微流控芯片技術(shù)在心肌標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用綜述

王小英 游 璠 李芳芳 周樹民

(中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院 深圳 518055)

1 引 言

急性心肌梗死(Acute Myocardial Infarction，AMI)、慢性心力衰竭和動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病是嚴(yán)重危害人類健康的常見疾病。心血管檢驗(yàn)是整個(gè)心血管領(lǐng)域中的“瓶頸”學(xué)科，只有在盡可能短的時(shí)間內(nèi)正確診斷疾病，才能及時(shí)有效地將先進(jìn)的治療手段用于臨床，使患者受益。自 50 年代以來，動(dòng)態(tài)測(cè)定一些代謝酶活性，如乳酸脫氫酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等，一直是診斷 AMI 的金標(biāo)準(zhǔn)。但由于這些代謝酶在人體的其他器官和肌肉中也大量存在，除 AMI外，運(yùn)動(dòng)、炎癥也可引起乳酸脫氫酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶等的升高，所以對(duì)他們的檢測(cè)不具有提示患有 AMI 的特異性。近幾年來，一些新的具有高度特異性和敏感性的心肌標(biāo)志物檢測(cè)指標(biāo)被普遍用于臨床實(shí)驗(yàn)室診斷，如心肌肌鈣蛋白T(cTnT)或心肌肌鈣蛋白 I(cTnI)、肌紅蛋白(Myo)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、B 型尿鈉肽(BNP)和超敏 C 反應(yīng)蛋白(CRP)等。正確應(yīng)用這些新的心肌標(biāo)志物，為臨床準(zhǔn)確診斷、鑒別診斷和判斷治療效果起到了革命性的作用。微流控芯片(Microfluidic Chip)技術(shù)作為近年來發(fā)展迅速，集生物、化學(xué)、醫(yī)學(xué)、流體、電子、材料和機(jī)械等于一體的嶄新研究領(lǐng)域，具有液體流動(dòng)可控、消耗試樣和試劑極少、分析速度快和高通量測(cè)試等特點(diǎn)，可以在幾分鐘甚至更短的時(shí)間內(nèi)進(jìn)行上百個(gè)樣品的同時(shí)分析，并且可以在線實(shí)現(xiàn)樣品的預(yù)處理及分析全過程，是進(jìn)行心肌標(biāo)志物檢測(cè)的理想平臺(tái)。隨著即時(shí)診斷(Point-of-Care-Test)概念和需求在臨床應(yīng)用中的發(fā)展，微流控芯片在心肌標(biāo)志物檢測(cè)中的應(yīng)用得到了研究者的廣泛關(guān)注，本文就這一領(lǐng)域作簡(jiǎn)要綜述。

2 微流控芯片光學(xué)方法檢測(cè)心肌標(biāo)志物

目前對(duì)于心肌標(biāo)志物的檢測(cè)，大多是基于抗原抗體的免疫反應(yīng)。生物學(xué)家通常利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原或抗體或酶標(biāo)抗體，然后從反應(yīng)生成物的熒光強(qiáng)度、反應(yīng)底物比色和捕獲化學(xué)發(fā)光底物微光來定量被檢測(cè)物的濃度。底物可見光比色法因靈敏度相對(duì)較低，一般無法滿足低濃度心肌標(biāo)志物的檢測(cè)需求，應(yīng)用較少。而熒光免疫方法因具高靈敏度而被多數(shù)研究者采納。

對(duì)于微流控芯片微米級(jí)的檢測(cè)通道，熒光免疫方法有時(shí)并不能滿足低濃度心肌標(biāo)志物的檢測(cè)要求。為此，Shin 等[1]創(chuàng)造性地設(shè)計(jì)了濃縮熒光標(biāo)記物的反應(yīng)池和嵌入式光電倍增管檢測(cè)裝置，實(shí)現(xiàn)了對(duì) C 反應(yīng)蛋白(C-Reactive Protein，CRP)的低濃度檢測(cè)。其具體實(shí)驗(yàn)過程如下：首先制作了帶 1 mm×0.8 mm×30 μm 預(yù)濃縮反應(yīng)池的 T 型聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane，PDMS)芯片，在反應(yīng)池中設(shè)計(jì)物理微結(jié)構(gòu)富集CRP 抗體包被的磁珠；然后將熒光標(biāo)記的 CRP抗原和待檢測(cè) CRP 抗原注入反應(yīng)池，孵育后洗脫熒光標(biāo)記；最后在反應(yīng)池下游微通道利用嵌入式光電倍增管檢測(cè)熒光信號(hào)，結(jié)果測(cè)得 CRP 最低檢測(cè)限為 1.4 nmol/L。該方法有效地提高了檢測(cè)的靈敏度，但缺點(diǎn)在于磁珠修飾抗體和熒光標(biāo)記抗原等操作都必須在芯片外進(jìn)行，檢測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。

