A型肉毒毒素對大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導因子-1α及血管內皮細胞生長因子表達的影響

周鵬 張心男 徐智慧

A型肉毒毒素對大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導因子-1α及血管內皮細胞生長因子表達的影響

周鵬 張心男 徐智慧

目的 探討A型肉毒毒素（BTX-A）對大鼠前列腺增生組織中缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）和血管內皮細胞生長因子（VEGF）表達的影響。方法取60只大鼠，實驗組45只，空白對照組15只。實驗組大鼠均制作前列腺增生模型，1周后兩組均隨機處死5只大鼠觀察建模是否成功。實驗組剩余大鼠隨機分為高劑量組（注射10U/0．1ml BTX-A）、中劑量組（注射6U/0．1ml BTX-A）、低劑量組（注射2U/0．1ml BTX-A）、陰性對照組（注射0．1ml0．9%氯化鈉溶液），術后各組繼續(xù)給予長效雄激素（十一酸睪酮針4mg· kg-1·d-1）維持，空白對照組仍給予等量橄欖油皮下注射。4周后處死各組大鼠，取出前列腺稱重，免疫組化法檢測比較各組大鼠前列腺組織中HIF-1α和VEGF的表達情況。結果大鼠前列腺增生模型建立成功。實驗組大鼠HIF-1α在細胞質與細胞核均有表達，在新生血管周圍表達明顯增強，而VEGF的表達主要在細胞質中。與空白對照組比較，其他各組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0．05）；與陰性對照組比較，低、中、高劑量組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0．05）。空白組及陰性對照組均未見HIF-1α的表達；與空白對照組比較，高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達率及灰度值、陰性對照組VEGF灰度值均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）；與陰性對照組比較，中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達率和高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的灰度值均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）；與低劑量組比較，高、中劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達率及灰度值均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）；與中劑量組比較，高劑量組VEGF的陽性表達率及灰度值和HIF-1α的陽性表達率均發(fā)生明顯變化（均P＜0．05）。實驗組大鼠HIF-1α與VEGF的表達呈明顯正相關關系（r=0．575，P＜0．01）。結論前列腺內注射BTX-A可以通過抑制HIF-1α和VEGF的表達，從而抑制前列腺組織的血管形成，促使前列腺縮小。

前列腺增生 A型肉毒毒素 缺氧誘導因子-1α 血管內皮細胞生長因子

良性前列腺增生（月PH）是老年男性常見病，目前其臨床治療主要以藥物、手術治療為主，但都存在一定不良反應。因此尋找一種安全、有效、不良反應小、微創(chuàng)的月PH治療方法十分必要[1]。國外已有學者利用A型肉毒毒素（月TX-A）的去神經化對 月PH患者行前列腺內月TX-A注射治療，但對其具體使用方法及可能的作用機制尚未闡明。本研究通過將不同劑量月TX-A注射于月PH大鼠前列腺腺體后，檢測其對于缺氧誘導因子1α（HIF-1α）和血管內皮生長因子（VEGF）蛋白表達的影響，旨在明確月TX-A對前列腺組織血管形成方面可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料 動物：健康清潔級Wistar雄性大鼠60只，體重（200±25）g；由中科院上海動物實驗中心提供，顆粒飼料喂養(yǎng)。試劑：丙酸睪丸酮注射液為廣州制藥有限公司產品；十一酸睪酮注射液為浙江仙居制藥有限公司產品；月TX-A為中國生物技術集團公司蘭州生物制品研究所產品。使用時配成所需濃度。即用型SP試劑盒及DA月顯色劑均購自福州邁新公司，HIF-1α濃縮液單克隆抗體購于Labvision公司，抗體滴度1∶100。

1.2 動物分組及處理 采用隨機數字表法將60只大鼠分為空白對照組（15只）及實驗組（45只）。實驗組大鼠手術切除雙側睪丸，給予皮下注射十一酸睪酮針4mg/（d·kg）建模，連續(xù)1周；空白對照組給予手術暴露睪丸，皮下注射等量的橄欖油，連續(xù)1周。1周后隨機處死5只實驗組及5只空白對照組大鼠，進行HE染色，由2位病理科醫(yī)師依據光鏡觀察判斷大鼠前列腺增生模型是否建模成功。確定建模成功后，實驗組剩余大鼠再次隨機分為高劑量組（注射10U/0.1ml月TXA）、中劑量組（注射6U/0.1ml月TX-A）、低劑量組（注射2U/0.1ml月TX-A）、陰性對照組（注射0.1ml0.9%氯化鈉溶液），術后各組繼續(xù)給予長效雄激素維持（十一酸睪酮針4mg·kg-1·d-1），空白對照組仍給予等量橄欖油皮下注射。并于術后4周觀察大鼠的反應。最終處死所有大鼠，稱取大鼠凈重，并取出前列腺組織，分析天平稱取腺體。

