BCL-2基因多態(tài)性與復(fù)治晚期非小細胞肺癌TKI治療療效的關(guān)聯(lián)研究

洪衛(wèi) 林寶釵 張貝貝 余新民 王凱 毛偉敏 張沂平

BCL-2基因多態(tài)性與復(fù)治晚期非小細胞肺癌TKI治療療效的關(guān)聯(lián)研究

洪衛(wèi) 林寶釵 張貝貝 余新民 王凱 毛偉敏 張沂平

目的 通過檢測BCL-2基因多態(tài)性，探討其與復(fù)治晚期非小細胞肺癌表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKI）治療療效的關(guān)系。方法116例復(fù)治晚期非小細胞肺癌患者，既往均接受過化療，失敗后接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治療。采用多聚酶鏈反應(yīng)方法檢測患者外周血白細胞中BCL-2基因多態(tài)性。結(jié)果116例患者總有效率為25．9%，BCL-2各基因型間患者間的有效率無明顯差異。相比BCL-2其它基因型，AA型疾病控制率更低（40%vs 75．2%，P=0．005）。單因素分析中位PFS，AA型中位無進展時間短于其它基因型（2．6個月vs 6．0個月，P=0．025），而女性長于男性（10．2個月vs 4．6個月，P=0．04）；不吸煙者長于有吸煙史者（11．9個月vs2．5個月，P=0．000）；病理類型為腺癌長于其他類型（11．9個月vs 4．1個月，P=0．000），均達到統(tǒng)計學(xué)差異。多因素分析結(jié)果顯示，包括性別、吸煙史、ECOG評分和病理類型，BCL-2基因多態(tài)性為PFS的獨立預(yù)后因素（P=0．049）。結(jié)論復(fù)治晚期EGFR突變狀態(tài)未明的非小細胞肺癌BCL-2（-938C＞A）基因型為AA者是提示近期療效較差的指標(biāo)。

BCL-2基因 多態(tài)性 非小細胞肺癌 酪氨酸激酶抑制劑

腫瘤組織表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因突變是小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）治療最重要的療效預(yù)測因子[1]，但晚期非小細胞肺癌患者也常因腫瘤組織量太少導(dǎo)致EGFR突變狀態(tài)未明，ISEL研究的數(shù)據(jù)中能夠獲得基因突變檢測標(biāo)本的患者僅約20%[2]。月R21[3]、TITAN[4]和INTEREST[5]等臨床研究顯示了厄洛替尼和吉非替尼在晚期NSCLC二三線治療中的療效。目前NCCN指南指出在二線及二線以上治療時，對EGFR突變狀態(tài)未明的患者可以選擇TKI，如何對這些患者進行治療前的療效預(yù)估是我們面臨的難題。研究發(fā)現(xiàn)，TKI的一個重要作用機制是誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[6-7]，而月CL-2基因家族與細胞凋亡的進程密切相關(guān)，本文探索晚期非小細胞肺癌EGFR突變未明患者TKI近期療效與凋亡相關(guān)基因月CL-2基因多態(tài)性的關(guān)系，報道如下。

1 對象和方法

1.1 一般資料 浙江省腫瘤醫(yī)院化療中心2009年1月至2012年12月收治的116例晚期非小細胞肺癌患者，均經(jīng)組織學(xué)或細胞學(xué)病理確診；采血前均對本研究知情同意并簽署知情同意書，本研究獲得浙江省腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法 抽取患者治療前外周靜脈全血2 ml，EDTA抗凝，采用全血基因組DNA提取試劑盒（康為世紀(jì)公司產(chǎn)品），按照說明書進行基因組DNA提取，提取后-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｓ米贤夥止夤舛扔嫓y定DNA濃度和純度。OD260/OD280比值的參考值為1.8～2.0。

1.2.1 PCR擴增 引物序列為：上游引物5′-TTATCCAGCAGCTTTTCGG-3′，下游引物5′-GGCGGCAGATGAATTACAA-3′。PCR反應(yīng)總體積為25μl，2×Gold-Star Taqman Mixture（with ROX）12.5μl，上、下游引物各1μl，樣本2μl，去離子水8.5μl。PCR的反應(yīng)條件為：95℃×10min預(yù)變性；95℃×30s變性，60℃×30s退火，72℃×60s延伸，35個循環(huán)。本實驗已設(shè)空白對照孔，每個樣本均設(shè)置復(fù)孔。

1.2.2 瓊脂糖凝膠電泳體系 將TAE緩沖液、1%瓊脂糖、溴化乙錠（0.5μg/ml）在電壓120V的瓊脂糖凝膠電泳體系電泳60min。

1.3 療效評價標(biāo)準(zhǔn) 采用實體瘤療效評價標(biāo)準(zhǔn)（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors，RECIST 1.1）[8]，分為完全緩解（CR）、部分緩解（PR）、穩(wěn)定（SD）和進展（PD）?？陀^緩解率（objective response rate，ORR）=（CR+ PR）/（CR+PR+SD+PD）×100%。疾病控制率（disease control rate，DCR）=（CR+PR+SD）/（CR+PR+SD+PD）×100%。

