香根草外植體的選擇及植株再生試驗(yàn)

黃玉玲，楊寶明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源研究所，云南昆明 650205）

香根草外植體的選擇及植株再生試驗(yàn)

黃玉玲，楊寶明

（云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境資源研究所，云南昆明 650205）

為建立香根草組織培養(yǎng)及植株再生體系，分別選取生長(zhǎng)健壯無(wú)病蟲害的植株莖桿、根、葉和幼嫩芽不同部位進(jìn)行外植體選擇及愈傷組織誘導(dǎo)，以及香根草外植體消毒方法和激素處理及培養(yǎng)基對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響試驗(yàn)。結(jié)果表明，莖桿、根、葉作為外植體，誘導(dǎo)不出愈傷組織。幼嫩芽是最佳香根草外植體的選擇。0.1%升汞對(duì)各部位處理效果成功率在65%以上，幼嫩芽消毒浸泡8 min成功率達(dá)88%。在MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基上培養(yǎng)25 d幼芽愈傷組織誘導(dǎo)率為100%。在MS+6-BA 0.8 mg/L+NAA 0.2 mg/L培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 d誘導(dǎo)叢生芽效果最好，增殖系數(shù)為6.4。生根培養(yǎng)基選用1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+IAA 0.1 mg/L為最佳，生根率達(dá)90%以上。

香根草；外植體；愈傷組織誘導(dǎo)；植株再生

香根草（Vetiveria zizanioides）又名巖蘭草，是禾本科香根草屬的一種，原產(chǎn)于印度和非洲大陸南部。其株高1.5～2 m，莖桿挺直，直徑約1 cm，是自然界具有長(zhǎng)根系的多年生高大草本植物。香根草于秋季抽穗揚(yáng)花，由于香根草極少結(jié)籽；主要靠分株繁殖，故不會(huì)成為雜草；具有生物量大，生態(tài)幅度寬，易栽種易管理的特點(diǎn)；可提取香根油、制造紙張、編織手工藝品和作為驅(qū)蟲治病的材料，是一種很有發(fā)展前景的水土保持草種。本研究的目地是通過(guò)選擇香根草叢生芽誘導(dǎo)的最佳外植體及植株再生試驗(yàn)，為香根草的組織培養(yǎng)快繁生產(chǎn)種苗奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料取自云南省煙草公司芒市種植試驗(yàn)基地。2013年3月選取當(dāng)年生健壯無(wú)病蟲害的植株，以根、莖桿、葉和幼嫩芽作為外植體。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體消毒

將采來(lái)的各個(gè)部位外植體分別剪成1～2 cm的小段，用自來(lái)水加少量洗衣粉沖洗5次，然后在超菌臺(tái)上用2%次氯酸鈉溶液消毒1次，不同外植體根、莖、葉、芽消毒時(shí)間分別為25 min、10 min、15 min、12 min，用滅菌水沖洗2次。另外一組采用0.1%升汞消毒1次，不同外植體根、莖、葉、芽消毒時(shí)間分別為15 min、12 min、5 min、8 min，滅菌水沖洗3次。然后用無(wú)菌濾紙吸干表面水分[1]。將處理好的材料接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每種外植體接種5瓶，每瓶5株。

1.2.2 基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

以MS為基本培養(yǎng)基，加入3%蔗糖、0.6%瓊脂粉，pH值5.8誘導(dǎo)愈傷組織叢生芽，生根各階段附加激素和生長(zhǎng)素濃度配比處理不同。培養(yǎng)溫度為25± 2℃，光照強(qiáng)度為1 500～2 000 Lx，光照時(shí)間為12 h/ d。移栽生根苗基質(zhì)紅土∶砂=1∶1。