1.3 結果判定 常規(guī)固定，石蠟切片，HE染色，光鏡下觀察組織病理學改變。采用免疫組化SP法對切片染色，每張切片隨機選取高倍（×100）視野下5～10個視野，計算100個細胞的陽性細胞數，取平均值，以百分數表示表達率。應用月LTDMC-2080病理圖文分析系統計算切片所選視野的灰度值用以評價免疫組化結果的陽性信號強弱，從而對于染色結果進行客觀定量分析。

1.4 統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件，計量資料均以表示，組間比較采用方差分析，率的比較采用χ2檢驗，相關性采用Spearman相關分析。

2 結果

2.1 光鏡下HE染色觀察結果 見圖1。

圖1 大鼠前列腺增生組織HE染色情況（A：×50；B：×100）

由圖1可見，實驗組大鼠1周時前列腺組織腺體排列明顯密集、腺腔呈鋸齒擴張明顯、呈乳頭狀增生突向腺腔內，提示大鼠前列腺增生模型建立成功。

2.2 光鏡下大鼠前列腺組織免疫組化染色觀察結果 見圖2。

圖2 大鼠前列腺組織免疫組化染色情況（A：HIF-1α在高劑量組大鼠前列腺組織呈弱陽性表達；B：HIF-1α在中劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達；C：新生血管旁HIF-1α在低劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達；D：VEGF在高劑量組大鼠前列腺組織呈弱陽性表達；E：VEGF在中劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達；F：VEGF在低劑量組大鼠前列腺組織呈陽性表達；SP法，×100）

由圖2可見，實驗組大鼠HIF-1α在細胞質與細胞核均有表達，在新生血管周圍表達明顯增強，而VEGF的表達主要在細胞質中。

2.3 各組大鼠凈重及前列腺濕重的比較 見表1。

表1 5組大鼠凈重及前列腺重量的比較

由表1可見，各組大鼠凈重的差異均無統計學意義（均P＞0.05）。與空白對照組比較，其他各組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與陰性對照組比較，低、中、高劑量組大鼠前列腺濕重均發(fā)生明顯增加，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.4 各組大鼠HIF-1α及VEGF表達情況的比較 見表2。

表2 各組大鼠HIF-1α及VEGF表達情況的比較

由表2可見，空白組及陰性對照組均未見HIF-1α的表達；與空白對照組比較，高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達率及灰度值、陰性對照組VEGF灰度值均發(fā)生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與陰性對照組比較，中、低劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達率和高、中、低劑量組VEGF及HIF-1α的灰度值均發(fā)生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與低劑量組比較，高、中劑量組VEGF及HIF-1α的陽性表達率及灰度值均發(fā)生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0.05）；與中劑量組比較，高劑量組VEGF的陽性表達率及灰度值和HIF-1α的陽性表達率均發(fā)生明顯變化，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。

2.5HIF-1α與VEGF表達的相關性 實驗組大鼠HIF-1α與VEGF的表達呈明顯正相關關系（r=0.575，P＜0.01）。

3 討論

月TX是梭狀芽孢桿菌產生的一種嗜神經毒素，可作用于膽堿能神經末梢，抑制乙酰膽堿的釋放和傳遞，產生去神經化作用，導致肌肉松弛麻痹；大劑量注射則會引起肌肉萎縮。既往的文獻報道多集中于尿道括約肌及膀胱逼尿肌的應用，近年來越來越多的目光轉向前列腺疾病。Chuang等[2]通過對SD大鼠模型前列腺組織的腹側葉給予不同劑量的月TX-A注射，再分別間隔1～2周，分別應用免疫組化和TUNEL及Western blot分別檢測其對于細胞增殖、凋亡的影響，結果顯示高劑量月TX-A能顯著減少前列腺體積，增加細胞凋亡，抑制細胞增殖，與Lin等[3]的研究結果相似。在文結果亦顯示，隨著腺體內月TX-A劑量的逐步增大，前列腺的體積逐漸縮小，濕重也逐步降低。