利用微流控芯片平臺(tái)分析生物標(biāo)志物時(shí)，常需各種進(jìn)樣泵和驅(qū)動(dòng)泵等，使平臺(tái)極其復(fù)雜。Hosokawa 等[2]利用空氣在 PDMS 中溶解度高和擴(kuò)散速度快的特性，研制了無動(dòng)力注射的免疫分析芯片。該芯片具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。在實(shí)驗(yàn)過程中，他們對(duì)競(jìng)爭(zhēng)法和夾心法非均相免疫分析都進(jìn)行了研究，操作如下：通過先將抗體修飾于內(nèi)壁，再利用熒光法檢測(cè)兔 IgG 和人CRP。最終結(jié)果顯示：樣品消耗為 1 μL，免疫分析時(shí)間為 20 min，檢測(cè)限分別為 0.21 nmol/L 和0.42 nmol/L。以上表明該方法具有樣本消耗少、分析時(shí)間短和檢測(cè)靈敏度較高等優(yōu)勢(shì)。

微球免疫分析通常能增大抗原抗體的結(jié)合面積，縮短抗原抗體所需要的反應(yīng)時(shí)間，提高檢測(cè)靈敏度。Christodoulides 等[3]在硅片上加工出微室陣列，將共價(jià)鍵合抗體的瓊脂凝膠微珠裝入微室中，通過毛細(xì)管引入各種反應(yīng)試劑，然后利用熒光或可見光比色檢測(cè)唾液中 CRP，最終12 min 完成檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá) 5 fg/mL，而在10 fg/mL～10 pg/mL 間有較好的線性相關(guān)性，檢測(cè)靈敏度優(yōu)于商品化超敏 CRP ELISA 檢測(cè)試劑盒。這種微球分析與微流控結(jié)構(gòu)相結(jié)合的系統(tǒng)，靈活減小了分析設(shè)備體積，實(shí)現(xiàn)了唾液中微量CRP 的超靈敏檢測(cè)。

芯片表面的親疏水性直接影響芯片的檢測(cè)效果。表面改性一直是微流控芯片的重點(diǎn)研究領(lǐng)域。Jonsson 等[4]對(duì)環(huán)烯共聚物(Cycloolefin Copolymer，COP)芯片表面性質(zhì)進(jìn)行改性：分別用氧等離子體氧化、3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)硅烷化和右旋糖酐修飾來增加其表面親水性，進(jìn)而易于捕獲抗體結(jié)合。該改性手段穩(wěn)定可靠，結(jié)合免疫檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)了對(duì)血液中 CRP的低濃度檢測(cè)，最低檢測(cè)限達(dá) 2.6 ng/mL。

利用微流控芯片平臺(tái)高通量分析心肌及其他生物標(biāo)志物，可以節(jié)約檢測(cè)成本和時(shí)間，是未來的發(fā)展趨勢(shì)。Caulim 等[5]結(jié)合非競(jìng)爭(zhēng)免疫分析、裂解標(biāo)記免疫分析(Cleavable Tag Immunoassay，CTI)和膠束電動(dòng)色譜(Micellar Electrokinetic Chromatography，MEKC)，同時(shí)分析了 AMI 的CK-MB、cTnT、cTnI 和 Myo 四種心肌標(biāo)志物。作者通過對(duì)以上四種心肌標(biāo)志物抗體進(jìn)行不同熒光物質(zhì)標(biāo)記，使反應(yīng)后被切割的熒光標(biāo)簽在芯片 MEKC 中層析分離，而每種熒光標(biāo)記在芯片MEKC 中有不同的遷移率，通過定量不同熒光標(biāo)簽量來定量各組分標(biāo)志物濃度。利用該平臺(tái)對(duì)CK-MB、cTnT、cTnI 和 Myo 的檢測(cè)限分別為 3 ng/mL、25 pg/mL、2 ng/mL 和 5 ng/mL。該研究的局限在于 CTI 和 MECK 分開進(jìn)行，未能整合在一塊芯片上實(shí)現(xiàn)。故該研究組還在研究芯片在線 CTI，將芯片在線 CTI 與芯片 MEKC 結(jié)合，真正實(shí)現(xiàn)微流控芯片的高通量分析，促進(jìn)即時(shí)診斷產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