1.2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

將已獲得的無(wú)菌外植體（根、莖桿、葉、幼嫩芽）分別接種到不同組合的3組培養(yǎng)基中，在相同條件下培養(yǎng)，接種25 d后觀察不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)率。采用不同的激素、生長(zhǎng)素及不同的濃度組合誘導(dǎo)不同外植體，如：2，4-D 2.0 mg/L分別加6-BA 0.2 mg/L、6-BA 0.5 mg/L組合對(duì)根誘導(dǎo)，2，4-D 1.5 mg/L分別加NAA 0.1 mg/L、NAA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L組合對(duì)葉誘導(dǎo)，6-BA 4.0 mg/L分別加NAA 0.1 mg/L、NAA 0.3 mg/L、NAA 0.5 mg/L對(duì)莖桿誘導(dǎo)，NAA 0.1 mg/L分別加6-BA 2.0 mg/L、6-BA 1.5 mg/L、6-BA 1.0 mg/L對(duì)幼嫩芽誘導(dǎo)。誘導(dǎo)率（%）=愈傷組織數(shù)/外植體總數(shù)×100。

1.2.4 不同濃度激素對(duì)叢生芽的增殖影響

將誘導(dǎo)形成的綠苗轉(zhuǎn)接到增殖培養(yǎng)基中，采用5組培養(yǎng)基培養(yǎng)，6-BA 0.3 mg/L、6-BA 0.5 mg/L、6-BA 0.8 mg/L、6-BA 1.0 mg/L、6-BA 1.5 mg/L由低到高與相同的濃度NAA 0.2 mg/L組合培養(yǎng)20 d觀察結(jié)果，增殖系數(shù)=側(cè)芽的總數(shù)/總處理瓶數(shù)。

1.2.5 根的誘導(dǎo)

選擇增殖苗中2～3 cm的完整植株接種在以1/2為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的3組生根培養(yǎng)基中（表4），每組接5瓶，每瓶接5株，15 d后觀察3組培養(yǎng)基生根的情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同消毒劑滅菌效果比較

試驗(yàn)結(jié)果表明，2種消毒劑對(duì)香根草不同的外植體根、莖桿、葉、幼嫩芽消毒效果不同（表1）。0.1%升汞處理效果最明顯，4種外植體成功率均達(dá)60%以上。幼芽處理8 min成功率達(dá)88%。2種消毒劑比較，2%次氯酸鈉對(duì)外植體的消毒時(shí)間長(zhǎng)，效果不如0.1%升汞好，但使用2%次氯酸鈉對(duì)人安全性好。0.1%升汞對(duì)人毒性大，使用時(shí)要特別小心，避免造成安全隱患。外植體的消毒效果是其組培技術(shù)成功與否的關(guān)鍵和前提。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)外植體愈傷組織的誘導(dǎo)

采用不同激素的組合誘導(dǎo)愈傷組織，在相同的環(huán)境條件下培養(yǎng)結(jié)果完全不同，見(jiàn)表2。2，4-D與6-BA組合對(duì)根的愈傷組織誘導(dǎo)率基本為0，2，4-D與NAA組合對(duì)葉的愈傷組織誘導(dǎo)率全部為0，6-BA與NAA組合對(duì)莖桿的愈傷組織誘導(dǎo)率為8%～16%，誘導(dǎo)率較低。幼嫩芽在3個(gè)不同6-BA濃度與相同NAA濃度組合中愈傷組織誘導(dǎo)率分別為60%（6-BA2.0 mg/L）、100%（6-BA1.5 mg/L）、72%（6-BA1.0 mg/L），3組組合效果都好，誘導(dǎo)率都在60%以上，其中MS+6-BA 1.5 mg/L+NAA 0.1mg/L誘導(dǎo)率最高100%，是最適宜香根草的芽愈傷組織誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。

