紫杉醇生物可降解支架對(duì)豬損傷后膽管α平滑肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響

楊瑾 蔡秀軍

紫杉醇生物可降解支架對(duì)豬損傷后膽管α平滑肌動(dòng)蛋白及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1表達(dá)的影響

楊瑾 蔡秀軍

目的 觀察紫杉醇涂層生物可降解支架對(duì)豬損傷后膽總管愈合過(guò)程中的α平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）表達(dá)的影響。方法采用浸泡法制作紫杉醇涂層生物可降解膽道支架。構(gòu)建豬肝外膽管損傷修復(fù)模型，將紫杉醇生物可降解支架及裸支架分別置入豬膽管中，每組15只（分別為實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組）。分別于術(shù)后1、3、6個(gè)月各處死5只并取材，觀察吻合口愈合情況，行免疫組化測(cè)定吻合口α-SMA和TGF-β1的表達(dá)情況。結(jié)果自行研制造的全新紫杉醇生物完全可降解膽道支架獲得成功。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1、3、6個(gè)月α-SMA及TGF-β1著色強(qiáng)度及面積評(píng)分較高的分布均較對(duì)照組低，其中術(shù)后3、6個(gè)月兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后6個(gè)月與術(shù)后1、3個(gè)月α-SMA著色強(qiáng)度及面積評(píng)分分布的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05），而對(duì)照組術(shù)后6個(gè)月僅與術(shù)后3個(gè)月的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3、6個(gè)月與術(shù)后1個(gè)月TGF-β1著色強(qiáng)度及面積評(píng)分分布的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05），而對(duì)照組術(shù)后6個(gè)月僅與術(shù)后1個(gè)月的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。結(jié)論紫杉醇涂層生物可降解支架能降低豬損傷后膽管α-SMA、TGF-β1的表達(dá)，可在一定程度上抑制膽管狹窄趨勢(shì)。

紫杉醇 藥物洗脫支架 膽道 α平滑肌動(dòng)蛋白 轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

目前，膽道狹窄的處理仍是膽道外科的一大難題，突出表現(xiàn)為術(shù)后膽道瘢痕性攣縮和管腔狹窄，其成因主要與膽管壁特殊的組織結(jié)構(gòu)與生理特點(diǎn)有關(guān)。膽總管屬于纖維彈性管道，愈合過(guò)程中由于受到膽汁、細(xì)菌感染等反復(fù)刺激導(dǎo)致巨噬細(xì)胞大量聚集，持續(xù)合成轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）等生長(zhǎng)因子而使黏膜下大量原有的纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為功能活躍的成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致膠原過(guò)度合成，管腔瘢痕形成。成纖維細(xì)胞在TGF-β1持續(xù)刺激下還可轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞（MF月）。從成纖維細(xì)胞到MF月需要有α平滑肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)，α-SMA的表達(dá)是MF月分化最顯著的標(biāo)記。而MF月的大量增生被認(rèn)為是導(dǎo)致膽管瘢痕性攣縮的重要原因。紫杉醇是一種從紅豆杉中分離得到的天然抗癌藥物，可以抑制膽管上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增生與遷移。本研究通過(guò)將紫杉醇涂層多聚乳酸生物可降解支架應(yīng)用于豬膽管損傷模型，動(dòng)態(tài)觀察該支架對(duì)豬損傷后膽管的TGF-β1和α-SMA表達(dá)的影響，評(píng)估其對(duì)膽管損傷后瘢痕狹窄形成的防治作用，從而為臨床防治膽道狹窄探索新途徑。

1 材料和方法

1.1 紫杉醇涂層多聚乳酸生物可降解支架的制備 主體支架為聚左旋乳酸生物可降解支架，由浙江大學(xué)高分子材料系協(xié)助合成。涂層材料為共聚物P（LLA-co-CL），以單體L-丙交酯（L-LA）和ε-己內(nèi)酯（ε-CL）為原料，開(kāi)環(huán)聚合而成。紫杉醇涂層材料配方為100mg紫杉醇粉末+900mg P（LLA-co-CL）+40ml四氫呋喃（THF）。將P（LLA-co-CL）共聚物切割成細(xì)小顆粒狀，按上述比例與紫杉醇粉末溶于兩者的共同溶劑THF中。將已經(jīng)滅菌處理的聚左旋乳酸膽道支架逐一浸泡于上述溶液中，頃刻拿出后經(jīng)真空烘干箱于30℃、-0.1Mpa條件下烘干至衡重。對(duì)照組支架為無(wú)紫杉醇藥物的涂層支架，涂層材料配方為900mg P（LLA-co-CL）+40mlTHF，制作方法同上。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及手術(shù)方式 健康巴馬小型豬30只（上海妙迪生物科技有限公司提供），體重12～15kg。隨機(jī)分為紫杉醇支架組（實(shí)驗(yàn)組）和裸支架組（對(duì)照組），每組15只。采用氯胺酮、速眠新Ⅱ聯(lián)合麻醉。距十二指腸上緣2cm處游離出膽總管（上下游離范圍不超過(guò)1cm），沿橫向切開(kāi)膽總管前壁制作膽管損傷模型，切開(kāi)范圍不超過(guò)膽總管兩側(cè)縱軸，約為其周徑1/3～1/2。將已制備的紫杉醇可降解支架或裸支架置入膽總管內(nèi)。以4-O Vicryl線(xiàn)作黏膜對(duì)黏膜外翻全程吻合，針距約0.5～0.6cm，邊距0.3～0.4cm。

