我國(guó)豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的替代方法研究與應(yīng)用進(jìn)展

張占龍,宋永鴻,李 敏,李梅霞

(1.青海省化隆縣畜牧局，青海 化隆 810900;2.青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810003；3.青海省貴南縣過(guò)馬營(yíng)鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,青海 貴南 813101)

我國(guó)豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的替代方法研究與應(yīng)用進(jìn)展

張占龍1,宋永鴻2,李 敏3,李梅霞2

(1.青海省化隆縣畜牧局，青海 化隆 810900;2.青海省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，青海 西寧 810003；3.青海省貴南縣過(guò)馬營(yíng)鄉(xiāng)畜牧獸醫(yī)站,青海 貴南 813101)

我國(guó)獸藥典中現(xiàn)行的豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)方法存在試驗(yàn)成本較高、周期較長(zhǎng)、操作較繁瑣、重復(fù)性較差、敏感性較低等缺點(diǎn)，隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的日臻發(fā)展與應(yīng)用，豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的新興替代檢驗(yàn)方法不斷發(fā)展和完善。論文就我國(guó)近年來(lái)針對(duì)豬瘟疫苗毒種、半成品、成品效力檢驗(yàn)的新興分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究與應(yīng)用進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述，旨在為提升我國(guó)豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)水平提供合理的科學(xué)依據(jù)。

豬瘟疫苗；效力檢驗(yàn)；替代方法；研究與應(yīng)用

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病。豬瘟在世界范圍內(nèi)流行，每年給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]，該病被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織列為A類(lèi)烈性傳染病，被我國(guó)農(nóng)業(yè)部列為一類(lèi)動(dòng)物疫病，是目前阻礙著我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展的首要?jiǎng)游镆卟3-4]。我國(guó)采用豬瘟兔化弱毒疫苗(C株)強(qiáng)制免疫接種為主要防治措施，使豬瘟在我國(guó)得到了有效控制，豬瘟頻發(fā)的大流行狀況已得到根除[5]，但近年來(lái)，我國(guó)豬瘟疫苗免疫失敗的病例逐漸增多，周期性、波浪式的地區(qū)散發(fā)性流行日益嚴(yán)重[6]。導(dǎo)致疫苗免疫失敗的原因很復(fù)雜，除了免疫程序不合理、母源抗體的干擾等原因外,疫苗效力達(dá)不到要求是其中一個(gè)重要原因[7]。由于豬瘟病毒不易產(chǎn)生細(xì)胞病變，因此獸藥典中對(duì)其抗原病毒含量或疫苗效力檢驗(yàn)主要依靠家兔或豬進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)[8]，因用豬進(jìn)行檢驗(yàn)成本太高、試驗(yàn)操作難度太大、周期太長(zhǎng)，故在生產(chǎn)實(shí)際中多采用兔體定型熱反應(yīng)方法，該方法仍然存在試驗(yàn)周期較長(zhǎng)、操作較繁瑣、重復(fù)性較差、敏感性較低等缺點(diǎn)，且受試驗(yàn)動(dòng)物的個(gè)體差異、環(huán)境因素等多方面原因影響，檢測(cè)結(jié)果不是十分準(zhǔn)確。隨著分子生物學(xué)與免疫學(xué)技術(shù)的日臻發(fā)展與應(yīng)用，豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的新興替代檢驗(yàn)方法不斷發(fā)展和完善。本文就我國(guó)近年來(lái)針對(duì)豬瘟疫苗毒種、半成品的效價(jià)檢驗(yàn)和成品疫苗效力檢驗(yàn)的新興分子生物學(xué)和免疫學(xué)檢測(cè)方法的研究與應(yīng)用進(jìn)展做一簡(jiǎn)要綜述，為提升我國(guó)豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)水平提供合理的科學(xué)依據(jù)。

