有機(jī)廢棄物好氧堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的研究進(jìn)展

杜雪晴，廖新俤，2＊，吳銀寶，2，陳 偉

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東廣州510642；2.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部生態(tài)農(nóng)業(yè)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510642）

好氧堆肥是一種對(duì)有機(jī)物廢棄物進(jìn)行資源化、無(wú)害化和穩(wěn)定化處理的經(jīng)濟(jì)高效的方法［1］，目前已在農(nóng)業(yè)固體有機(jī)廢棄物如農(nóng)作物秸稈、養(yǎng)殖畜禽糞便、病死動(dòng)物尸體等，以及城市生活垃圾如餐廚垃圾、城市污泥等的處理中得到廣泛應(yīng)用。但好氧堆肥過(guò)程會(huì)造成不同程度的氮素?fù)p失［2－3］，一般氮素?fù)p失量約為初始總氮的16%～76%［4］，其損失途徑包括氨氣揮發(fā)、氧化亞氮和氮?dú)馀欧?、淋溶等形式，其中以氨氣揮發(fā)形式損失的氮素可達(dá)氮素總損失量的44%～99%［3］，特別是在含氮較高的畜禽糞便堆肥中損失更嚴(yán)重。氮素?fù)p失不僅降低了堆肥的農(nóng)用價(jià)值，而且會(huì)對(duì)環(huán)境產(chǎn)生二次污染，產(chǎn)生臭氣和溫室氣體的排放、酸雨、土壤富營(yíng)養(yǎng)化等環(huán)境問(wèn)題。

研究有機(jī)廢棄物堆肥過(guò)程中的氮素轉(zhuǎn)化機(jī)制及相關(guān)微生物，有助于減少好氧堆肥過(guò)程中的氮素?fù)p失及溫室氣體排放。近年來(lái)，關(guān)于自然界氮素循環(huán)的研究取得了重要的進(jìn)展，氮循環(huán)主要包括固氮作用、硝化作用、反硝化作用和氨化作用4個(gè)過(guò)程［5］，堆肥過(guò)程中含氮有機(jī)物易于被微生物分解轉(zhuǎn)化為銨態(tài)氮（NH4＋），銨態(tài)氮被氧化為亞硝態(tài)氮（NO2－ ），再進(jìn)一步氧化為硝態(tài)氮（NO3－ ）完成硝化作用［6］。Matsuno等［7］分析76個(gè)土壤樣品的氮素循環(huán)，都觀察到NH4＋的聚集，但NH4＋→NO2－ 比NO2－ →NO3－要緩慢，是由于亞硝態(tài)氮極不穩(wěn)定，易被氧化為硝態(tài)氮，因此氨氧化是硝化作用的關(guān)鍵限速步驟［8］。自100多年前，細(xì)菌氨氧化作用被首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)［9］，與氨氧化相關(guān)的微生物學(xué)研究在氮素的生物地球化學(xué)循環(huán)中一直倍受關(guān)注。長(zhǎng)期以來(lái)，變形菌綱的氨氧化細(xì)菌（Ammonia Oxidizing Bacteria，AOB）被研究者普遍認(rèn)為是地球氮素循環(huán)過(guò)程中最主要的承擔(dān)者［10］，然而隨著環(huán)境微生物分子生態(tài)學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究的深入，國(guó)內(nèi)外眾多研究者發(fā)現(xiàn)了另一類完全獨(dú)立于AOB 的具有氨氧化能力的微生物－氨氧化古菌（Ammonia Oxidizing Archaea，AOA）［6］，在氮循環(huán)中可能起著非常重要的作用［5，11］。至此，再次引起人們對(duì)氨氧化微生物的廣泛關(guān)注和研究。如前所述，在堆肥系統(tǒng)中，氨氧化作用對(duì)氮素的轉(zhuǎn)化非常重要，直接影響到堆肥的農(nóng)用價(jià)值及堆肥過(guò)程中氨氣和氧化亞氮的排放。因此本文介紹了好氧堆肥系統(tǒng)中的兩種主要氨氧化微生物AOB和AOA 的生理生態(tài)特性及其影響因素，總結(jié)了堆肥過(guò)程中氨氧化微生物對(duì)氮素轉(zhuǎn)換的作用和可能的調(diào)控措施，以期為今后氨氧化微生物在堆肥系統(tǒng)中的應(yīng)用提供參考。

