血管性癡呆腎虛證與蛋白指紋圖譜的相關(guān)性研究＊

江 敏，朱愛蘭，楊梅玉，趙素萍，吳松鷹（福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院：.中心實(shí)驗(yàn)室；.腦病科，福州 350003）

血管性癡呆患者占所有癡呆患者的10%～50%，是國(guó)內(nèi)老年人的多發(fā)病和常見?。?］。血管性癡呆的病因包括缺血性、出血性腦血管病以及急、慢性缺氧性腦病等腦血管病，其中缺血性腦血管病是引起血管性癡呆的主要原因。本研究以對(duì)照研究的方法，采用基于表面增強(qiáng)激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI－TOF－MS）的比較蛋白質(zhì)組分析技術(shù)，初步構(gòu)建了腦梗死后具有不同證候特征的血管性癡呆患者的蛋白指紋圖譜及其辨證診斷模型，旨在從蛋白質(zhì)水平揭示血管性癡呆的物質(zhì)基礎(chǔ)，為中醫(yī)證候的客觀化、規(guī)范化研究提供思路，推進(jìn)中醫(yī)辨證向客觀化、規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的方向發(fā)展。

1 資料與方法

1.1 一般資料 于福建省第二人民醫(yī)院就診的腦梗死后繼發(fā)血管性癡呆的患者47例，所有患者均符合美國(guó)國(guó)立神經(jīng)系統(tǒng)疾病與卒中研究所和瑞士神經(jīng)科學(xué)研究國(guó)際協(xié)會(huì)（NINDSAIREN）制定的血管性癡呆診斷標(biāo)準(zhǔn)，其中腦血管病的診斷符合1995年第四次全國(guó)腦血管學(xué)術(shù)會(huì)議制定的腦血管病診斷標(biāo)準(zhǔn)。患者均經(jīng)頭顱CT和（或）MRI檢查確診；發(fā)病前無肯定記憶及情感異常，神志清楚，無明顯語(yǔ)言障礙，能配合完成各項(xiàng)量表的調(diào)查；Hachinski缺血評(píng)分（HIS評(píng)分）≥7分；簡(jiǎn)易精神狀況檢查評(píng)分（MMSE評(píng)分）提示有認(rèn)知損害，其中未接受學(xué)校教育者（文盲）評(píng)分不超過17分，接受學(xué)校教育的年限不超過6年者（小學(xué)文化程度）評(píng)分不超過20分，接受學(xué)校教育超過6年者（中學(xué)或以上文化程度）評(píng)分不超過24分。排除有意識(shí)障礙、失語(yǔ)者，文盲、嚴(yán)重視力或聽力障礙、既往有精神病史、大量飲酒或?yàn)E用藥物、頭顱創(chuàng)傷及其他在發(fā)病前已存在或疑似存在認(rèn)知障礙的患者，抑郁癥患者，HIS＜4分且診斷為阿爾茨海默?。ˋD）的患者，診斷為血管性癡呆但腎虛證候得分小于7分的非腎虛型患者，合并嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能障礙及重度內(nèi)分泌疾病、重度感染性疾病等其他疾病的患者，臨床資料不完善或數(shù)據(jù)不可靠的患者。納入的47例患者中，男24例、女23例，年齡59～85歲，平均73.2歲；按2002年頒布的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中關(guān)于腎虛證的診斷標(biāo)準(zhǔn)，將47例血管性癡呆患者按腎虛證與非腎虛證分為兩組，其中腎虛證組患者30例，男14例、女16例，年齡63～81歲，平均74.3歲，非腎虛證患者17例，男10例、女7例，年齡59～85歲，平均70.8歲。同期于本院體檢健康者13例納入對(duì)照組，男7例、女6例，年齡58～83歲，平均72.5歲。各研究組間受試對(duì)象年齡分布、性別構(gòu)成等一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 美國(guó)Ciphergen Biosystems公司生產(chǎn)的Protein Biology System（PBSⅡc）型質(zhì)譜分析儀、蛋白芯片閱讀儀及配套試劑，美國(guó)Ciphergen Biosystems公司生產(chǎn)的CM10型蛋白質(zhì)芯片及芥子酸（SPA）試劑。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本收集與預(yù)處理 采集患者及健康者外周血后立即放入4℃冰箱靜置30min；經(jīng)高速低溫離心后，在冰塊上將分離的血清標(biāo)本快速轉(zhuǎn)移至新的離心管中，并立即放入－70℃冰箱保存待測(cè)。標(biāo)本測(cè)試前，將血清標(biāo)本置4℃冰箱中待其完全融化，4℃條件下12 000r／min離心10min；吸取3μL血清標(biāo)本加入6μL的緩沖液｛9mol／L的尿素，2%的3－［（3－膽酰胺基丙基）二甲基銨基］－1－丙磺酸鹽（CHAPS），50mmol／L的三－（羥甲 基）氨 基 甲 烷 鹽 酸 （Tris－HCL），1% 的 二 硫 蘇 糖 醇（DTT），pH9.0｝混勻；冰浴振蕩30min，期間每隔5min用手指輕彈混勻1次；向9μL稀釋標(biāo)本中加入108μL醋酸鈉（NaAc）緩沖液（50mmol／L的 NaAc，pH4.0），振蕩器上混勻待用。