1 qRT-PCR方法

qRT-PCR方法可以對(duì)豬瘟病毒核酸含量進(jìn)行準(zhǔn)確定量，與兔體定型熱反應(yīng)方法相比，具有快速、敏感、高通量和實(shí)時(shí)等優(yōu)點(diǎn)，為豬瘟疫苗毒種、半成品、成品中病毒含量的測(cè)定提供了新的技術(shù)方法。Lin等[9]應(yīng)用qRT-PCR方法對(duì)豬瘟培養(yǎng)細(xì)胞中的病毒含量進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，qRT-PCR方法較免疫熒光方法具有更高的敏感性，且檢測(cè)快速、定量準(zhǔn)確，可以將其用于豬瘟毒種與半成品的生產(chǎn)中確定最佳收毒時(shí)間，從而提高豬瘟疫苗質(zhì)量。陳鍇等[10]建立的定量檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗病毒核酸含量的qRT-PCR方法僅能擴(kuò)增豬瘟兔化弱毒疫苗株，最低可檢測(cè)到4.35個(gè)cDNA拷貝量，該方法與兔體定型熱反應(yīng)同時(shí)對(duì)4個(gè)廠家17個(gè)批次的34份豬瘟疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)，二者表現(xiàn)出了良好的相關(guān)性。葛葉等[11]采用qRT-PCR方法與兔體定型熱反應(yīng)對(duì)5份豬瘟兔化弱毒細(xì)胞苗成品和6份半成品樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，結(jié)果表明qRT-PCR方法檢測(cè)結(jié)果中最低105個(gè)病毒拷貝可以使家兔產(chǎn)生定型熱反應(yīng)，最低103個(gè)病毒拷貝可以使家兔產(chǎn)生輕熱反應(yīng)，qRT-PCR方法的檢測(cè)過(guò)程僅需3.5 h，大大縮短了豬瘟疫苗的檢測(cè)時(shí)間，可以補(bǔ)充傳統(tǒng)的兔體定型熱反應(yīng)用于豬瘟兔化弱毒疫苗半成品與成品的檢驗(yàn)。韓文等[12]利用qRT-PCR方法對(duì)278批次豬瘟疫苗進(jìn)行效力檢驗(yàn)，有66批次(24 %)疫苗病毒含量達(dá)不到獸藥典要求標(biāo)準(zhǔn)，抽取其中6份采用兔體定型熱試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，兩種檢驗(yàn)方法的結(jié)果完全一致，表明qRT-PCR方法可以作為評(píng)價(jià)豬瘟疫苗質(zhì)量的一種替代方法?？傊?，qRT-PCR檢測(cè)方法可以替代傳統(tǒng)的兔體定型熱試驗(yàn)用于疫苗生產(chǎn)過(guò)程中的毒種、半成品的病毒含量測(cè)定，進(jìn)而指導(dǎo)疫苗的配制，也可以用于豬瘟成品疫苗的效力檢驗(yàn)，可成為實(shí)驗(yàn)室和豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)等進(jìn)行豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的敏感、準(zhǔn)確和快速的替代檢驗(yàn)方法。

2 RT-LAMP方法

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP)方法操作簡(jiǎn)單、無(wú)需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀，特別適合基層實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。Zhang等[13]根據(jù)CSFV NS5B 基因序列，利用在線軟件Primer Explorer V4設(shè)計(jì)了針對(duì)CSFV兔化弱毒疫苗株的一套R(shí)T-LAMP引物，建立了可視化檢測(cè)豬瘟兔化弱毒疫苗株的RT-LAMP方法，該方法65 ℃恒溫反應(yīng)1 h 即可完成擴(kuò)增過(guò)程，檢測(cè)CSFV-強(qiáng)毒株、BVDV、PRRSV、PRV、TGEV、PPV、PEDV、PCV-2、PrV均為陰性，檢測(cè)靈敏度與qRT-PCR方法相當(dāng)，均達(dá)到5個(gè)拷貝，應(yīng)用RT-LAMP 方法和qRT-PCR方法對(duì)15個(gè)廠家生產(chǎn)的39個(gè)批次的58份市售豬瘟活疫苗的病毒核酸進(jìn)行了檢測(cè)分析，58份疫苗中有46份經(jīng)兩種方法檢測(cè)均為陽(yáng)性，二者的符合率達(dá)100 %。RT-LAMP方法快速、簡(jiǎn)單、靈敏、無(wú)需特殊儀器設(shè)備，但該方法只能根據(jù)檢測(cè)結(jié)果的渾濁度進(jìn)行病毒含量的定性檢測(cè)，以及陰性、弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性的半定量檢測(cè)，還無(wú)法實(shí)現(xiàn)qRT-PCR方法對(duì)病毒含量的實(shí)時(shí)定量跟蹤檢測(cè)，故其適合用于試驗(yàn)條件一般的基層實(shí)驗(yàn)室。