1 好氧堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的種類及特性

目前，自然界中發(fā)現(xiàn)的氨氧化微生物主要有好氧氨氧化細(xì)菌（AOB）、氨氧化古菌（AOA）和厭氧氨氧化細(xì)菌（anaerobic ammonium oxidation，Anammox）。其中AOA 和AOB都能將氨氧化為亞硝酸鹽，它們廣泛分布在海洋、土壤和濕地等生態(tài)系統(tǒng)中［12－15］；Anammox屬于浮霉菌門，是污水處理中非常重要的細(xì)菌，可以在缺氧環(huán)境中，將銨離子（NH4＋）用亞硝酸根（NO2－）氧化為氮?dú)?，其化學(xué)方程式為NH4＋＋NO2－ →N2＋2H2O，Δ Go ＝－357kJ mol－1［16－17］。這三種細(xì)菌對(duì)全球氮循環(huán)具有非常重要意義，目前對(duì)好氧堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的研究主要集中在AOA 和AOB。

1.1 好氧氨氧化細(xì)菌（AOB）

好氧氨氧化細(xì)菌（AOB）屬于變形菌門，是一類能夠在好氧條件下將氨氧化為亞硝酸鹽的化能無(wú)機(jī)自養(yǎng)型細(xì)菌，其含有一種可催化銨氧化為羥胺的胞內(nèi)酶即氨單加氧酶（ammonia monooxygenase，amoA），由amoA、amoB和amoC 3個(gè)亞基組成［18］，amoA 基因在氨氧化菌中普遍存在且可作為氨氧化菌特異的分子標(biāo)記［19－20］。通過(guò)16SrRNA 基因序列同源性的系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的好氧氨氧化菌主要屬于β－和γ－Proteobacteria 兩個(gè)亞綱，其中γ－Proteobacteria亞綱適合在海洋環(huán)境中生長(zhǎng)［21］，β－Proteobacteria亞綱則適合在淡水環(huán)境中生長(zhǎng)，可分為亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和亞硝化螺菌屬（Nitrosopira）［16］。

Maeda等［22］2010年在牛糞堆肥的表面檢測(cè)到大量的amoA基因，同年Yamamoto等［23］在牛糞堆肥的研究中發(fā)現(xiàn)AOB的優(yōu)勢(shì)種群主要為亞硝化單胞菌屬，孫志遠(yuǎn)［24］和虞泳等［25］分別在牛糞堆肥和秸稈等農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥研究中都發(fā)現(xiàn)Nitrosospira和Nitrosomonas 為AOB 優(yōu)勢(shì)種屬，其中Nitrosomonas存在于整個(gè)堆肥過(guò)程中，是耐受性較強(qiáng)的種屬，在堆肥體系氨氮的氧化過(guò)程中可能發(fā)揮著重要的作用。2012年，Yamamoto等［26］在豬糞堆肥也中檢測(cè)到與亞硝化單胞菌屬基因序列相似性較高的AOB，且AOB非?；钴S的參與了堆肥過(guò)程的硝化作用，說(shuō)明AOB對(duì)堆肥過(guò)程的硝化作用至關(guān)重要。而賀紀(jì)正等［27］在長(zhǎng)期施用氮磷鉀肥和有機(jī)質(zhì)肥的土壤生態(tài)系統(tǒng)中檢測(cè)到的AOB主要為亞硝化螺菌屬（Nitrosopira），說(shuō)明在不同陸地生態(tài)系統(tǒng)中AOB的種群分布存在差異。

1.2 氨氧化古菌（AOA）

自Venter等［28］2004年在在海水微生物宏基因組測(cè)序中首次發(fā)現(xiàn)泉古菌擁有與硝化細(xì)菌非常類似的amoA基因，提出海洋泉古菌可能具有氨氧化能力以來(lái)，激起了廣大學(xué)者對(duì)不同生態(tài)環(huán)境中泉古菌氨氧化能力的廣泛關(guān)注。2005年，Treusch等［29］在對(duì)土壤泉古菌基因組分析時(shí)也發(fā)現(xiàn)泉古菌擁有amoA基因，同年，Konneke等［6］成功分離并獲得一株具有氨氧化能力的中溫泉古菌Nitrosopum ilusmaritimus純培養(yǎng)物，繼而Francis等［30］將具有氨氧化能力的泉古菌命名為氨氧化古菌（ammonia－oxidizing archaea，AOA）。

