bcr/abl陰性表達(dá)的骨髓增殖性腫瘤患者JAK2V617F基因突變的臨床研究

陳霄峰 陳文芬 林明增 羅文達(dá)

bcr/abl陰性表達(dá)的骨髓增殖性腫瘤患者JAK2V617F基因突變的臨床研究

陳霄峰 陳文芬 林明增 羅文達(dá)

目的 探討JAK2V617F基因突變在bcr/abl陰性表達(dá)的骨髓增殖性腫瘤（MPN）患者中的發(fā)生率及臨床意義。方法應(yīng)用實時熒光PCR法檢測99例bcr/abl陰性表達(dá)的MPN患者的JAK2V617F基因突變。結(jié)果99例患者中發(fā)現(xiàn)70例（70．7%）JAK2V617F基因突變，其中真性紅細(xì)胞增多癥（PV）中突變發(fā)生率90．6%（29/32），原發(fā)性血小板增多癥（ET）中突變發(fā)生率62．5%（15/24），慢性特發(fā)性骨髓纖維化（CIMF）中突變發(fā)生率60．9%（14/23），骨髓增殖性腫瘤未分型（MPN-U）中突變發(fā)生率為60．0%（12/20）。PV患者的突變率高于ET、CIMF及MPN-U（P＜0．05或0．01）。JAK2V617F基因突變型患者的年齡大于野生型患者（P＜0．01），血白細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白水平高于野生型患者（P＜0．05或0．01）。結(jié)論bcr/abl陰性的MPN患者JAK2V617F基因突變發(fā)生率與疾病類型、年齡、外周血細(xì)胞計數(shù)相關(guān)，可以作為bcr/abl陰性MPN患者主要的分子遺傳學(xué)異常標(biāo)志，有助于臨床診斷。

骨髓增殖性腫瘤 JAK2V617F基因突變 實時熒光PCR

骨髓增殖性腫瘤（myeloproliferativeneoplasms，MPN），既往稱骨髓增殖性疾病（myeloproliferative disorders，MPD），是一類起源于多能造血干細(xì)胞，以一系或多系分化相對成熟的骨髓細(xì)胞克隆性增殖異常為特點的一組異質(zhì)性疾病。按WHO分類，包括慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelocytic leukemia，CML）、真性紅細(xì)胞增多癥（polycythemia vera，PV）、原發(fā)性血小板增多癥（essential thrombocytosis，ET）、慢性特發(fā)性骨髓纖維化（chronic idiopathic myelofibrosis，CIMF）和骨髓增殖性腫瘤未分型（MPN unclassified，MPN-U）等。2005年James等[1]發(fā)現(xiàn)部分MPN患者存在的JAK2基因突變，對MPN的診斷和發(fā)病機制的研究等產(chǎn)生了重要影響。近年來筆者檢測了 99例 bcr/abl陰性表達(dá)的 MPN患者的JAK2V617F基因突變情況，并結(jié)合臨床進(jìn)一步分析以探討其臨床意義，現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 2010-01—2014-04本院門診及住院初診為MPN的患者共99例（MPN組）。其中男54例，女45例，年齡25～85歲，平均（53.6±8.4）歲，中位年齡52歲。按照2001年WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，PV 32例、ET 24例、CIMF 23例、MPN-U 20例。對照組20例為本院健康體檢者，其中男11例，女9例，平均（52.3±7.1）歲。兩組間年齡及性別比較均無統(tǒng)計學(xué)差異（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 抽取受試者骨髓或外周血3ml，EDTA抗凝，標(biāo)本送檢至杭州艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心，以DNA抽提試劑盒（北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品），抽提基因組DNA，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行，根據(jù)分光計測量濃度并確定純度后，DNA終濃度調(diào)節(jié)為200ng/μl。

1.2.2 JAK2V617F基因突變檢測 采用實時熒光PCR法檢測（ABL 7500），引物由艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗中心自行設(shè)計，于TAKARA公司合成，正義引物1條，反義引物1條，野生型和突變型探針各1條由上海基康公司合成。PCR反應(yīng)體系為：使用TOYOBO THUNDERBIRD qPCR Mix成品試劑盒，模板2μl，按試劑盒要求加入PCR擴增體系，反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性1min；95℃10s，60℃1min，共45個循環(huán)，60℃1min采集熒光信號，陽性對照使用陽性質(zhì)粒，空白對照使用雙蒸水，擴增后直接使用熒光PCR分析軟件分析檢測結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗，計數(shù)資料多組間比較先用行×列表的χ2檢驗，再行兩兩比較。