1.3 標(biāo)本采集及指標(biāo)檢測(cè) 兩組分別于術(shù)后1、3、6個(gè)月各取5只小豬，從原切口進(jìn)腹。觀察腹腔粘連情況及吻合口愈合情況。剪開(kāi)吻合口觀察大體標(biāo)本后，取吻合口及上下0.5cm左右膽管組織浸泡于10%甲醛溶液中固定，行SMA、TGF-β1免疫組化染色。兔抗豬α-SMA多克隆抗體購(gòu)自Abcam，免疫組化染色試劑盒購(gòu)自中杉金橋生物技術(shù)有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。兔抗豬TGF-β1多克隆抗體購(gòu)自月iovision公司，二步法抗兔通用型免疫組化檢測(cè)試劑盒購(gòu)自基因科技有限公司，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明操作。

1.4 結(jié)果判定 正常膽管α-SMA陽(yáng)性?xún)H表達(dá)于膽管、血管壁的少量平滑肌。以細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜染成棕黃色為陽(yáng)性，α-SMA陽(yáng)性表達(dá)于MF月胞質(zhì)、血管、膽管平滑肌、中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎性細(xì)胞。正常膽管TGF-β1表達(dá)陰性。以細(xì)胞質(zhì)和/或細(xì)胞膜染成棕黃色為陽(yáng)性。TGF-β1陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于肉芽組織、F月、巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等炎細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞胞質(zhì)和細(xì)胞膜。根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的著色強(qiáng)度評(píng)分：“-”為陰性細(xì)胞，評(píng)為0分；“+”為細(xì)胞膜和/或細(xì)胞質(zhì)染成淡棕黃色，評(píng)為1分；“+++”為深棕色評(píng)為3分；“++”則介于“+”與“+++”之間，評(píng)為2分。陽(yáng)性細(xì)胞面積評(píng)分：陽(yáng)性細(xì)胞所占面積＜總細(xì)胞數(shù)的25%評(píng)為1分；25%～50%評(píng)為2分；＞50%評(píng)為3分。兩項(xiàng)分?jǐn)?shù)相加，即為最終得分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，獨(dú)立樣本采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，配對(duì)樣本采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)成功制備紫杉醇生物完全可降解膽道支架，測(cè)得支架紫杉醇載荷量為（923±7.40）μg。

2.1 大體形態(tài)學(xué)觀察 所有手術(shù)均順利完成，麻醉滿(mǎn)意，無(wú)術(shù)中死亡發(fā)生。兩組動(dòng)物術(shù)后均恢復(fù)順利，無(wú)死亡及明顯膽瘺、膽道梗阻發(fā)生。術(shù)后1個(gè)月兩組膽管略有水腫，吻合口支架均在位，吻合口愈合良好；術(shù)后3個(gè)月支架均完全降解，實(shí)驗(yàn)組吻合口無(wú)明顯狹窄現(xiàn)象，對(duì)照組可見(jiàn)膽管壁增厚，吻合口狹窄，遠(yuǎn)端膽管擴(kuò)張；術(shù)后6個(gè)月實(shí)驗(yàn)組膽管無(wú)明顯擴(kuò)張狹窄現(xiàn)象，對(duì)照組膽管壁增厚，吻合口狹窄、遠(yuǎn)端膽管擴(kuò)張較為明顯。

2.2 兩組免疫組化染色情況 見(jiàn)圖1。

2.3 兩組α-SMA不同陽(yáng)性程度分布的比較 見(jiàn)表1。

表1 兩組α-SMA不同陽(yáng)性程度分布的比較（例）

由表1可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1、3、6個(gè)月α-SMA著色強(qiáng)度及面積評(píng)分較高的分布均較對(duì)照組低，其中術(shù)后3、6個(gè)月兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后6個(gè)月與術(shù)后1、3個(gè)月α-SMA著色強(qiáng)度及面積評(píng)分分布的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），而對(duì)照組術(shù)后6個(gè)月僅與術(shù)后3個(gè)月的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 兩組TGF-β1不同陽(yáng)性程度分布的比較 見(jiàn)表2。