氨氧化古菌屬于泉古門菌，含有氨單加氧酶的全部亞基［29］，是一類完全獨(dú)立于AOB 的進(jìn)化類群。它能將銨態(tài)氮氧化為亞硝態(tài)氮同時(shí)固定二氧化碳，進(jìn)行無(wú)機(jī)自養(yǎng)，而且它可以耐受缺氧環(huán)境，是深海海域等缺氧環(huán)境中氨氧化的優(yōu)勢(shì)微生物類群［31］。根據(jù)amoA基因序列變異及其所棲息的生態(tài)環(huán)境，可將硝化古菌分為海洋環(huán)境硝化古菌群落、土壤環(huán)境硝化古菌群落、嗜高溫環(huán)境硝化古菌群落3 大類［32］。

最近的研究發(fā)現(xiàn)在土壤［33－34］和海洋［5，13］生態(tài)系統(tǒng)中AOA 的amoA 豐富度通常遠(yuǎn)高于AOB 的amoA，Gannes等［35］在熱帶地區(qū)堆肥系統(tǒng)的研究中也證實(shí)了該結(jié)論。然而也有研究發(fā)現(xiàn)在微好氧條件下的海灣底泥中AOB 數(shù)量高于AOA［36］。2012年Yamamoto等［26］通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR，在牛糞、雞糞、豬糞三種糞便堆肥過(guò)程中檢測(cè)到AOB 數(shù)量明顯高于AOA，表明在動(dòng)物糞便堆肥過(guò)程中，AOB可能比AOA 分布更廣泛。由此可見(jiàn)，AOA 廣泛存在于不同生態(tài)系統(tǒng)中，對(duì)自然界中氨的氧化具有重要作用，但不同生態(tài)系統(tǒng)中AOA 和AOB的分布存在差異。

此外，Yamamoto等［37］利用16srRNA 序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)在牛糞堆肥過(guò)程中分離出的AOA 與豬糞、雞糞堆肥過(guò)程分離的Candidatus Nitrososphaera相似性高達(dá)99%，PCR－DGGE 表明牛糞堆肥過(guò)程中的AOA 明顯多于豬糞和雞糞堆肥，但Yamada等［38］2013年在銨含量較高的牛糞堆肥過(guò)程中卻未能檢測(cè)到AOA。

解開(kāi)治等［39］在雞糞好氧堆肥中發(fā)現(xiàn)總氮、亞硝態(tài)氮和硝態(tài)氮對(duì)AOA 群落結(jié)構(gòu)的演替影響顯著。

盡管環(huán)境中存在大量的AOA，但由于其在實(shí)驗(yàn)室條件下難培養(yǎng)，目前只有少數(shù)AOA 菌群被鑒定出來(lái)，因此其生理生態(tài)學(xué)特性還有待進(jìn)一步研究。

2 堆肥過(guò)程理化指標(biāo)對(duì)氨氧化微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

堆肥過(guò)程一般分為升溫階段、高溫階段、降溫階段和腐熟階段4個(gè)階段［40］，每一階段堆肥的溫度、銨濃度、pH 等理化指標(biāo)都存在顯著差異，而堆肥中微生物的組成和群落結(jié)構(gòu)與這些理化指標(biāo)密切相關(guān)。孫志遠(yuǎn)［24］在牛糞堆肥過(guò)程中對(duì)氨氧化細(xì)菌數(shù)量與牛糞堆肥理化參數(shù)分析表明，堆體溫度、氨態(tài)氮和硝態(tài)氮對(duì)氨氧化細(xì)菌數(shù)量有著顯著影響；虞泳等［25］在秸稈等農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中基于手動(dòng)選擇的RDA 分析結(jié)果也表明，堆體溫度、NH4＋－N 和NO3－－N 對(duì)AOB群落演替有著顯著的影響（P＜0.05），且前兩個(gè)因子達(dá)到了極顯著水平（P＜0.01）。可見(jiàn)，有機(jī)廢棄物堆肥過(guò)程中堆體物料理化性質(zhì)的改變會(huì)影響AOA 和AOB 的種類和群落結(jié)構(gòu)，這些參數(shù)的有效控制對(duì)有機(jī)廢棄物好氧堆肥過(guò)程中氨氧化微生物活性的調(diào)控具有重要的意義。

