TGF-β1對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究

吳立琴 戴元榮 李鳳琴 王瑞麗 曾濰賢

TGF-β1對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖的影響研究

吳立琴 戴元榮 李鳳琴 王瑞麗 曾濰賢

目的 探究TGF-β1對(duì)哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）增殖的影響，進(jìn)一步揭示哮喘的發(fā)病機(jī)制。方法建立大鼠慢性哮喘模型，原代分離培養(yǎng)大鼠ASMC，將細(xì)胞分為正常組、哮喘組、TGF-β1組和TGF-β1+PD-98059組，以CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，Western blot法檢測(cè)caveolin-1和p-ERK1/2蛋白表達(dá)。結(jié)果TGF-β1組細(xì)胞增殖較正常組和哮喘組明顯（均P＜0．01）；TGF-β1+PD-98059組細(xì)胞增殖較TGF-β1組減低，但較哮喘組仍明顯（均P＜0．05）。TGF-β1組p-ERK1/2表達(dá)量較正常組和哮喘組增加；TGF-β1+PD-98059組p-ERK1/2表達(dá)量較TGF-β1組減少，但較哮喘組表達(dá)量仍有所增加（均P＜0．05）。TGF-β1組caveolin-1表達(dá)量較正常組和哮喘組減少（均P＜0．05）；TGF-β1+PD-98059組caveolin-1表達(dá)量較TGF-β1組增加（P＜0．05）。結(jié)論TGF-β1可以下調(diào)caveolin-1蛋白的表達(dá)量，激活ERK通路，從而促進(jìn)哮喘大鼠ASMC的增殖，引起氣道重塑。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1 哮喘 氣道平滑肌細(xì)胞 微囊蛋白-1 ERK

支氣管哮喘（簡(jiǎn)稱哮喘）是由多種細(xì)胞和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。氣道重塑是其重要的病理特征，而氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）的增殖和肥大在哮喘氣道重塑中發(fā)揮了重要作用[1]。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）是參與哮喘發(fā)病機(jī)制的一類信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)酶，其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）是該家族中最先被發(fā)現(xiàn)且研究最多的成員，包括p44MAPK（ERK1）和p42MAPK（ERK2）亞型[2]。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）是參與呼吸道重塑的重要細(xì)胞因子[3]，有研究表明TGF可能是通過ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)大鼠ASMC的增殖。微囊是ASMC表面的凹陷結(jié)構(gòu)，其主要結(jié)構(gòu)蛋白微囊蛋白-1（caveolin-1）在細(xì)胞的物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面具有重要的作用。本研究擬通過復(fù)制大鼠慢性哮喘模型，分離培養(yǎng)大鼠ASMC，并給予MAPK特異性抑制劑PD-98059干預(yù)，探討TGF-β1對(duì)ASMC增殖的影響，進(jìn)一步揭示哮喘的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心的SPF級(jí)健康雄性SD大鼠30只，6～8周齡，體重（200±10）g。飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，飼養(yǎng)溫度25℃，相對(duì)濕度70%，12h交替采光。

1.2 主要儀器和試劑 倒置顯微鏡NIKON TS100為日本尼康公司產(chǎn)品；Ⅰ型膠原酶、SM α-actin單克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma公司；TGF-β1購(gòu)于美國(guó)PeproTech公司；PD-98059購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗大鼠p-ERK1/ 2抗體（1∶1 000）、兔抗大鼠caveolin-1抗體（1∶1 000）購(gòu)于美國(guó)abcam公司；小鼠抗大鼠GAPDH抗體（1∶5 000）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶2 000）、山羊抗鼠二抗（1∶3 000）均為蘇州碧云天生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 大鼠慢性哮喘模型的建立及鑒定 將30只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為哮喘組（15只）和正常組（15只）。建立大鼠慢性哮喘模型，即第1天和第8天大鼠腹腔內(nèi)注射含1mg卵白蛋白（OVA）和100mg Al（OH）3的OVA/Al（OH）3混合液1ml致敏；第15天開始霧化吸入含1%OVA的0.9%氯化鈉溶液8ml激發(fā)哮喘，每次30min，隔日1次，共8周。正常組用等量0.9%氯化鈉溶液致敏和激發(fā)。模型制備成功后行組織切片觀察氣道形態(tài)，肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)等對(duì)哮喘模型進(jìn)行鑒定。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定 大鼠模型建立成功后，原代分離正常組和哮喘組大鼠ASMC，利用組織塊貼壁法分別培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)滿后用胰酶消化細(xì)胞傳代，取第3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。ASMC鑒定采用SM α-actin抗體，免疫組化SABC法。