熒光共振能量轉(zhuǎn)移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET)是距離很近的兩個(gè)熒光分子間產(chǎn)生的一種能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，通常用于檢測(cè)某一細(xì)胞中兩個(gè)蛋白質(zhì)分子是否存在直接的相互作用。Stringer 等[6]結(jié)合 FRET 和液芯波導(dǎo)技術(shù)(Liquid Core Waveguide，LCW)，實(shí)現(xiàn)了 cTnI 的高靈敏度快速檢測(cè)。作者分別檢測(cè)了磷酸鹽緩沖液和血液樣本中的 cTnI 濃度，最低檢測(cè)限分別達(dá)到 32 nM 和 50 nM。微流控芯片與 LCW 相結(jié)合是實(shí)現(xiàn)高靈敏度生物標(biāo)志物檢測(cè)的有效手段。但該方法的 LCW 裝置較復(fù)雜，不利于開發(fā)適合即時(shí)診斷的產(chǎn)品。

化學(xué)發(fā)光免疫分析是將具有高靈敏度的化學(xué)發(fā)光測(cè)定技術(shù)與高特異性的免疫反應(yīng)相結(jié)合的檢測(cè)技術(shù)。相比傳統(tǒng)熒光和可見光比色方法，化學(xué)發(fā)光法能檢測(cè)血液中更痕量的 cTnI。由于傳統(tǒng)試紙條側(cè)向流膠體金染色方法只可定性，不能定量檢測(cè)標(biāo)志物，故無法滿足臨床需求。Cho 等[7]構(gòu)建了紙芯片-ELISA 平臺(tái)，調(diào)整加樣方向，實(shí)現(xiàn)抗原抗體垂直側(cè)向流擴(kuò)散，酶底物水平側(cè)向流擴(kuò)散，節(jié)省了反應(yīng)時(shí)間。該化學(xué)發(fā)光微流控系統(tǒng)檢測(cè) cTnI 最低檢測(cè)限達(dá) 0.027 ng/mL，線性范圍：0.1～100 ng/mL，變異系數(shù)＜16%。該方法的缺點(diǎn)在于檢測(cè)手段為電荷耦合裝置 CCD 拍照，檢測(cè)裝置成本較高。

Bhattacharyya 等[8]通過熱壓法制作含八通道的塑料微流控芯片，利用辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase)標(biāo)記二抗，魯米諾為化學(xué)發(fā)光底物，實(shí)現(xiàn)了在一塊芯片上同時(shí)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線和 CRP 樣本的檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間僅為 25 min，大大節(jié)約了檢測(cè)成本和時(shí)間。該方法的缺點(diǎn)在于檢測(cè)靈敏度有待進(jìn)一步提高。

Yang 等[9]設(shè)計(jì)了含液體通道層、氣動(dòng)層和預(yù)留空氣層的三層 PDMS 芯片，芯片上整合有微泵、微閥和微混合器。利用該系統(tǒng)測(cè)定血樣中CRP 時(shí)，最低檢測(cè)限為 0.0125 mg/mL，檢測(cè)時(shí)間為 25 min，與醫(yī)院現(xiàn)有方法相比，檢測(cè)靈敏度和時(shí)間都得到很大改善。

3 微流控芯片電化學(xué)方法檢測(cè)心肌標(biāo)志物

與光學(xué)檢測(cè)方法相比，電化學(xué)方法具有靈敏度高、反應(yīng)快、電極微型化、對(duì)芯片材質(zhì)沒有特殊要求等特點(diǎn)。電化學(xué)方法已慢慢成為當(dāng)今微流控平臺(tái)的主要檢測(cè)手段[10,11]。