既往對于肉毒毒素的前列腺疾病治療的理論依據在于前列腺腺體內注射后觀察到腺體有萎縮現象，所引起前列腺萎縮多用其封閉局部交感或副交感神經末梢分泌的腎上腺素或乙酰膽堿來解釋，作用機制為去神經化后所致細胞凋亡。目前，隨著對血管形成因素的研究不斷深入，發(fā)現前列腺增生組織也和實體瘤一樣取決于新生血管及微環(huán)境的改變，尤其是去勢之后，前列腺組織內血管內皮細胞凋亡，導致局部組織缺血，前列腺腺上皮細胞凋亡。HIF-1α就是新近發(fā)現的一個非常重要的調節(jié)因子，它對VEGF的調控主要是通過與一種特異的VEGF DNA低氧性應答物質連接，進而促進mRNA的轉錄，增強mRNA穩(wěn)定性，從而增加VEGF的表達[4]。

Rudolfsson等[5]的研究表明，通過Western blot技術可以檢測到去勢前后HIF-1α蛋白相差近20倍。劉孝東等[6]發(fā)現，VEGF蛋白在大鼠前列腺的血管內皮及腺上皮細胞上均有表達。SD大鼠去勢后，其前列腺組織中的VEGF及其受體FLK-1的蛋白表達明顯降低，而給去勢后大鼠注射外源性睪酮，VEGF及其受體FLK-1的蛋白表達又明顯升高，表明睪酮可正向調節(jié)大鼠前列腺組織中VEGF的表達。Nishiyama等[7]研究發(fā)現，切除大鼠的雙側睪丸后，前列腺內的血流急劇減少，術后18h血流減少35%，24h減少50%。說明雄激素去除可能對大鼠前列腺的微血管造成影響，若立即給予睪酮則不發(fā)生上述現象。去勢后的大鼠，最早出現凋亡的細胞是大量的前列腺血管內皮細胞，若再給予睪酮，首先發(fā)生增殖的細胞為前列腺血管內皮細胞而非上皮細胞，說明血管內皮細胞才是前列腺中睪酮的最初靶細胞[8]。

本實驗結果表明，在大鼠前列腺增生組織中由于局灶性缺氧的存在，可以檢出有HIF-1α表達，隨著月TXA的劑量的加大，VEGF和HIF-1α的表達明顯降低，提示其可能存在與血管生成有關的調控機制。有關月TXA與HIF-1α、VEGF及血管新生關系的機制可能為：隨著前列腺的不斷生長、體積增大，血供不足發(fā)生缺氧壞死，誘導HIF-lα過度表達，而HIF-1α能增強其下游靶基因VEGF的表達，活化的HIF-1α與靶基因上的HIF-1α結合位點結合，形成轉錄起始復合物，從而啟動靶基因轉錄和相應的蛋白產物增加，VEGF表達增加，VEGF進而作用于血管內皮細胞表面的VEGFRI和VEGFR2，從而激活了一系列的缺氧轉導通路，誘導新生血管的形成，而月TX則是通過作用于HIF-1α之前來調控血管形成。但在對大鼠前列腺體積的分析中，筆者發(fā)現前列腺濕重降低并非與月TX-A的劑量成量效關系，其僅在低劑量及高劑量組間有差別，仍需增加樣本量或者調節(jié)實驗分組來證實。另外，本文結果與Anger[9]等及Safari[10]等的既往研究結果有所矛盾，提示膀胱逼尿肌細胞與前列腺內皮細胞對于月TX的作用靶點不同，仍需后續(xù)實驗進一步證實。

目前，關于月TX-A注射與局部新生血管形成及細胞微環(huán)境改變的研究國內外尚未見報道。本實驗通過研究肉毒毒素在Wistar大鼠前列腺模型中的表達，提示肉毒毒素通過血管因素調節(jié)前列腺增生。但是由于嚙齒動物與人在解剖上的差異，體外培養(yǎng)與體內環(huán)境的不同，各組實驗報道中應用月TX-A的劑量不盡相同，如何選取最小劑量，仍需在劑型、給藥方式等方面做出改進。但可以肯定的是，月TX-A注射作為一種微創(chuàng)、安全的方法，對于廣大前列腺疾病患者改善癥狀具有重要意義，但不良反應及遠期效果仍需進一步觀察。

[1]Ilie C P,Chancellor M B．Perspective of Botox for treatment of male lowerurinarytractsymptoms[J]．CurrOpinUrol,2009,19(1):20-25．

[2]Chuang Y C,Chancellor M B．The application of botulinum toxin in the prostate[J]．J Urol,2006,176(6 Pt 1):2375-2382．

[3]Lin VK．Botulinum toxin and cellular proliferation in the prostate[J]．J Urol,2006,175(3 Pt 1):817．

[4]Liu L,Ai J,Xiao W,et al．ELL is an HIF-1alpha partner that regulates and responds to hypoxia response in PC3 cells[J]．Prostate, 2010,70(7):797-805．

[5]Rudolfsson S H,Bergh A．Testosterone-stimulated growth of the rat prostate may be driven by tissue hypoxia and hypoxia-inducible factor-1alpha[J]．J Endocrinol,2008,196(1):11-19．