2 結(jié)果

2.1 JAK2V617F基因?qū)崟r熒光PCR檢測結(jié)果 見圖1。

圖1 JAK2V617F基因?qū)崟r熒光PCR檢測結(jié)果示意圖[縱坐標(biāo)代表熒光強度，橫坐標(biāo)代表循環(huán)參數(shù)（CT）值。純合突變指只有一種突變基因型的樣本，雜合突變就是既有突變型又有野生型存在的樣本。JAK2V617F基因突變陽性即為JAK2V617F雜合突變或純合突變（突變型），JAK2V617F基因突變陰性即為JAK2V617F未突變（野生型）]

2.2 JAK2V617F基因突變與患者臨床特征的關(guān)系 99例MPN患者中JAK2V617F基因突變陽性共70例。PV、ET、CIMF和MPN-U患者中JAK2V617F基因突變發(fā)生率分別為90.6%、62.5%、60.9%和60.0%，對照組未檢出突變。PV組分別與ET、CIMF、MPN-U組比較，突變發(fā)生率均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05或0.01），但ET、CIMF和MPN-U 3組間比較，突變發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異（χ2=0.67，P＞0.05）。

JAK2V617F基因突變型患者平均年齡大于野生型患者[（57.5±8.4）歲vs（43.2±4.8）歲，t=5.81，P＜0.01]，在PV、ET和MPN-U組中，基因突變型患者的平均年齡均高于野生型（均P＜0.05），而CIMF組中基因突變型患者與野生型患者的年齡無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。JAK2V617F基因突變在男性發(fā)生率為70.4%，女性發(fā)生率為71.1%，兩者間比較無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1 JAK2V617F基因突變與患者臨床特征關(guān)系

2.3 JAK2V617F基因突變與患者外周血細(xì)胞計數(shù)的關(guān)系 JAK2V617F基因突變型患者的白細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白水平在MPN各組中均高于野生型患者（P＜0.05或0.01），但血小板計數(shù)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 JAK2V617F基因突變與患者外周血細(xì)胞計數(shù)間的關(guān)系

3 討論

JAK2是定位于9號染色體短臂2區(qū)4帶（9p24）的胞內(nèi)酪氨酸蛋白激酶（PTK），由7個高度同源結(jié)構(gòu)域JH1～JH7構(gòu)成，與JAK1、JAK3、TYK2同屬于Janus激酶家族[3]。2005年James等[1]率先在PV患者發(fā)現(xiàn)JAK2突變，以后多個研究小組均報道了JAK2V617F的突變。正常情況下，JH2區(qū)域有自我抑制JAK2酪氨酸激酶活性的功能，只有在造血細(xì)胞生長因子信號刺激下才使造血細(xì)胞增殖分化。所謂JAK2V617F突變指的是JAK2的12號外顯子中1 849位核苷酸G→T突變，導(dǎo)致JAK2蛋白激酶樣區(qū)結(jié)構(gòu)域（JH2）617位的纈氨酸錯義編碼為苯丙氨酸[4]，進(jìn)而解除了JH2區(qū)域的自我抑制功能，激活JAK2的表達(dá)。JAK2的持續(xù)活化，通過JAK-STAT通路傳導(dǎo)至細(xì)胞核內(nèi)，促進(jìn)相關(guān)基因活化，如紅系祖細(xì)胞的細(xì)胞生存蛋白bcl-x過度表達(dá)及紅系祖細(xì)胞凋亡減少，或促進(jìn)造血細(xì)胞系的G1/S期活化，伴細(xì)胞周期蛋白D上調(diào)和抑制因子p27下調(diào)等，使血細(xì)胞大量增殖[1，4]。本文結(jié)果顯示，在MPN患者中JAK2V617F基因突變發(fā)生率為70.7%，其中PV、ET、CIMF、MPN-U 4組JAK2V617F基因突變發(fā)生率分別為90.6%、62.5%、60.9%、60.0%，與國內(nèi)外報道一致[5-6]，對照組則未發(fā)現(xiàn)突變病例。PV患者的突變發(fā)生率高于ET、CIMF及MPN-U，但后3者突變發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異。2008年，WHO將JAK2V617F列入bcr/abl陰性的PV、ET、CIMF的診斷依據(jù)中，揭示了此基因的重要性，亦為臨床診斷提供了一個重要的依據(jù)，本文結(jié)果也較好揭示了這一點。2008年WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)中，由于JAK2V617F基因檢測的出現(xiàn)，血紅蛋白及血小板計數(shù)較以往規(guī)定的指標(biāo)值有所下降。如果JAK2突變陽性，血紅蛋白升高（男性＞185g/L，女性＞165g/L）及骨髓紅系細(xì)胞增生明顯即可診斷PV。即使血紅蛋白低于以往WHO規(guī)定的指標(biāo)值，但持續(xù)超過正常值20g/L，也可確診為PV。而對于ET，只要具備JAK2突變陽性，血小板持續(xù)＞450×109/L及骨髓巨核細(xì)胞增生，即可診斷。所以在臨床上，如果JAK2突變陽性，則可以排除反應(yīng)性紅細(xì)胞增多或血小板增多癥。但需注意一部分患者JAK2突變?yōu)殛幮?，需動態(tài)觀察及注意檢測方法的選擇。