1.3.2 芯片預(yù)處理、上樣和洗脫 將芯片安裝于加樣器內(nèi)，并將200μL醋酸鈉緩沖液加于芯片之中，振蕩5min，棄去緩沖液后重復(fù)上述操作1次；向每個(gè)加樣孔中加入100μL稀釋血清標(biāo)本，室溫振蕩孵育1h；棄去未結(jié)合的血清標(biāo)本，每孔加入200μL醋酸鈉緩沖液，振蕩5min，棄去緩沖液后重復(fù)上述操作1次；每孔加入200μL高效液相色譜（HPLC）專用水，立刻棄去；卸下加樣器，待芯片表面自然晾干后，每點(diǎn)各加飽和SPA 2次，每次0.5μL，2次點(diǎn)樣之間需待芯片表面風(fēng)干后再次點(diǎn)樣。

1.3.3 芯片檢測(cè)、數(shù)據(jù)采集和參數(shù)設(shè)置 采用PBS－Ⅱc型蛋白芯片閱讀儀讀取信息，用加有 All－in－one標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的NP20芯片校正儀器至0.1%范圍內(nèi)。芯片閱讀儀參數(shù)設(shè)置如下：激光強(qiáng)度175，檢測(cè)靈敏度8，優(yōu)化范圍2 000～10 000，最高相對(duì)分子質(zhì)量50 000，芯片上的每個(gè)點(diǎn)采集130次。用Ciphergen Protein Chip 3.1.1軟件收集數(shù)據(jù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 （1）指紋圖譜標(biāo)準(zhǔn)化：用總離子流校正所有圖譜，即假定建模所用的所有血清標(biāo)本蛋白指紋圖譜的總離子流是相同的，根據(jù)此假設(shè)對(duì)每個(gè)圖譜的每個(gè)蛋白峰的峰值做相應(yīng)的調(diào)整，以減少不同芯片、儀器狀態(tài)波動(dòng)等因素引起的試驗(yàn)誤差。（2）用Biomarker Wizard軟件快速計(jì)算相同質(zhì)荷比的蛋白峰值在腎虛證患者與非腎虛證患者之間的比較差異。選擇信噪比（S／N）＞8和在所有圖譜中出現(xiàn)頻率超過10%的峰作為有效蛋白峰。為避免遺漏小的蛋白峰，將S／N＞5和相對(duì)分子質(zhì)量偏差小于0.5%的峰也標(biāo)記為有效蛋白峰。再根據(jù)方差分析的原理計(jì)算總圖譜內(nèi)兩組患者間相同質(zhì)荷比蛋白表達(dá)差異的P值（以Excel表輸出差異蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量和相對(duì)強(qiáng)度）。（3）中醫(yī)辨證診斷模型的建立和驗(yàn)證：采用Biomarker Wizard軟件，對(duì)腦梗死后發(fā)生血管性癡呆的47例患者血清標(biāo)本與13健康者的血清標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行初步的聚類和峰值分析，獲得腦梗死后發(fā)生血管性癡呆患者和健康者的差異性蛋白峰。在此基礎(chǔ)上，利用數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)一步分析腎虛證組血管性癡呆患者與非腎虛證組血管性癡呆患者蛋白組分變化，從而為構(gòu)建血管性癡呆蛋白指紋圖譜的辨證診斷模型提供依據(jù)。