隨著微電極加工技術(shù)的發(fā)展，研究者經(jīng)常采用一些特殊技術(shù)結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法來達(dá)到痕量檢測(cè)。如，Wang 等[12]利用自組裝單層膜技術(shù)結(jié)合電化學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)了 Myo 和血紅蛋白。該研究中工作電極是 1 cm×2 cm 的金修飾硅片，其表面修飾有自組裝單層膜，當(dāng)待測(cè)樣本結(jié)合到膜上時(shí)，工作電極與參比電極間電位發(fā)生改變，通過檢測(cè)電勢(shì)變化而測(cè)定樣本中蛋白濃度。將此技術(shù)與微流控芯片相結(jié)合，減少待測(cè)樣本體積和檢測(cè)時(shí)間，增加反應(yīng)靈敏度，是理想的即時(shí)診斷平臺(tái)。Zhou 等[13]利用量子點(diǎn)標(biāo)記抗體結(jié)合方波溶出伏安法(Square-Wave Anodic Stripping Voltammetry)同時(shí)檢測(cè)了兩種心肌標(biāo)志物 cTnI和 CRP。作者通過 SWASV 與微流控平臺(tái)結(jié)合，利用微通道電泳濃縮并輸送金屬離子。當(dāng) cTnI和 CRP 分別在 0.01～50 μg/L 和 0.5～200 μg/L 范圍內(nèi)時(shí)，檢測(cè)電流與檢測(cè)物濃度具有較好的線性一致性。該方法檢測(cè) cTnI 和 CRP 的最低檢測(cè)限分別為 0.004 μg/L 和 0.22 μg/L。Abad 等[10]通過極譜電流時(shí)間曲線法監(jiān)測(cè)電子轉(zhuǎn)移，實(shí)現(xiàn)了對(duì) cTnT 的超靈敏檢測(cè)。作者加工了具有多個(gè)電極的 COP 微流控芯片，該芯片含一個(gè)捕獲磁珠帶、兩個(gè)參比電極和一個(gè)工作電極，可同時(shí)獨(dú)立檢測(cè)六個(gè)樣本。作者用該系統(tǒng)檢測(cè)了溶解在 PBS中的 cTnT 和真實(shí)血樣中的 cTnT 含量，最低檢測(cè)限分別達(dá) 0.017 ng/mL 和 0.02 ng/mL，靈敏度大大超過傳統(tǒng)手段。

另外，離心微流控磁盤因其自動(dòng)化、可一次性使用、不用注射泵、沒有復(fù)雜的流體相互聯(lián)系、僅靠離心力驅(qū)動(dòng)樣本等特點(diǎn)[11]，在微流控芯片領(lǐng)域廣受歡迎。Kim 等[11]以聚碳酸酯為芯片材料，制成微流控磁盤，將 CRP 抗體修飾的聚苯乙烯微球預(yù)封閉在磁盤的一個(gè)微池內(nèi)，通過離心實(shí)現(xiàn)樣本中抗原的捕獲，利用安培法檢測(cè) CRP濃度，最低檢測(cè)限達(dá) 4.9 pg/mL。

4 其他微流控芯片檢測(cè)手段檢測(cè)心肌標(biāo)志物

隨著傳感器技術(shù)的迅速發(fā)展，越來越多的檢測(cè)手段被用在對(duì)心肌標(biāo)志物的檢測(cè)。如，Kurita等[14]設(shè)計(jì)了與玻片鍵合的 T 型 PDMS 芯片，同時(shí)在玻片上加工兩塊鍍金薄膜 A 和 B。在他的研究中，樣本中的 BNP 通過 EDC/NHS 系統(tǒng)先與薄膜 A 結(jié)合，之后加入乙酰膽堿酯酶修飾的抗 BNP抗體，然后再加入硫代乙酰膽堿，硫代乙酰膽堿在乙酰膽酯酶的催化下變成硫代膽堿并流動(dòng)至薄膜 B 上聚集。而薄膜 B 處有表面等離子體共振(SPR)檢測(cè)裝置，硫代膽堿在薄膜 B 處的聚集可引起 SPR 角度改變。之后根據(jù)硫代膽堿的濃度與上游加入薄膜 A 上的 BNP 濃度成反比，進(jìn)而可通過 SPR 角度改變來測(cè)定 BNP 濃度。結(jié)果表明該系統(tǒng)檢測(cè) BNP 時(shí)，在 5 pg/mL～100 ng/ml 具有較好的靈敏度，檢測(cè)時(shí)間僅為 30 min。