圖1 免疫組化染色（A：α-SMA陽(yáng)性表達(dá)；B：血管平滑肌α-SMA自身陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照表達(dá)；C：TGF-β1陽(yáng)性表達(dá)；D：血管平滑肌TGF-β1自身陽(yáng)性?xún)?nèi)對(duì)照表達(dá)；×400）

表2 兩組TGF-β1不同陽(yáng)性程度分布的比較（例）

由表2可見(jiàn)，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后1、3、6個(gè)月TGF-β1著色強(qiáng)度及面積評(píng)分較高的分布均較對(duì)照組低，其中術(shù)后3、6個(gè)月兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3、6個(gè)月與術(shù)后1個(gè)月TGF-β1著色強(qiáng)度及面積評(píng)分分布的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而對(duì)照組術(shù)后6個(gè)月僅與術(shù)后1個(gè)月的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

目前，損傷后膽管纖維化狹窄的處理仍是臨床膽道外科的一大難題[1]。隨著膽道外科工作的不斷普及和腹腔鏡手術(shù)的逐步推廣，損傷后膽管狹窄的問(wèn)題，變得更加突出。據(jù)統(tǒng)計(jì)，膽道術(shù)后繼發(fā)膽管狹窄的發(fā)生率高達(dá)70%～80%，更有甚者由此引發(fā)阻塞性黃疸、多臟器功能損害甚至死亡等嚴(yán)重并發(fā)癥。當(dāng)前臨床上尚缺乏理想的干預(yù)手段來(lái)有效的防治術(shù)后膽道瘢痕狹窄，如何預(yù)防及治療膽管狹窄已成為當(dāng)今外科界所面臨的棘手問(wèn)題。

紫杉醇是從紅豆杉中分離得到的一種天然抗癌藥物，可以牢固結(jié)合于微管β亞單位并可抑制微管動(dòng)力，激活或調(diào)節(jié)多種與凋亡相關(guān)的基因或蛋白，抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。現(xiàn)作為一線(xiàn)藥物廣泛應(yīng)用于多種腫瘤的臨床治療[2-3]。目前的研究表明，紫杉醇不僅能作用于多種腫瘤細(xì)胞，還能抑制血管平滑肌細(xì)胞，膽管上皮細(xì)胞與成纖維細(xì)胞的增生與遷移。這為其應(yīng)用于腫瘤以外領(lǐng)域奠定了扎實(shí)的理論基礎(chǔ)。

近年來(lái)，關(guān)于紫杉醇防治血管狹窄及組織纖維化方面的研究與報(bào)道漸增。國(guó)內(nèi)外多項(xiàng)研究報(bào)道了紫杉醇在治療冠狀動(dòng)脈狹窄、硬皮病及預(yù)防青光眼術(shù)后瘢痕形成等方面的確切療效[4-6]。紫杉醇在抗膽管纖維化狹窄方面的研究尚屬起步階段。Park等[7]利用尼龍線(xiàn)留存鼠膽總管制成增殖性膽管炎模型，成功驗(yàn)證了局部一次性給予紫杉醇藥物能在短期內(nèi)有效防止鼠膽管狹窄形成的結(jié)論，但具體機(jī)制不明。Choi等[8]通過(guò)體外培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)，紫杉醇能抑制由大腸桿菌脂多糖引起的肌成纖維細(xì)胞的過(guò)度增生及Ⅰ型膠原蛋白的合成，并認(rèn)為與其特異性地阻斷TGF-β1信號(hào)通路有關(guān)。Liu等[9]的研究也證實(shí)，低劑量紫杉醇能夠顯著抑制TGF-β1/Smad活性從而有效緩解硬皮病小鼠的纖維化程度。