2 結(jié) 果

對(duì)腦梗死后發(fā)生血管性癡呆的患者與健康者的血清蛋白圖譜結(jié)果比對(duì)，采用Biomarker Wizard軟件進(jìn)行初步聚類和峰值分析后，共捕獲166個(gè)蛋白峰，其中25個(gè)不同質(zhì)荷比的蛋白峰在腦梗死后發(fā)生血管性癡呆的患者與健康者中的表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其質(zhì)荷比的最低值為1 061.308，最高為44 899.64。在25個(gè)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白中，4個(gè)在血管性癡呆患者中高表達(dá)，21個(gè)為低表達(dá)。對(duì)血管性癡呆腎虛證患者與非腎虛證患者的血清蛋白圖譜結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，采用Biomarker Wizard軟件進(jìn)行初步聚類和峰值分析后，發(fā)現(xiàn)15個(gè)不同質(zhì)荷比的蛋白峰在血管性癡呆腎虛證患者與非腎虛證患者中的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其質(zhì)荷比最低值為1 010.592，最高為43 860.86。在15個(gè)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白中，10個(gè)在血管性癡呆腎虛證患者中高表達(dá)，5個(gè)為低表達(dá)。質(zhì)荷比為4 656.02和11 096.46的兩個(gè)蛋白峰的表達(dá)量，在患者、健康者之間及不同癥候型患者間的比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其余蛋白峰則無此表現(xiàn)。血管性癡呆腎虛組患者與非腎虛組患者的蛋白峰相對(duì)強(qiáng)度的部分蛋白聚類差異圖也顯示，這部分蛋白峰對(duì)患者的分組具有意義。

3 討 論

血管性癡呆的發(fā)生、發(fā)展與證候密切相關(guān)，臨床工作中準(zhǔn)確把握證候的實(shí)質(zhì)有助于有效地為患者擬方用藥。1990年全國(guó)中醫(yī)學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)會(huì)和內(nèi)科學(xué)會(huì)制定的《老年呆病的診斷、辨證分型及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)》及2002年版的《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則》中，關(guān)于癡呆的中醫(yī)辨證分型均包括髓海不足、肝腎虧虛、脾腎兩虛及腎虛髓減的腎虛相關(guān)證型，2002年由中國(guó)中醫(yī)藥學(xué)會(huì)內(nèi)科延緩衰老專業(yè)委員會(huì)制定的《血管性癡呆診斷、辨證及療效評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)（研究用）》更明確提出了腎虛的證候名。目前辨證分型的依據(jù)仍然依靠全身癥狀、舌脈等主觀指標(biāo)，其內(nèi)容也多是以醫(yī)生及患者的主觀感覺為依據(jù)，缺乏必要的實(shí)驗(yàn)室客觀依據(jù)。對(duì)血管性癡呆的研究多從某個(gè)指標(biāo)或某方面的指標(biāo)入手，無法反映血管性癡呆中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。辨證首重虛實(shí)，虛以腎虛為特征，實(shí)以痰濁、淤血、火熱為表象［2］，在年老患者中，常同時(shí)存在氣血陰陽(yáng)的虛衰，有時(shí)甚至常被痰、瘀等標(biāo)實(shí)的證候所掩蓋而影響辨證［3］。因此，利用現(xiàn)代科技手段進(jìn)行中醫(yī)證候的客觀化研究對(duì)指導(dǎo)臨床辨證和施治具有重要意義。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，有學(xué)者提出把中醫(yī)的證當(dāng)作疾病一定階段某一特定狀態(tài)下表達(dá)的蛋白質(zhì)組功能的總和，證的本質(zhì)可以認(rèn)為是患者個(gè)體基因型及其表達(dá)結(jié)果，從而提出了證候基因?qū)W和證候蛋白質(zhì)組學(xué)理論。證候蛋白質(zhì)組學(xué)理論從蛋白質(zhì)水平探討中醫(yī)證型分類的基因表型、蛋白質(zhì)表型，通過收集、整理各種證的蛋白質(zhì)組學(xué)特異性指標(biāo)，最終闡明中醫(yī)證的實(shí)質(zhì)、證的辯治及證的演變規(guī)律等。

蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)細(xì)胞或組織（包括體液）中的蛋白質(zhì)的種類及數(shù)量進(jìn)行分析的新興學(xué)科［4－5］。蛋白質(zhì)組學(xué)以細(xì)胞內(nèi)所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律為研究對(duì)象，能提供更多的生命信息，可在更深入、更貼近生命本質(zhì)層次基礎(chǔ)之上發(fā)現(xiàn)和理解生命活動(dòng)規(guī)律以及重要生理、病理學(xué)的本質(zhì)，為后基因時(shí)代的生命科學(xué)研究開辟了新的天地，是后基因時(shí)代生命科學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域［6］。SELDI－TOF－MS綜合采用了蛋白芯片和質(zhì)譜分析技術(shù)，可直接從蛋白質(zhì)種類及數(shù)量的變化層面探討疾病的發(fā)生過程，有助于對(duì)包括血清、組織等在內(nèi)的大批量臨床標(biāo)本進(jìn)行高效分析，使尋求用于臨床診斷的特異、敏感的生物學(xué)標(biāo)志物成為可能［7］。

SELDI技術(shù)在疾病的診療、防治方面有著廣泛的應(yīng)用前景［8］。各種人類疾病都有特征性的蛋白質(zhì)指紋圖譜的動(dòng)態(tài)變化，在疾病的不同階段（不同的證候），蛋白質(zhì)水平可能已經(jīng)發(fā)生了變化，尤其是隨著疾病的不斷進(jìn)展，患者體內(nèi)蛋白質(zhì)的表達(dá)也在不斷地發(fā)生變化［9］。因此，將SELDI質(zhì)譜技術(shù)應(yīng)用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域，可以獲得大量、完善、動(dòng)態(tài)的蛋白質(zhì)指紋圖譜，并能反映疾病治療前后或治療過程中患者體內(nèi)蛋白質(zhì)的變化，能夠?yàn)樵\斷學(xué)和治療學(xué)的理論和應(yīng)用基礎(chǔ)研究奠定更為堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)［10］。

本研究采用SELDI－TOF－MS技術(shù)對(duì)47例腦梗死后發(fā)生血管性癡呆的患者及13例健康者進(jìn)行了血清蛋白質(zhì)分析，并采用Biomarker Wizard軟件對(duì)所捕獲到的166個(gè)蛋白峰進(jìn)行了初步聚類分析，發(fā)現(xiàn)25個(gè)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的質(zhì)荷比峰值（P＜0.05），其中質(zhì)荷比最低值為1 061.308，最高為44 899.64。在25個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白中，4個(gè)在血管性癡呆患者中高表達(dá)。通過血管性癡呆腎虛證患者和非腎虛證患者間的比較，則發(fā)現(xiàn)15個(gè)不同質(zhì)荷比的蛋白峰在血管性癡呆腎虛證患者與非腎虛證患者中的表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中質(zhì)荷比最低值為1 010.592，最高為43 860.86。在15個(gè)表達(dá)量具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的蛋白中，10個(gè)在血管性癡呆腎虛證患者中為高表達(dá)，5個(gè)為低表達(dá)。在患者與健康者之間及不同證候患者之間的兩次比較中，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)蛋白峰（質(zhì)荷比分別為4 656.02、11 096.46）都出現(xiàn)了，其余蛋白峰則無此表現(xiàn)。質(zhì)荷比為4 656.02的蛋白峰在健康者中的表達(dá)水平高于其在血管性癡呆患者中的表達(dá)水平，在血管性癡呆非腎虛證患者中的表達(dá)水平又高于其在腎虛證患者中的表達(dá)水平。然而，質(zhì)荷比為11 096.46的蛋白峰則恰恰相反，其在血管性癡呆患者中的表達(dá)水平高于在健康者中的表達(dá)水平，在腎虛證患者中的表達(dá)水平又高于非腎虛證患者。由此可見，聯(lián)合應(yīng)用質(zhì)荷比為4 656.02和11 096.46的兩個(gè)蛋白峰建立的辯證診斷模型，可用于血管性癡呆腎虛證型與非腎虛證型的鑒別，并且具有較高的敏感性和特異性，也具有一定的臨床診斷意義。