Zhang 等[15]采用光子晶體內(nèi)全反射系統(tǒng)(PCTIR)，設(shè)計(jì)一個(gè)獨(dú)特的敞開光學(xué)微腔，以便功能化微腔表面，使抗原抗體更好地結(jié)合。作者用四氫呋喃、APTES、羧甲基右旋糖酐等處理傳感器表面并固定 Myo 抗體在其上，利用 PDMS 加工的微通道輸送待測(cè)樣本和對(duì)照液體 PBS 到傳感器部位。當(dāng)待測(cè)樣本中目標(biāo)抗原 Myo 與傳感器表面抗體結(jié)合后，共振波長(zhǎng)反射泡發(fā)生漂移，波長(zhǎng)的偏移值與待檢測(cè)的 Myo 濃度成正比。該法檢測(cè)限達(dá) 70 ng/mL，在 70～1000 ng/mL 范圍內(nèi)有較好的線性一致性。

5 結(jié)語與展望

光學(xué)法檢測(cè)心肌標(biāo)志物主要包括熒光和化學(xué)發(fā)光兩種方法。熒光法需要外加光源激發(fā)分子產(chǎn)生能級(jí)躍遷，進(jìn)而發(fā)光。由于生物樣品中的蛋白質(zhì)、氨基酸等分子也會(huì)產(chǎn)生背景熒光，故需選擇合適的熒光試劑和樣品處理方法，減少非特異性吸附蛋白的影響，降低背景干擾。而化學(xué)發(fā)光是自身發(fā)光，無需外加光源，背景干擾小，靈敏度更高，但需暗室及進(jìn)行冷發(fā)光檢測(cè)，其檢測(cè)器體積相對(duì)較大。電化學(xué)分析法可分為電導(dǎo)分析法、電位分析法、伏安法、極譜分析法、電解和庫(kù)侖分析法等。這些方法分析靈敏度和準(zhǔn)確度較高、測(cè)量范圍寬、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，運(yùn)用于微流控芯片檢測(cè)平臺(tái)時(shí)，對(duì)芯片材質(zhì)沒有特殊要求，并可以將電極微型化以減小平臺(tái)體積。與光學(xué)法相比，電化學(xué)法在心肌標(biāo)志物檢測(cè)方面具有更廣闊的應(yīng)用前景。尋找合適的發(fā)光試劑以減少背景干擾，提高檢測(cè)靈敏度，同時(shí)精簡(jiǎn)檢測(cè)設(shè)備體積，是光學(xué)法基于微流控即時(shí)診斷平臺(tái)檢測(cè)心肌標(biāo)志物的發(fā)展趨勢(shì)；尋找合適的、特異性強(qiáng)的電化學(xué)檢測(cè)方法，將各種電極微型化并整合于微流控芯片上，是電化學(xué)法基于微流控即時(shí)診斷平臺(tái)檢測(cè)心肌標(biāo)志物的發(fā)展趨勢(shì)。理想的微流控芯片即時(shí)診斷平臺(tái)要求檢測(cè)方法準(zhǔn)確度和靈敏度高、分析時(shí)間短、檢測(cè)設(shè)備簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉且易于與整個(gè)檢測(cè)平臺(tái)整合。

對(duì)于前文綜述的各種檢測(cè)方法，無論是光學(xué)法、電化學(xué)法，還是其他傳感技術(shù)，各有其利弊，研究者對(duì)多種檢測(cè)方法的探索都是為了更好地對(duì)心肌標(biāo)志物及時(shí)準(zhǔn)確檢測(cè)。微流控芯片作為一門新興學(xué)科，可以集進(jìn)樣、預(yù)處理、分離和檢測(cè)于一體，具有樣品需求量小、便攜、分析快速等特點(diǎn)，是理想的心肌標(biāo)志物檢測(cè)平臺(tái)。研究和發(fā)展適應(yīng)于心肌標(biāo)志物即時(shí)診斷的微流控芯片產(chǎn)品，符合檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)自動(dòng)化和簡(jiǎn)單化的發(fā)展趨勢(shì)，適應(yīng)當(dāng)今社會(huì)高效、快節(jié)奏的工作方式，滿足心血管疾病患者在時(shí)間上快速檢測(cè)的要求，可使患者盡早得到診斷治療。

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