TGF-β1是目前已知的與瘢痕形成最為密切、最具代表性的細(xì)胞因子，在損傷、炎癥及纖維化之間起著一個(gè)連接的作用[10]。它能影響愈合過(guò)程的所有階段，提供正常愈合所必需的信號(hào)物質(zhì)，當(dāng)這些信號(hào)受抑制、阻斷或過(guò)度表達(dá)時(shí)則可引起愈合不良或形成瘢痕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在膽管術(shù)后3～6個(gè)月傷口愈合晚期，TGF-β1在術(shù)后狹窄膽道組織中為高表達(dá)。由此可見(jiàn)，設(shè)法減少膽汁刺激引起炎癥反應(yīng)的量和程度，抑制TGF-β1過(guò)度表達(dá)及其活性，理論上將有助于預(yù)防和減輕術(shù)后膽道瘢痕增生和管腔狹窄。為此，筆者設(shè)計(jì)研發(fā)了紫杉醇涂層多聚乳酸支架，它是一種完全可降解支架，在體內(nèi)可以徹底降解為水和二氧化碳，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)和生物毒性。支架在位時(shí)可支撐吻合口、對(duì)抗膽管瘢痕收縮應(yīng)力，有利于吻合口成形，并在一定程度上起到隔絕膽汁的作用；同時(shí)，其作為藥物載體，在達(dá)到藥物緩釋效果后可完全降解，免除了拔管及相應(yīng)并發(fā)癥的發(fā)生，也擺脫了以往金屬支架永久存留的不良反應(yīng)。本文結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1的表達(dá)均低于對(duì)照組，其中術(shù)后3、6個(gè)月兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)支架持續(xù)釋放的紫杉醇藥物可抑制TGF-β1過(guò)度表達(dá)及其活性，從而達(dá)到減緩膽管纖維化狹窄的作用。

MF月在增生性瘢痕和纖維化疾病中持續(xù)存在被認(rèn)為是導(dǎo)致膽管瘢痕性攣縮的主要原因。從成纖維細(xì)胞到MF月需要有α-SMA的表達(dá)，α-SMA的表達(dá)是MF月分化最顯著的標(biāo)記，實(shí)際上也就成為MF月的重要標(biāo)志[11]。研究α-SMA在傷口愈合過(guò)程中的表達(dá)，可以更精確地了解MF月的生活周期和作用。本文結(jié)果顯示，對(duì)照組α-SMA各期表達(dá)均強(qiáng)于實(shí)驗(yàn)組，其中術(shù)后3、6個(gè)月兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示紫杉醇可以抑制成纖維細(xì)胞向MF月。目前，紫杉醇調(diào)控α-SMA表達(dá)的機(jī)制仍不明確，可能與TGF-β1有關(guān)。α-SMA在TGF-β1作用下促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞的增殖[12]，紫杉醇通過(guò)阻斷TGF-β1信號(hào)系統(tǒng)引起相應(yīng)的α-SMA的減少，從而進(jìn)一步抑制MF月的數(shù)量與功能。同時(shí)，TGF-β1還可通過(guò)自分泌方式正反饋調(diào)節(jié)TGF-β1mRNA及蛋白的表達(dá)與分泌。上皮下的TGF-β1可刺激成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化為MF月，從而促進(jìn)其產(chǎn)生更多的TGF-β1與Ⅰ型膠原蛋白，正反饋機(jī)制可逐步放大TGF-β1的增殖效應(yīng)，最終導(dǎo)致膽管壁纖維化增厚。因此，早期抑制TGF-β1的活性與數(shù)量，阻斷其正反饋回路，理論上可影響之后的纖維化進(jìn)程。

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Effect of paclitaxel-eluting biodegradable stent on expression of α-SMA and TGF-β1 in swine bile duct after injury

Objective To investigate the effect of a biodegradable paclitaxel-eluting biliary polylactide stent on the expression of α-smooth muscle actin(α-SMA)and transforming growth factor-beta1(TGF-β1)in swine bile duct after injury．MethodsThe paclitaxel-eluting biodegradable biliary polylactide stents were prepared by immersion method．A porcine bile duct injury model was established．Paclitaxel-eluting biodegradable stent were surgically inserted in the bile duct of 15 swines in experimental group,while biodegradable stent without paclitaxel were placed in rest 15 swines of control group．Animals were sacrificed 1,3 or 6 months after operation．The wound healing of the common bile duct was observed．The expression of α-SMA and TGF-β1 was also detected with immunohistochemical method．ResultsThe scores of staining intensity and the proportion of positively stained cells of α-SMA and TGF-β1 in paclitaxel group 3 and 6 months after the operation were lower than those in control group(P＜0．05)．In paclitaxel group,the difference of the score of staining intensity and the proportion of positively stained cells of α-SMA and TGF-β1 between 6 months after operation and 1 or 3 months after operation was significant(P＜0．05), whereas in control group,the difference was significant only between 6 months and 3 months(P＜0．05)．ConclusionLocal delivery of paclitaxel via a biodegradable stent can decrease the expression of α-SMA and TGF-β1 in the healing process of injured swine bile duct,which may be potentially used to relieve the billiary stricture．

Paclitaxel Drug-eluting stents Billiary tractα-SMA TGF-β1

2013-05-31）

（本文編輯：歐陽(yáng)卿）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院胃腸外科（楊瑾）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬邵逸夫醫(yī)院普外科（蔡秀軍）