本研究的不足之處：（1）因經(jīng)費(fèi)、時(shí)間等原因，本研究涉及的患者例數(shù)有限，且未對(duì)血清標(biāo)本中表達(dá)水平存在差異的相關(guān)蛋白進(jìn)行分離及鑒定，僅為臨床初探性研究，若增加患者例數(shù)后進(jìn)行更為深入的分析，能夠提高針對(duì)標(biāo)志物的分析準(zhǔn)確性。（2）對(duì)于不同的標(biāo)本，根據(jù)檢測(cè)的目標(biāo)不同采取不同類型的芯片捕獲方式，理論上可以捕獲所有的相同性質(zhì)的蛋白質(zhì)，但實(shí)際上仍有少量的蛋白質(zhì)分子未能與表面探針相結(jié)合。使用SELDI－TOF－MS系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)，僅能提供蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量，無法提供詳細(xì)的C端、N端的氨基酸序列，也無法確定蛋白質(zhì)的構(gòu)型，因此需要將蛋白質(zhì)充分純化后，用蛋白酶消化點(diǎn)樣于芯片上的蛋白質(zhì)，通過分析肽段，并結(jié)合生物信息學(xué)方法對(duì)氨基酸序列進(jìn)行鑒定［11］。除此之外，SEDLI－TOF－MS系統(tǒng)還存在以下缺陷：（1）并非所有的蛋白質(zhì)都能被同等顯示，相對(duì)分子質(zhì)量小于30 000的蛋白質(zhì)可被有效檢測(cè)，但對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量大于30 000的蛋白質(zhì)，其檢測(cè)靈敏度明顯下降。（2）由于不同蛋白質(zhì)的濃度相差巨大，高濃度蛋白質(zhì)的出現(xiàn)干擾了低濃度蛋白質(zhì)的定量和定性檢測(cè)，因此有必要解決如何將高濃度蛋白質(zhì)通過有效的預(yù)先分離，從而更好地檢測(cè)低濃度蛋白質(zhì)的問題。（3）蛋白質(zhì)峰強(qiáng)度某些情況下受蛋白質(zhì)與芯片結(jié)合力強(qiáng)弱的影響，也很難依此進(jìn)行蛋白質(zhì)的準(zhǔn)確定量。（4）雖然SELDI系統(tǒng)是一種高通量技術(shù)，但多數(shù)操作步驟均需人工完成，包括標(biāo)本的儲(chǔ)存、處理及緩沖液的配制、參數(shù)的設(shè)定等，難免有較大的人為因素影響檢測(cè)結(jié)果。（5）標(biāo)記物蛋白質(zhì)仍然需要可靠性及準(zhǔn)確性更高的串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行鑒定。（6）設(shè)備、耗材及分析軟件等費(fèi)用均較昂貴，且質(zhì)譜分析需要大量后續(xù)工作的支持，限制了該技術(shù)的進(jìn)一步推廣應(yīng)用［12－14］。

綜上所述，本研究顯示利用SELDI－TOF－MS技術(shù)能夠?yàn)橹嗅t(yī)證候的客觀化、規(guī)范化研究提供思路，推進(jìn)中醫(yī)辨證向客觀化、規(guī)范化和標(biāo)準(zhǔn)化的方向發(fā)展。

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