2.1 溫度

溫度是影響微生物生長(zhǎng)和生存的最主要的環(huán)境因素之一［41］，對(duì)堆肥體系中氨氧化微生物種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生重要影響。Yamamoto［26］研究發(fā)現(xiàn)，在牛糞堆肥中AOB 的群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了明顯變化，在高溫階段（＞60 ℃），Nitrosomonas europaea cluster為優(yōu)勢(shì)菌群，在溫度降低時(shí)則出現(xiàn)了Nitrosomonas spp.Cluster；AOA 菌群則在溫度降低時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)，且AOA 的amoA 基因數(shù)為3.2～3.9×107，明顯高于AOB的amoA 基因數(shù)2.2～3.2×106；通過(guò)16s rRNA 序列進(jìn)行同源性分析發(fā)現(xiàn)，牛糞堆肥中AOA的基因序列與土壤及沉淀物中的AOA 相似。

在稻草秸稈和蔬菜葉混合的農(nóng)業(yè)固體廢棄物堆肥中［42］，全程都能檢測(cè)到AOA 的amoA 基因，且AOA 在高溫和降溫階段占主導(dǎo)地位；AOB 的amoA 基因則在高溫和降溫階段下降到不能檢出。此外，AOA 和AOB的amoA 基因豐富度與潛在的氨氧化作用都存在線性相關(guān)性，AOB在中溫和腐熟階段與氨氧化作用存在顯著線性相關(guān)，說(shuō)明在堆肥過(guò)程中AOA 和AOB 都非常活躍的參與了堆肥過(guò)程的硝化作用。虞泳在秸稈等農(nóng)業(yè)廢物好氧堆肥中發(fā)現(xiàn)AOB 群落的Shannon－Weaver指數(shù)初始值為2.58，堆肥結(jié)束時(shí)為2.02，多樣性整體呈下降趨勢(shì)，通過(guò)對(duì)部分優(yōu)勢(shì)條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，AOB群落結(jié)構(gòu)在堆肥高溫期前期（4～9d）變化較小，而在高溫期后期（9～12d）特別是降溫期（12～25d）演替尤為劇烈［25］。由此可見(jiàn)堆肥過(guò)程中溫度對(duì)AOA 和AOB的群落組成和動(dòng)態(tài)變化有很大影響，但在不同堆肥系統(tǒng)中高溫和低溫階段AOA 和AOB 的群落組成存在差異，這可能與不同堆肥系統(tǒng)中銨離子濃度、pH、C／N 等有差異有關(guān)。

2.2 銨離子濃度

銨作為氨氧化微生物的間接底物，其濃度與氨氧化微生物的數(shù)量和種類有直接關(guān)系［43］，Burrell［44］的研究表明，不同銨離子濃度的氨氧化菌富集培養(yǎng)物樣品中檢測(cè)出不同的氨氧化菌種屬，且在牛糞［24］、秸稈［45］等農(nóng)業(yè)廢棄物好癢堆肥的研究都表明在有機(jī)廢棄物好氧堆肥中氨氮對(duì)AOB 群落結(jié)構(gòu)的演替達(dá)到顯著水平。

有研究發(fā)現(xiàn)高濃度銨態(tài)氮具有抑制嗜溫硝化古菌同化CO2的能力，說(shuō)明高濃度銨態(tài)氮可能抑制氨氧化能力［46］。Yamada［38］在銨態(tài)氮含量較高的牛糞堆肥中的各個(gè)階段都檢測(cè)不到AOA，但在中溫階段能檢測(cè)到豐富的AOB；孫志遠(yuǎn)［24］在牛糞堆肥中同樣也證實(shí)了AOA 的存在，不過(guò)只在堆肥后期發(fā)現(xiàn)有該菌的存在，這種現(xiàn)象可能是堆肥其它時(shí)期中銨態(tài)氮的含量較高造成的，所獲得的AOA amoA 基因序列都屬于泉古菌門（Crenarcharota），AOA 群落結(jié)構(gòu)比較單一；Di等［47］研究AOA 和AOB 在不同土壤氮條件下的生長(zhǎng)情況時(shí)發(fā)現(xiàn)AOB 可以在高銨離子濃度的土壤中生長(zhǎng)，而AOA 適于在較低銨離子濃度的土壤中生長(zhǎng)，說(shuō)明AOB 對(duì)銨離子濃度的適應(yīng)范圍較AOA 的適應(yīng)范圍廣。

