌患者TLR4 mRNA的上調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，這與Ono等［8］在胃腸癌、黃金等［9］在86例不同癌癥患者及蔡智慧等［10］在肺癌的研究結(jié)果相一致，以上研究均發(fā)現(xiàn)腫瘤進(jìn)展期患者外周血單核細(xì)胞TLR4表達(dá)水平增高。TLR4可能通過(guò)以下機(jī)制促進(jìn)肺癌的進(jìn)展：（1）TLR4活化可激活JNK、p38－MAPK和NF－κB通路，從而誘導(dǎo)IL－6、IL－10和TNF的分泌，從多方面抑制B細(xì)胞的功能［11］；（2）TLR4的激活可增強(qiáng)Treg細(xì)胞的抑制活性［12］；（3）TLR4可通過(guò)識(shí)別腫瘤源性HMGB1激活樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）［13］，而DC細(xì)胞可通過(guò)分泌IL－27使Treg細(xì)胞增殖；（4）TLR4的激活可促進(jìn)免疫細(xì)胞分泌炎性因子，形成潛在的慢性炎癥，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展。本研究還通過(guò)多元線性回歸分析發(fā)現(xiàn)，腫瘤TNM分級(jí)是非小細(xì)胞肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA表達(dá)的獨(dú)立相關(guān)因素，但擬合優(yōu)度不高，僅能解釋TLR4 mRNA表達(dá)的35%，說(shuō)明尚有其它因素（如患者的基礎(chǔ)免疫水平等）與TLR4 mRNA的表達(dá)有關(guān)，具體因素還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞TLR4 mRNA的表達(dá)與肺癌的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，提示外周血TLR4 mRNA的表達(dá)可作為預(yù)測(cè)肺癌進(jìn)展及預(yù)后的新參數(shù)，TLR4的相關(guān)拮抗劑如Eritoran可望作為免疫佐劑用于非小細(xì)胞肺癌的治療。

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嘉興市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012AY1078－4）