JAK2V617F基因突變的檢測方法有直接測序法、PCR技術(shù)等。本研究中應(yīng)用實時熒光PCR法檢測，優(yōu)點為特異性強，自動化程度高。JAK2V617F突變存在純合和雜合兩種類型，James等[1]認(rèn)為，JAK2V617F突變對MPN的發(fā)生并非必要，在出現(xiàn)臨床癥狀后，突變只是作為一個基因事件與疾病的進(jìn)展相關(guān)，據(jù)此JAK2V617F突變陰性的MPN患者應(yīng)處于疾病早期階段，若為純合型JAK2V617F突變患者則病程最長，疾病處于較晚期階段，雜合型向純合型轉(zhuǎn)變過程代表著疾病進(jìn)展[7]。故對突變陰性患者可定期復(fù)查JAK2V617F基因突變情況。

本研究還發(fā)現(xiàn)JAK2V617F基因突變型患者的平均年齡高于野生型，但突變發(fā)生率在不同性別比較無統(tǒng)計學(xué)差異。Carobbio等[8]報道JAK2V617F基因突變型患者的平均年齡高于野生型，并認(rèn)為患者年齡＞60歲是影響患者存活時間的不利因素，本文結(jié)果與此報道基本相符。Tefferi[3]認(rèn)為血白細(xì)胞增多對于PV和ET患者的總體生存期及PV的白血病轉(zhuǎn)化都有著重要的預(yù)后價值。在本研究中，JAK2V617F突變陽性者，表現(xiàn)為血白細(xì)胞增高，與野生型比較有統(tǒng)計學(xué)差異，其表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系有待進(jìn)一步追蹤觀察。國內(nèi)晁紅穎等[9]報道JAK2V617F基因突變型患者的血白細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白水平高于野生型患者，但血小板計數(shù)無差異。本文報道與此相符，但其相關(guān)性需更大樣本來證實。

JAK2V617F基因突變的發(fā)現(xiàn)將給MPN靶向治療藥物的研制帶來新的方向，如Werning等[10]的研究報道JAK2抑制劑有良好的作用。

綜上所述，JAK2V617F基因突變檢測開展可提高M(jìn)PN的臨床診斷水平，尤其對早期或不典型的MPN診斷具有重要意義，亦為靶向治療提供了一個很好的思路。

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JAK2V617F gene mutation in patients with bcr/abl-negative myeloproliferative neoplasms

Objective To investigate the frequency and clinical implication of JAK2V617F gene mutation in patients with bcr/abl-negative myeloproliferative neoplasms(MPN)．MethodsJAK2V617F mutation was screened by real-time fluorescent PCR in 99 patients with bcr/abl-negative MPN．ResultsJAK2V617F mutation was detected in 70 of 99 patients with MPN,the frequency rate of mutation was 90．6%(29/32)in patients with polycythemia vera(PV),62．5%(15/24)in essential thrombocythemia (ET),60．9%(14/23)in chronic idiopathic myelofibrosis(CIMF)and 60．0%(12/20)in myeloproliferative neoplasma-undifferentiated (MPN-U)．The frequency of JAK2V617F mutation in PV patients was significantly higher than that in ET,CIMF,and MPN-U patients(P＜0．05 or 0．01)．There were significant differences in age,leukocyte counts,and hemoglobin levels between JAK2V617F positive and negative patients(P＜0．05 or 0．01)．ConclusionJAK2V617F gene mutation is correlated with the classification of MPN,age and blood cells counts．It may be used as a molecular marker for patients with bcr/abl negative MPN．

Myeloproliferative neoplasms JAK2V617F mutation Real-time fluorescent PCR

2014-04-28）

（本文編輯：胥昀）

318050 浙江省臺州恩澤醫(yī)療中心（集團）路橋醫(yī)院血液科