此外，在處理豬廢水的濕地中，AOB 的數(shù)量與NH4＋和NO3－ 的濃度具有很高的相關(guān)性［48］，在高鈣草原土壤中銨態(tài)氮濃度的升高會(huì)顯著促進(jìn)AOA的amoA 基因表達(dá)量［29］，稻田土壤中氮肥的施用也會(huì)顯著促進(jìn)AOA 的生長(zhǎng)和表達(dá)活性［49］，但也有研究發(fā)現(xiàn)在長(zhǎng)期施用氮肥的堿性砂質(zhì)土壤或高氮草原土壤中，AOA 的豐富度和活性并沒(méi)有隨銨態(tài)氮濃度的升高而增加，而AOB的數(shù)量和活性不僅與土壤硝化活性正相關(guān)，而且隨土壤銨態(tài)氮濃度的升高而升高［50］。說(shuō)明銨態(tài)氮濃度會(huì)影響到土壤生態(tài)系統(tǒng)中AOA和AOB的群落結(jié)構(gòu)和活性，且銨態(tài)氮濃度較高的生態(tài)系統(tǒng)中AOB對(duì)硝化作用的貢獻(xiàn)可能更大。

大量研究表明在牛糞堆肥過(guò)程中能同時(shí)檢測(cè)到AOA 和AOB［23，26，38］，為研究它們的生物學(xué)特性，Oishi進(jìn)行了液態(tài)牛糞堆肥發(fā)酵試驗(yàn)［51］，在不同溫度（37 ℃、46 ℃、60 ℃）和不同氨濃度（0.5、1、4和10mM NH4＋－N）下觀測(cè)它們的生長(zhǎng)情況，利用實(shí)時(shí)聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)定AOB和AOA 的生長(zhǎng)速率，研究發(fā)現(xiàn)AOB的最適生長(zhǎng)環(huán)境為37 ℃，4或10mM NH4＋－N，通過(guò)DGGE 和測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群為Nitrosomonas halophila；而AOA 的最適生長(zhǎng)環(huán)境為46 ℃，10 mM NH4＋－N，優(yōu)勢(shì)菌群主要為Candidatus Nitrososphaera gargensis。此研究首次證明AOA 中的優(yōu)勢(shì)菌能在牛糞堆肥過(guò)程中的適度高溫下氧化NH3進(jìn)行生長(zhǎng)。

2.3 pH

有機(jī)廢棄物的堆肥初期pH 變化較明顯，一般認(rèn)為pH 在7.5～8.5時(shí)，可獲得最大堆肥效率，由于堆肥過(guò)程中微生物的群落結(jié)構(gòu)變化是多因素影響的結(jié)果，因此目前較少單純研究堆肥過(guò)程pH 對(duì)AOA 和AOB的影響，一般結(jié)合銨態(tài)氮、硝態(tài)氮等理化指標(biāo)研究。

不過(guò)大量研究發(fā)現(xiàn)在土壤生態(tài)系統(tǒng)中pH 對(duì)AOA 和AOB的群落組成存在影響，雖在不同pH條件下都能檢測(cè)到AOA［27，33，52－53］和AOB［54－55］，但其氨氧化能力可能存在差異。Nicol等［52］在不同土壤pH 對(duì)AOA 和AOB 豐富度、多樣性、轉(zhuǎn)錄活性的研究中發(fā)現(xiàn)，土壤pH 在4.9～7.5的范圍內(nèi)，發(fā)現(xiàn)古菌的amoA 基因豐富度會(huì)隨著pH 的升高而降低，而細(xì)菌的amoA 基因豐富度一直很低，但會(huì)隨著pH 的升高而升高。此外不同pH 下，AOA 和AOB的種群也發(fā)生了變化，這種變化會(huì)影響酸性土壤的硝化作用。