[6]劉孝東,董強．睪酮對血管內皮生長因子及其受體在大鼠前列腺組織中表達的影響[J]．華西醫(yī)科大學學報,2002,33（2）:226-228．

[7]Nishiyama Y,Yokoyama T,Tomizawa K,et al．Effects of purified newly developed botulinum neurotoxin type A in rat prostate[J]．Urology,2009,74(2):436-439．

[8]Silva J,Pinto R,Carvallho T,et al．Mechanisms of prostate atrophy after glandular botulinum neurotoxin type a injection:an experimental study in the rat[J]．Eur Urol,2009,56(1):134-140．

[9]Safari S,Jamali S,Habibollahi P,et al．Intravesical injections of botulinum toxin type A for management of neuropathic bladder:a comparison of two methods[J]．Urology,2010,76(1):225-230．

[10]Anger J T,Weinberg A,Suttorp M J,et al．Outcomes of intravesical botulinum toxin for idiopathic overactive bladder symptoms: a systematic review of the literature[J]．J Urol,2010,183(6):2258-2264．

（本文編輯：歐陽卿）

《浙江醫(yī)學》對圖表的要求

稿件中若有圖表，分別按其在正文中出現的先后次序連續(xù)編碼。每幅圖應冠有圖題。說明性的文字應置于圖下方注釋中，并在注釋中標明圖表中使用的全部非公知公用的縮寫。線條圖應墨繪在白紙上，高寬比例以5∶7為宜。以計算機制圖者應提供激光打印圖樣。照片圖要求有良好的清晰度和對比度；圖中需標注的符號（包括箭頭）請用另紙標上，不要直接寫在照片上。每幅圖的背面應貼上標簽，注明圖號、方向及作者姓名。若刊用人像，應征得本人的書面同意，或遮蓋其能被辨認出系何人的部分。大體標本照片在圖內應有尺度標記。病理照片要求注明染色方法和放大倍數。圖表中如有引自他刊者，應注明出處。電子版投稿中圖片建議采用JPG格式。表格建議采用三橫線表（頂線、表頭線、底線），如遇有合計和統計學處理內容（如 值值等），則在此行上面加一條分界橫線；表內數據要求同一指標有效位數一致，一般按標準差的1/3確定有效位數。

本刊編輯部

Effect of botulinum toxin type A on expression of HIF-1α and VEGF in rat prostatic tissue of hyperplasia

Objective To investigate the effect of botulinum toxin type A(BTX-A)on the expression of HIF-1a and VEGF in rat prostatic tissues of hyperplasia．MethodsSixty Wistar rats were randomly divided into experimental(n=45)and control (n=15)groups．Orchietectomy was performed in experimental group and androgen 4mg·kg-1·d-1was administrated;the sham operation was performed in control group and liver oil was given instead．Five rats were sacrificed in each group to observe the hyperplasia in prostate glands after 1 week．Different doses of BTX-A were injected in the prostate of the castrated rats in H-dose(10U/0．1ml,n=10),M-dose(6U/0．1ml,n=10),L-dose(2U/0．1ml,n=10)and NS(NS/0．1ml,n=10)groups．After 4 weeks rats were sacrificed and the prostate glands were taken for weighting,the expression of HIF-1α and VEGF were analyzed by immunohistochemical technique．ResultsThe HIF-1α detected in cytoplasm and nucleus,especially around the new vessels, the VEGF was detected only in cytoplasm．The weight of prostate in 4 experimental groups were significant higher than that in control group (P＜0．05)．The positive rate and grey value of HIF-1α and VEGF in H-,M-and L-dose groups and VEGF in NS group were significantly higher than those in control group(P＜0．05)．The positive rate and grey values of HIF-1α and VEGF in H-,M-and L-dose groups were significantly higher than those in NS group(P＜0．05)．There were also significant differences in positive rate and grey values of HIF-1α and VEGF among H-,M-and L-dose groups(P＜0．05)．The HIF-1α expression was closely correlated with VEGF expression(r=0．575,P＜0．01)．ConclusionBTX-A can regulate the expression of HIF-1α andVEGF of prostatic tissues,resulting in the inhibition of vascularization and attenuating hyperplasia of prostate gland．

Prostatic hyperplasia Type A botulinum toxin Hypoxia inducible factor-1α Vascular endothelial growth factor

2013-05-03）

310009 杭州市第三人民醫(yī)院泌尿外科（周鵬）；浙江省立同德醫(yī)院泌尿外科（張心男）；浙江省人民醫(yī)院泌尿外科（徐智慧）