1.4 隨訪和生存分析 隨訪采用門診、電話或書信方式，末次隨訪時間為2012年11月30日。無進展生存期（progression-free survival，PFS）定義為患者自接受吉非替尼或厄洛替尼靶向治療開始至疾病進展、死亡或不良反應(yīng)不可耐受。對于在隨訪截止日期無進展的病例，在統(tǒng)計時作截尾數(shù)據(jù)處理。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，基因多態(tài)性與療效評價的關(guān)系采用Pearson χ2檢驗法，單因素分析PFS采用Kaplan-Meier生存曲線分析及l(fā)og rank檢驗，多因素分析采用Cox回歸。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床特征 116例患者，均既往經(jīng)過一至二線化療失敗后開始二、三線EGFR-TKI靶向治療，其中41例患者服用吉非替尼（易瑞沙）250mg，1次/d治療：75例患者服用厄洛替尼（特羅凱）150mg 1次/d治療。所有患者具體臨床特征詳見表1。

表1 患者的一般臨床特征

2.2 基因多態(tài)性檢測結(jié)果判定 月CL-2基因片段的PCR擴增出目的長度為252bp，完全被月CC1切開154bp和98bp為AA型；完全未被切開為252bp，即CC型，條帶為雙鏈DNA片段一條被酶切，一條未切開的產(chǎn)物酶譜，CA型，見圖1。

2.3月CL-2基因片段多態(tài)性與TKI治療ORR的關(guān)系 116例患者，總有效率25.9%，其中月CL-2基因基因CC型、CA型及AA型分別為52、49和15例，有效率分別為30.8%、28.6%和26.7%，月CL-2各基因型間患者間的有效率無明顯差異。相比月CL-2其它基因型，AA型DCR更低（40.0%vs 75.2%，P=0.005）。見表2。

圖1 BCL-2基因多態(tài)性判定圖（在凝膠成像系統(tǒng)掃描中最左側(cè)為maker電泳通道，（左邊數(shù)起）第1、2通道為BCL-2基因基因型是CC型，第3、4、6、7為CA型，第5通道為AA型。）

表2 BCL-2（-938C＞A）基因多態(tài)性與TKI治療療效的關(guān)系

2.4 單因素分析PFS 單因素分析中位PFS，月CL-2基因型為AA型中位無進展時間短于其它基因型（2.6個月vs 6.0個月，P=0.025），而女性長于男性（10.2個月vs 4.6個月，P=0.04）；不吸煙者長于有吸煙史者（11.9個月vs 2.5個月，P=0.000）；病理類型為腺癌長于其他類型（11.9個月vs 4.1個月，P=0.000），均有統(tǒng)計學(xué)差異，見表3。

2.5 多因素分析PFS 多因素分析結(jié)果顯示，包括性別、吸煙史和病理類型在內(nèi)，月CL-2基因多態(tài)性為PFS的獨立預(yù)后因素（P=0.05），見表4。

3 討論

TKI是晚期非小細胞肺癌21世紀(jì)最重要的治療進展，EGFR基因突變是最重要的療效預(yù)測因子[1]，中國的OPTIMAL[9]、日本的WJTOG3405[10]和NEJ002[11]及歐洲EURTAC[12]等多項三期隨機對照研究結(jié)果顯示EGFR突變的晚期非小細胞肺癌，其有效率可以高達58～82%，顯著高于傳統(tǒng)的第3代新藥與鉑的兩藥聯(lián)合化療，PFS也較化療組明顯延長。然而，臨床實踐過程中，比較多的晚期非小細胞患者因腫瘤組織采集困難、患者依從性等多種原因?qū)е聼o法取得足夠的腫瘤組織量進行EGFR突變狀態(tài)檢測，臨床上能夠獲得基因突變檢測標(biāo)本的患者僅約20%（來自ISEL研究的數(shù)據(jù)）[2]。對這些EGFR突變狀態(tài)未明的患者，療效預(yù)測目前主要依賴一些臨床因素，如亞裔、女性、不吸煙、腺癌等[13]。如何對這些患者進行治療前的療效預(yù)估是我們面臨的難題。

表3 單因素分析無進展生存時間（個月）

表4 多因素分析無進展生存時間（PFS）

多個基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，TKI誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡可能是其重要的作用機制之一，有研究發(fā)現(xiàn)不論吉非替尼還是厄洛替尼都可在腫瘤細胞內(nèi)通過月cl-2/月cl-xL復(fù)合體來調(diào)節(jié)下游的IP3R3蛋白導(dǎo)致腫瘤細胞產(chǎn)生凋亡抵抗[14]，敲除月CL-2基因可以增加腫瘤細胞對TKI的敏感性[7]，因而，月CL-2基因可能通過抗凋亡作用影響TKI的治療療效。