表1 不同外植體藥劑處理污染率和成功率

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)外植體愈傷組織誘導(dǎo)的影響

2.3 不同濃度激素對(duì)叢生芽增殖的影響

從表3可知，當(dāng)6-BA濃度為0.3 mg/L時(shí)增殖系數(shù)為1.6，當(dāng)6-BA濃度為1.5 mg/L時(shí)增殖系數(shù)為2.4，而6-BA濃度為0.8 mg/L時(shí)增殖系數(shù)為6.4。由此說(shuō)明叢生芽增殖系數(shù)多少，主要取決于6-BA的濃度，太低誘導(dǎo)叢生芽少，太高反而抑制生長(zhǎng)，所以6-BA濃度太高太低都不適合于增殖培養(yǎng)，香根草叢生芽增殖最佳培養(yǎng)基：MS+6-BA 0.8 mg/L+ NAA 0.2 mg/L。

表3 不同激素濃度對(duì)叢生芽增殖的影響

2.4 不同生長(zhǎng)素對(duì)香根草生根的影響

不同生長(zhǎng)素培養(yǎng)基對(duì)香根草的生根效果顯然不同，結(jié)果見(jiàn)表4。其中2號(hào)培養(yǎng)基處理1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+IAA 0.1 mg/L效果最好。

各個(gè)環(huán)節(jié)看，香根草完成叢生芽誘導(dǎo)后根的誘導(dǎo)較容易，僅需14 d左右生根率就達(dá)到90%以上。生根誘導(dǎo)主要受NAA濃度的影響，過(guò)高過(guò)低都會(huì)抑制生根，1/2 MS+NAA 0.3 mg/L+IAA 0.1 mg/L的培養(yǎng)基最適宜香根草生根，生根率達(dá)92%。

表4 不同生長(zhǎng)素對(duì)香根草生根的影響

2.5 生根瓶苗的移栽

將生根瓶苗培養(yǎng)15 d后，生根率達(dá)90%以上就可出瓶移栽，在自然光照下擺放一周適應(yīng)外部環(huán)境，提高成活率。將苗從培養(yǎng)瓶中取出洗去根部的培養(yǎng)基，栽種到紅土∶砂=1∶1基質(zhì)中，然后澆透水，保溫保濕，移栽成活率達(dá)85%以上。

3 討論

從本試驗(yàn)選擇出了香根草的最佳外植體，建立了愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生體系，有關(guān)香根草組織培養(yǎng)也有一些報(bào)道[1]，但試驗(yàn)結(jié)論與此試驗(yàn)有所不同，可能與外植體的品種選擇、環(huán)境、時(shí)間有關(guān)。本試驗(yàn)中確定了香根草最適宜的外植體為幼嫩芽，在誘導(dǎo)形成愈傷組織時(shí)腋芽可被誘導(dǎo)成叢生芽，可以達(dá)到快速繁殖香根草的目的。但是在叢生芽繼代增殖過(guò)程中，如6-BA濃度過(guò)高雖然繁殖系數(shù)大，但完整的單苗植株少，下一步生根培養(yǎng)挑選單苗會(huì)受到影響，從而延長(zhǎng)了出苗移栽的時(shí)間，影響生根移栽出苗。所以要根據(jù)市場(chǎng)的需求量來(lái)調(diào)整選擇配方的濃度，在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，香根草的植株生長(zhǎng)速度特別快，導(dǎo)致生根苗長(zhǎng)勢(shì)細(xì)弱，影響移栽的成活率，有待今后進(jìn)一步探討和研究。香根草具有長(zhǎng)期保持植株再生的能力，高效再生系統(tǒng)的建立為香根草開展基因工程及遺傳轉(zhuǎn)化研究奠定基礎(chǔ)，也為大規(guī)模繁殖香根草的種苗提供了技術(shù)保障。同時(shí)也解決了從省外購(gòu)買種苗的困難。本研究將為云南省進(jìn)一步推廣和應(yīng)用香根草提供科學(xué)依據(jù)。

[1]姚振，朱桂才，任文雙，等.香根草種子外植體組織培養(yǎng)與快繁技術(shù)[J].《長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)》（自然科學(xué)版）農(nóng)學(xué)卷，2010，7（02）：43-55.

2014－07－28