1.5 CCK-8法檢測(cè)大鼠ASMC的增殖 收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為4～5×103個(gè)/ml，接種于96孔板，每孔100μl，待細(xì)胞80%～90%融合后，以無血清RPMI 1640培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步于G0期后換用10%FBS的RPMI 1640液培養(yǎng)。細(xì)胞分組如下：哮喘組、1μg/L TGF-β1組、10μg/L組和100μg/L組，各組中加入不同濃度TGF-β1分別培養(yǎng)24、48h。進(jìn)一步研究TGF-β1對(duì)ASMC增殖的影響，經(jīng)前期實(shí)驗(yàn)TGF-β1濃度選擇10μg/L。細(xì)胞分組如下：正常組、哮喘組、TGF-β1（10μg/L）組、PD-98059組和TGF-β1（10μg/L）+PD-98059組。TGF-β1組細(xì)胞以10μg/L TGF-β1作用48h，TGF-β1+PD-98059組細(xì)胞用PD-98059預(yù)處理1h后加入10μg/L TGF-β1作用48h。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，每孔中加入10μl的CCK-8，混勻后繼續(xù)培養(yǎng)1～4h，注意避光操作。酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔OD值。每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

1.6 Western blot法檢測(cè)p-ERK1/2及caveolin-1表達(dá) 大鼠ASMC分組為正常組、哮喘組、TGF-β1（10μg/ L）組和TGF-β1（10μg/L）+PD-98059組，培養(yǎng)同上。收集細(xì)胞，提取蛋白質(zhì)，上樣檢測(cè)，化學(xué)發(fā)光試劑顯色，膠片貼近曝光，顯影、定影后用AlphaEaseFC 4.0軟件分析目的蛋白相對(duì)含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織支氣管病理改變 與正常組相比，哮喘組大鼠支氣管壁及支氣管平滑肌明顯增厚，黏膜下水腫，黏膜下層增寬，黏膜皺褶增多，管腔狹窄，氣道上皮細(xì)胞脫落，杯狀細(xì)胞增多，黏膜下及管周有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（包括嗜酸粒細(xì)胞），見圖1。

圖1 大鼠肺組織支氣管病理改變（A：正常組；B：哮喘組；HE染色，×200）

2.2 各組大鼠ASMC鑒定 倒置顯微鏡下觀察見細(xì)胞呈梭形，有較長(zhǎng)的突起，圓形細(xì)胞核位于細(xì)胞中央，呈疏密相間、典型“峰和谷”生長(zhǎng)狀態(tài)。SM α-actin免疫組化染色產(chǎn)物呈棕黃色，95%細(xì)胞染色陽(yáng)性，證實(shí)傳代培養(yǎng)的細(xì)胞為ASMC，見圖2。

圖2 各組大鼠ASMC鑒定（A：形態(tài)學(xué)觀察，×100；B：SMα-actin免疫組化鑒定，SABC法染色，×200）

2.3 各組ASMC增殖情況 與1μg/L TGF-β1組細(xì)胞OD值 0.946±0.041比較，10μg/L TGF-β1組 1.018± 0.042和100μg/L TGF-β1組OD值1.019±0.435均明顯增加（均P＜0.01），10μg/L TGF-β1組和100μg/L TGF-β1組比較則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。1μg/L TGF-β1組作用24h時(shí)細(xì)胞OD值為0.946±0.041，而作用48h時(shí)為 0.988±0.038；10μg/L TGF-β1組作用 24h時(shí)為1.018±0.042，而作用 48h時(shí)為 1.083±0.037；100μg/L TGF-β1組作用24h時(shí)為1.019±0.435，而作用48h時(shí)為1.104±0.039，各濃度作用48h均較24h增殖作用明顯（均P＜0.05）。

進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，10μg/L TGF-β1組細(xì)胞OD值1.222±0.143較正常組0.867±0.109和哮喘組1.008± 0.161增加明顯（均P＜0.01）；TGF-β1+PD-98059組1.114±0.147較10μg/L TGF-β1組則減低（P＜0.05），但較哮喘組仍增加（P＜0.05）；PD-98059組與哮喘組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。

2.4 各組ASMC中p-ERK1/2及caveolin-1的表達(dá)情況 10μg/L TGF-β1作用后，p-ERK1/2表達(dá)逐漸增強(qiáng)，作用20min時(shí)p-ERK1/2表達(dá)達(dá)到高峰，見圖3。10μg/L TGF-β1組p-ERK1/2表達(dá)量較正常組和哮喘組增加（均P＜0.05）；TGF-β1+PD-98059組較TGF-β1組p-ERK1/2表達(dá)量減少，但較哮喘組表達(dá)量仍有所增加（均P＜0.05）。10μg/L TGF-β1組caveolin-1表達(dá)量較正常組、哮喘組減少（均P＜0.05），且TGF-β1+PD-98059組caveolin-1表達(dá)量較TGF-β1組增加（P＜0.05），見圖4。

圖3 各組ASMC中p-ERK1/2的表達(dá)（A：30min；B：20min；C：15min；D：10min；E：5min；F：0min）

圖4 各組ASMC中caveolin-1及p-ERK1/2的表達(dá)（N：正常組；T+P：10μg/L TGF-β1+PD-98059組；T：10μg/L TGF-β1組；A：哮喘組）