2.4 其它因素

有研究表明在污泥和土壤中，有機(jī)質(zhì)可抑制硝化作用［56－57］，也有研究發(fā)現(xiàn)在污水處理器中有機(jī)質(zhì)可降低硝化速率，影響AOB 的群落結(jié)構(gòu)［58－59］。Yang等［30］在家庭垃圾堆肥的中溫階段加入有機(jī)質(zhì)，發(fā)現(xiàn)添加組的NO2－和NO3－比對(duì)照組低102～103倍，從N 素平衡的角度發(fā)現(xiàn)有機(jī)質(zhì)的降解對(duì)氨氧化有負(fù)面影響，氨氧化細(xì)菌減少，可能是異養(yǎng)型微生物與氨氧化微生物競(jìng)爭(zhēng)O2的原因，但AOB的生長(zhǎng)需要有機(jī)質(zhì)的支撐，所以這些影響機(jī)制需進(jìn)一步討論和研究。此外，有研究發(fā)現(xiàn)海水和淡水中的AOB存在差異［61－62］，說(shuō)明鹽度對(duì)氨氧化細(xì)菌的生長(zhǎng)和生理特性也存在一定影響。

3 堆肥系統(tǒng)中AOA 和AOB 對(duì)氮素轉(zhuǎn)換的作用及調(diào)控

有機(jī)廢棄物堆肥過(guò)程中以氨氣形式損失的氮素所占比例有所不同，它與堆肥過(guò)程中的溫度、pH、含水率、C／N 比等多種理化性質(zhì)密切相關(guān)。研究表明，堆肥過(guò)程中的銨態(tài)氮可使堆肥物料pH 升高并且易以NH3的形式揮發(fā)，特別是在高溫階段或pH較高時(shí)［63－64］。目前雖然可以通過(guò)調(diào)節(jié)pH、改變通風(fēng)或翻堆頻率、添加吸附劑等方式來(lái)調(diào)控堆肥過(guò)程中氮素的轉(zhuǎn)化，但仍然存在很多問(wèn)題，因此很多研究者希望通過(guò)調(diào)節(jié)堆肥過(guò)程中與氮素轉(zhuǎn)化相關(guān)的微生物來(lái)提高堆肥過(guò)程中氮素的保留繼而增加肥效，減少環(huán)境污染。

在農(nóng)業(yè)廢棄物堆肥全過(guò)程中，AOA 和AOB 的amoA 基因豐富度與潛在的氨氧化作用都存在線性相關(guān)［42］。在粘土土壤和市政垃圾堆肥中，與氨氧化作用相關(guān)的微生物的群落和豐富度可以作為土壤硝化能力的指標(biāo)［65］，說(shuō)明氨氧化微生物對(duì)有機(jī)廢棄物堆肥過(guò)程中硝化作用貢獻(xiàn)很大。已有研究表明在牛糞堆肥過(guò)程中經(jīng)過(guò)翻堆處理的堆肥樣品中AOB 種類、數(shù)量明顯多于不翻堆處理的堆肥樣品［24］，在堆肥過(guò)程中若可以通過(guò)改變工藝參數(shù)等方法調(diào)控AOA 和AOB的群落結(jié)構(gòu)，將提高硝化速率，減少氮素的損失。

喻其林［66］在雞糞好氧堆肥中篩選出兩株高效氨氧化霉菌M25～22（Penicillium sp.）與M40～4（Aspergillus sp.），其最適蔗糖濃度分別為12g／L、10g／L，碳源濃度明顯低于通常的霉菌培養(yǎng)基（如查氏培養(yǎng)基）；最適銨態(tài)氮濃度分別為2.438mg／mL、2.014mg／mL，氮源濃度明顯高于通常的霉菌培養(yǎng)基。可見(jiàn)與菌體生長(zhǎng)相比，氨氧化需較低C／N，這與氨氧化本身的作用特點(diǎn)，即低碳源環(huán)境為氨氧化作用提供驅(qū)動(dòng)力，以及銨態(tài)氮是氨氧化的作用底物有關(guān)。將其應(yīng)用到堆肥中，兩種菌劑均能促進(jìn)堆肥中銨態(tài)氮及有機(jī)氮向硝態(tài)氮的轉(zhuǎn)化，降低堆肥氮素?fù)p失；且兩菌劑組中溫度、含水量、pH、C／N 等理化指標(biāo)的變化均有利于堆肥腐熟化的進(jìn)行，有機(jī)質(zhì)的含量與對(duì)照相比偏低，而種子發(fā)芽指數(shù)與對(duì)照相比偏高，說(shuō)明兩者回歸堆肥后，均能促進(jìn)堆肥腐熟。