3 ELISA方法

ELISA方法即可用于測(cè)定抗原，也可用于測(cè)定抗體，具有靈敏、特異、快速、高通量及易于操作等優(yōu)點(diǎn)，在豬瘟抗原病毒含量的測(cè)定和豬瘟抗體效價(jià)的測(cè)定中得到了廣泛開(kāi)發(fā)應(yīng)用。在抗原定量檢測(cè)方面，唐紅慧等[14]應(yīng)用進(jìn)口豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒對(duì)已做過(guò)兔體定型熱反應(yīng)和qRT-PCR檢測(cè)的8個(gè)批次豬瘟成品細(xì)胞苗和13個(gè)批次豬瘟成品脾淋苗進(jìn)行抽檢測(cè)定其抗原含量，ELISA方法可檢出20頭份/瓶(或者109個(gè)病毒拷貝數(shù)/瓶)及以上的成品疫苗；該試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)測(cè)定4個(gè)批次24份HCLV半成品細(xì)胞苗的抗原含量，二種方法的符合率高達(dá)95.8 %，但該方法無(wú)法區(qū)分豬瘟病毒抗原與牛流行性腹瀉病毒抗原。肖鋒等[15]研究也表明進(jìn)口豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒能夠穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)單地用于CSFV病毒含量測(cè)定。豬瘟ELISA抗原定量檢測(cè)方法能夠穩(wěn)定、快速、簡(jiǎn)單地用于豬瘟細(xì)胞苗的半成品與成品的病毒含量測(cè)定，幫助篩選疫苗生產(chǎn)過(guò)程中不同滴度的病毒液，確定最佳收毒時(shí)間和階段，為豬瘟疫苗生產(chǎn)和質(zhì)量控制提供了一種準(zhǔn)確和穩(wěn)定的定量檢測(cè)方法。在抗體效價(jià)測(cè)定方面，李嬌等[16]建立了豬瘟抗體的PPA-ELISA檢測(cè)方法，該方法以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記葡萄球菌A蛋白(SPA)為二抗，SPA能與豬、兔等哺乳動(dòng)物血清IgG的Fc段結(jié)合，使該方法可應(yīng)用豬瘟疫苗免疫后的豬、兔血清抗體效價(jià)檢測(cè)。蔣卉等[17]采用IDEXX商品化的豬瘟抗體ELISA檢測(cè)試劑盒和兔體定型熱反應(yīng)進(jìn)行豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)，兔體定型熱反應(yīng)與ELISA抗體檢測(cè)結(jié)果具有較高的正相關(guān)性，兩者符合率達(dá)95.83%。雖然ELISA抗體檢測(cè)方法依然采用家兔進(jìn)行效力檢驗(yàn)，但省去了兔體定型熱反應(yīng)方法中每6 h進(jìn)行1次家兔測(cè)溫工作的繁瑣操作，且可以有效地排除體溫檢測(cè)中輕熱反應(yīng)和可疑反應(yīng)帶來(lái)的不確定性，從而提高檢驗(yàn)工作的效率和檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4 IFA方法

間接免疫熒光(Indirect Immunofluorescence Assay，IFA)方法是將免疫學(xué)方法與熒光標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)研究特異性抗原在細(xì)胞內(nèi)分布的方法，在熒光顯微鏡下，熒光素受激發(fā)光的照射可發(fā)出明亮的熒光，從而完成對(duì)抗原的定位以及抗原含量的定量。李晶梅等[18]使用韓國(guó)JBT公司豬瘟單抗作為一抗，熒光素標(biāo)記羊抗鼠IgG為二抗，建立了檢測(cè)豬瘟兔化弱毒的病毒含量(TCID50)的IFA方法，并與兔體反應(yīng)熱法進(jìn)行了比較，證明兩者存在一定平行關(guān)系，但I(xiàn)FA方法比兔體反應(yīng)熱法檢測(cè)結(jié)果的數(shù)值低1個(gè)數(shù)量級(jí)左右，IFA方法與兔體定型熱反應(yīng)之間的正向關(guān)系使IFA成為豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的替代方法成為可能。隨后，戴志紅等[19]以豬瘟病毒抗體(兔源)為一抗、熒光素標(biāo)記羊抗兔IgG為二抗，建立了定量檢測(cè)CSFV兔化弱毒株的IFA方法，該方法檢測(cè)CSFV兔化弱毒株接種的PK細(xì)胞為陽(yáng)性，而檢測(cè)PRV、PPV、BVDV接種的PK細(xì)胞均為陰性，并探索得到了IFA方法測(cè)定的TCID50與兔體定型熱反應(yīng)測(cè)定的家兔體感染量(RID)之間的數(shù)量關(guān)系公式：1 RID/mL=(TCID50/0.1 mL+200)/12，IFA方法可作為豬瘟兔化弱毒活疫苗效力檢驗(yàn)的體外替代檢驗(yàn)方法。IFA方法與兔體定型熱反應(yīng)方法相比，具有快速、特異、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，但該方法仍需要采用細(xì)胞培養(yǎng)病毒，與ELISA方法相比，試驗(yàn)難度較高，操作較復(fù)雜，檢驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)。