3 討論

既往研究已證實(shí)，TGF-β1與氣道重塑有重要的關(guān)系[4]，如果氣道受到反復(fù)抗原刺激引起持續(xù)的慢性炎癥，就可導(dǎo)致TGF-β1持續(xù)過度增高，從而引起組織纖維化、氣道重塑及氣道慢性阻塞[5]。本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠慢性哮喘模型，原代分離培養(yǎng)大鼠ASMC，經(jīng)過不同濃度和時(shí)間的作用，發(fā)現(xiàn)TGF-β1能促進(jìn)ASMC增殖，并有一定的時(shí)間和濃度依賴性。10μg/L與100μg/L TGF-β1組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，筆者推測(cè)這與本實(shí)驗(yàn)條件下TGF-β1受體表達(dá)可能已近峰值有關(guān)。

ERK通路是與細(xì)胞增殖相關(guān)的一條重要的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，作為關(guān)鍵酶的ERK存在多種亞型，已有研究證明，ERK1/2主要分布在ASMC上[6]。Lee等[7]研究認(rèn)為ERK1、ERK2在ASMC增殖的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮重要作用，有研究表明TGF-β1可能通過ERK信號(hào)途徑促使大鼠ASMC增殖[8]，F(xiàn)inlay等[9]證實(shí)PD-98059是ERK1/2信號(hào)通路的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，它們通過特異性地抑制其上游激酶MEK1/2的活性進(jìn)而阻斷ERK1/2通路的激活，由此抑制了細(xì)胞的增殖和表型的轉(zhuǎn)化。本研究結(jié)果顯示隨著10μg/L TGF-β1作用時(shí)間延長(zhǎng)，ASMC中p-ERK1/2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，作用20min時(shí)達(dá)高峰，30min時(shí)減弱，說明TGF-β1能促進(jìn)p-ERK表達(dá)，并存在表達(dá)高峰。本研究還顯示TGF-β1組較正常組和哮喘組p-ERK1/2表達(dá)量增加，加入抑制劑PD-98059干預(yù)后，其表達(dá)量較TGF-β1組減少，但仍高于哮喘組，提示了TGF-β1促進(jìn)大鼠ASMC的增殖與ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路有關(guān)，PD-98059能抑制上述效應(yīng)，但不能使其恢復(fù)至對(duì)照組水平，說明TGF-β1引起的細(xì)胞增殖過程中，ERK通路可能不是唯一途徑。

caveolin-1位于細(xì)胞表面，與膽固醇的轉(zhuǎn)運(yùn)、胞飲作用及信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)密切相關(guān)，其與多種信號(hào)分子存在反向調(diào)節(jié)關(guān)系。Gosens等[10]研究顯示caveolin-1在人類哮喘ASMC中有明顯的抗有絲分裂的作用。本實(shí)驗(yàn)中TGF-β1組較正常組和哮喘組caveolin-1表達(dá)量減少，抑制劑PD-98059干預(yù)后表達(dá)量增加，提示caveolin-1可能參與了TGF-β1通過ERK信號(hào)傳導(dǎo)通路促進(jìn)ASMC增殖的過程。

綜上所述，本研究結(jié)果表明TGF-β1促進(jìn)ERK通路的活化在哮喘氣道重塑中發(fā)揮著重要的作用，其可能是通過調(diào)節(jié)caveolin-1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的。抑制TGF-β1的分泌及ERK通路的活化可以有效阻止ASMC異常增殖，從而減緩哮喘的氣道重塑，本研究可能為哮喘氣道重塑的防治提供了一種新思路。

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Effect of TGF-β1 on proliferation of airway smooth muscle cells in asthma rats

Objective To investigate the effect of TGF-β1 on the proliferation of airway smooth muscle cells(ASMCs)in asthma rats．MethodsChronic asthma model was induced in rats and airway smooth muscle cells were isolated and cultured in vitro．The cultured ASMCs were divided into normal group,asthma group,TGF-β1 group and TGF-β1+PD-98059 group．The cell proliferation was determined with CCK-8 method and the expression of caveolin-1 and p-ERK1/2 protein was detected with Western blot．ResultsThe expression of p-ERK1/2 increased significantly in TGF-β1 group compared with other 3 groups(P＜0．05),while the expression in TGF-β1+PD-98059 group was higher than that in asthma group(P＜0．05)．The expression of caveolin-1 in TGF-β1 group was lower than that in the normal group and asthma group as well as in TGF-β1+PD-98059 group (P＜0．05)．ConclusionTGF-β1 can down-regulate the expression of protein caveolin-1 to activate the ERK pathway,thereby to promote the proliferation of airway smooth muscle cells,which finally causes airway remodeling．

TGF-β1 Asthma ASMC Caveolin-1 ERK

2013-09-22）

（本文編輯：胥昀）

浙江省衛(wèi)生廳課題（2009A144）

325027 溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科（吳立琴、戴元榮、李鳳琴），ICU（王瑞麗），急診科（曾濰賢）

戴元榮，E-mail：daiyr@126.com