由于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)采用傳統(tǒng)的細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)都不易獲得AOA 和AOB，所以通過(guò)向堆肥中添加發(fā)酵培養(yǎng)液增加AOA 的種類和數(shù)量以降低氮素?fù)p失的研究是一個(gè)非常值得探討研究方向。解開(kāi)治等［67］通過(guò)向家禽糞便堆肥過(guò)程添加在污泥中擴(kuò)培養(yǎng)的AOA 接種液（1.0×109CFU／mL），發(fā)現(xiàn)能加快高溫階段進(jìn)程，縮短堆肥腐熟的時(shí)間，在堆肥初始階段能顯著促進(jìn)硝化作用，在低溫階段pH 比對(duì)照組低，有助于氮的保存。試驗(yàn)組氨氣揮發(fā)量和氧化亞氮的排放量分別為對(duì)照組的14.7%和4.2%，說(shuō)明通過(guò)添加AOA 可以降低氮以氣體的形式損失。通過(guò)添加AOA 能顯著增加堆肥初期氨氧化古菌的菌落種類和數(shù)量，但其機(jī)制尚需繼續(xù)研究。

迄今為止，異養(yǎng)氨氧化的報(bào)道不多，對(duì)其氨氧化的特性也有待進(jìn)一步研究。為尋找適用于堆肥的嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，巴頓等［68］采用稀釋涂布平板法和格里斯試劑顯色法篩選嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，從大理洱源熱泉中分離出兩株嗜熱異養(yǎng)氨氧化細(xì)菌，菌株NC8和NJ26，分別為Bacillus屬的不同種，其最適生長(zhǎng)溫度為55 ℃，最適生長(zhǎng)pH 為8.0；在最適生長(zhǎng)條件下，NC8和NJ26菌株對(duì)NH4＋的最大單位體積減少率分別為1033.3mg／L和1183.67mg／L；對(duì)NO2－和NO3－ 最大單位體積產(chǎn)生率分別為23.79 mg／L、272.30 mg／L 和33.81 mg／L、366.70 mg／L。研究表明，NC8和NJ26能將NH4＋氧化成NO2－ 和NO3－，以NO3－為主要積累產(chǎn)物。目前NC8和NJ26還未用于堆肥實(shí)驗(yàn)，有望應(yīng)用于堆肥過(guò)程中以減少氨氣排放，同時(shí)提高堆肥中氮素的含量。

4 研究展望

目前，通過(guò)分子生物學(xué)、宏基因組學(xué)、培養(yǎng)及非培養(yǎng)等方法的結(jié)合，氨氧化微生物的研究在諸多方面已取得重要進(jìn)展。但仍然存在諸多問(wèn)題需要深入地研究和探討，特別是在堆肥系統(tǒng)中的氮素減排的研究：如利用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段檢測(cè)不同堆肥系統(tǒng)中氨氧化微生物的優(yōu)勢(shì)菌群；并進(jìn)一步深入研究在不同堆肥系統(tǒng)和堆肥不同階段中的氨氧化微生物的群落結(jié)構(gòu)變化，以及pH、銨態(tài)氮濃度、氧氣等理化性質(zhì)對(duì)氨氧化微生物的影響，及其與其它微生物群落的互作關(guān)系。此外，氨的揮發(fā)主要在堆肥高溫階段，是否能分離、篩選不同生態(tài)環(huán)境中的耐高溫的氨氧化微生物或直接從堆肥系統(tǒng)中提取擴(kuò)增優(yōu)勢(shì)菌群以減少氮素?fù)p失？研究堆肥過(guò)程中氨氧化機(jī)制與反硝化機(jī)制的聯(lián)系，是否在增強(qiáng)氨氧化微生物硝化作用的同時(shí)也減少了N2O 的排放，從而增加了氮素的保留和堆肥肥效？這些問(wèn)題都需要利用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法進(jìn)一步研究解決，以增強(qiáng)氨氧化微生物在堆肥系統(tǒng)和其它氮素循環(huán)相關(guān)領(lǐng)域的利用。

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