5 膠體金檢測(cè)方法

膠體金檢測(cè)技術(shù)是一種新興的免疫檢測(cè)技術(shù)，具有方便快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、特異性強(qiáng)、無(wú)需特殊儀器等優(yōu)點(diǎn)，同ELISA方法一樣可用于測(cè)定豬瘟抗原病毒含量和豬瘟抗體效價(jià)。楊明等[20]、李華瑋等[21]先后建立了檢測(cè)豬瘟病毒抗原和豬瘟抗體的膠體金試紙條，將待測(cè)樣品加入試紙條的加樣孔內(nèi)，20 min內(nèi)就可以檢測(cè)出是否帶有豬瘟抗原或豬瘟抗體，同時(shí)還可以根據(jù)試紙條的顏色深淺將檢測(cè)結(jié)果分為陰性、弱陽(yáng)性、中陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性，從而判定豬瘟抗原病毒含量的多少或豬瘟抗體效價(jià)的高低，但目前膠體金檢測(cè)方法僅能夠進(jìn)行定性和半定量檢測(cè)，還無(wú)法達(dá)到qRT-PCR方法和ELISA方法的定量監(jiān)測(cè)分析，且膠體金檢測(cè)技術(shù)只停留在了對(duì)臨床病料中豬瘟抗原和抗體的檢測(cè)，還未見(jiàn)將其應(yīng)用于豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)中的報(bào)道，隨著膠體金檢測(cè)技術(shù)不斷開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，其在豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)中將會(huì)有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。

6 結(jié) 語(yǔ)

我國(guó)研制的豬瘟兔化弱毒疫苗株(C株)的安全性和免疫效力毋庸置疑，但在臨床生產(chǎn)應(yīng)用中的豬瘟弱毒疫苗有的不是正規(guī)廠家生產(chǎn)的，有的未經(jīng)過(guò)嚴(yán)格檢驗(yàn)，有的達(dá)不到規(guī)定效價(jià)，造成了臨床中的免疫失敗。加強(qiáng)豬瘟疫苗的質(zhì)量控制是豬瘟綜合防控的重要步驟，而快速準(zhǔn)確的檢測(cè)豬瘟毒種、半成品、成品疫苗中的病毒含量是生產(chǎn)合格疫苗的有效保證。在豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的這些分子生物學(xué)與免疫學(xué)新興替代檢驗(yàn)方法中qRT-PCR方法和ELISA方法定量準(zhǔn)確，是豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)的首選替代方法，但qRT-PCR方法對(duì)儀器設(shè)備和操作人員要求均較高，基層實(shí)驗(yàn)室和一般豬瘟疫苗生產(chǎn)企業(yè)由于不具備試驗(yàn)條件很難展開(kāi)；ELISA方法操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，且高通量，非常適合大批量樣品的檢測(cè)，適合一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，將具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景；IFA方法需要進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng),操作較繁瑣，且不能準(zhǔn)確定量，在應(yīng)用上受到一定的限制；RT-LAMP和膠體金方法均無(wú)需特殊儀器設(shè)備、肉眼判讀，操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)快速，特別適合基層獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用，但這2種檢測(cè)方法目前只能實(shí)現(xiàn)定性和半定量檢測(cè)。相信隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)技術(shù)的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與應(yīng)用，我國(guó)豬瘟疫苗的這些效力檢驗(yàn)方法必將會(huì)不斷發(fā)展和完善，逐步上升為國(guó)家法定標(biāo)準(zhǔn)，從而全面提高我國(guó)豬瘟疫苗效力檢驗(yàn)水平，保障我國(guó)豬瘟疫苗質(zhì)量。

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ProgressinResearchandApplicationofAlternativeMethodsforEffectiveTestofClassicalSwineFeverVaccineinChina

ZHANG Zhan-Long1,SONG Yong-Hong2,LI Ming3,LI Mei-Xia2

(1.HualongCountyBureauofAnimalHusbandry,Hualong,Qinghai810900,China;2.QinghaiProvincialAnimalDiseasePreventionandControlCenter,Xining,Qinghai810003,China;3.GuomaTownshipAnimalHusbandryandVeterinaryStation,Guinan,Qinghai813101,China)

The current swine fever vaccine efficacy test methods in China's Veterinary Pharmacopoeia have the disadvantages of high cost,long cycling period,complex operation,poor repetition,and low sensitivity.With the application of molecular biology and immunology technology,the alternative test methods for classical swine fever vaccine potency test have undergone continuous development and improvement.This paper briefly reviewed the progress in research and application of classical swine fever vaccine,semi-finished products,new molecular biological and immunological detection methods for testing the effectiveness of the product in China in recent years,aiming to provide a reasonable scientific basis for enhancing the classical swine fever vaccine potency test level in China.

classical swine fever vaccine; efficacy test; alternative methods; research and application

2014-04-17，

2014-05-01

張占龍(1978-)，青?；∪耍究?，研究方向：疾病預(yù)防和控制。E-mail:zhangzhanlong1978@qq.com

S811.6

A

1005-5228(2014)08-0086-04