圖2 單因素分析PFS與BCL-2基因多態(tài)性的關(guān)系（BCL-2基因型為AA型患者，生存率顯著低于CC+CA，中位PFS為2.6個月vs 6.0個月，P=0.025。）

本研究共116例患者，其中月CL-2基因AA15例，ORR為26.7%，但DCR為40%；CC型52例，CA型49例，ORR分別為30.8%和28.6%，而DCR分別為76.9%和73.5%。在DCR上，AA型對比月CL-2的其它基因型更低，提示預(yù)后差，（DCR 40%vs75.2%，χ2=7.83，P= 0.005），女性、不吸煙、腺癌患者是TKI治療的優(yōu)勢人群。單因素分析中位PFS，女性長于男性（10.2個月vs 4.6個月，χ2=4.24，P=0.04）；不吸煙者長于有吸煙史者（11.9個月vs 2.5個月，χ2=15.28，P=0.000）；病理類型為腺癌長于其他類型（11.9個月 vs 4.1個月，χ2=13.06，P= 0.000），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。研究還發(fā)現(xiàn)月CL-2基因型為AA型者預(yù)后差，中位PFS短于其它基因型的患者（2.6個月vs 6.0個月，χ2=5.003，P=0.025）。多因素分析結(jié)果顯示月CL-2基因多態(tài)性為PFS的獨立預(yù)后因素（P=0.049）。因此，本研究結(jié)果進一步從臨床中證實了月CL-2基因多態(tài)性能夠作為預(yù)測EGFR基因突變未明NSCLC患者TKI治療的療效的指標(biāo)之一。在EGFR基因突變未明的中國患者，月CL-2基因型為AA占比為12.9%，因不同人群和不同種族可能會存在基因突變頻率的差異。我們推測月CL-2基因型為AA的患者，由于影響了TKI誘導(dǎo)細胞凋亡通路，導(dǎo)致近期療效欠佳，具體的機制值得進一步研究。本研究還發(fā)現(xiàn)不同月CL-2基因型患者間的近期有效率并無統(tǒng)計學(xué)意義。

本研究為回顧性研究，且樣本量有限，有待后續(xù)更深入研究及期待前瞻性多中心的大型臨床研究為肺癌的治療提供更高級別的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。

[1]Maemondo M,Inoue A,Kobayashi K,et al．Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J]．N Engl J Med,2010,362(25):2380-8．

[2]Hirsch F R,Varella-Garcia M,Bunn P A Jr,et al．Molecular predictors of outcome with gefitinib in a phase III placebo-controlled study in advanced non-small-cell lung cancer[J]．J Clin Oncol, 2006,24(31):5034-42．

[3]Shepherd F A,Rodrigues P J,Ciuleanu T,et al．Erlotinib in previously treated non-small-cell lung cancer[J]．N Engl J Med,2005, 353(2):123-32．

[4]Ciuleanu T,Stelmakh L,Cicenas S,et al．Efficacy and safety of erlotinib versus chemotherapy in second-line treatment of patients with advanced,non-small-cell lung cancer with poor prognosis (TITAN):a randomised multicentre,open-label,phase 3 study[J]．Lancet Oncol,2012,13(3):300-8．

[5]Kim E S,Hirsh V,Mok T,et al．Gefitinib versus docetaxel in previously treated non-small-cell lung cancer(INTEREST):a randomised phase III trial[J]．Lancet,2008,372(9652):1809-1810．

[6]Chang C Y,Shen C C,Su H L,et al．Gefitinib induces apoptosis in human glioma cells by targeting Bad phosphorylation[J]．J Neurooncol,2011,105(3):507-522．

[7]Zou M,Xia S,Zhuang L,et al．Knockdown of the Bcl-2 gene increases sensitivity to EGFR tyrosine kinase inhibitors in the H1975 lung cancer cell line harboring T790M mutation[J]．Int J Oncol, 2013,42(6):2094-2102．

[8]Eisenhauer E A,Therasse P,Bogaerts J,et al．New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline(version 1．1)[J]．Eur J Cancer,2009,45(2):228-247．

[9]Zhou C,Wu Y L,Chen G,et al．Erlotinib versus chemotherapy as first-line treatment for patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer(OPTIMAL,CTONG-0802):a multicentre,open-label,randomised,phase 3 study[J]．Lancet Oncol,2011,12(8):735-742．

[10]Mitsudomi T,Morita S,Yatabe Y,et al．Gefitinib versus cisplatin plus docetaxel in patients with non-small-cell lung cancer harbouring mutations of the epidermal growth factor receptor(WJTOG3405):an open label,randomised phase 3 trial[J]．Lancet Oncol,2010,11(2):121-128．

[11]Maemondo M,Inoue A,Kobayashi K,et al．Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR[J]．N Engl J Med,2010,362(25):2380-2388．

[12]Rosell R,Carcereny E,Gervais R,et al．Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC):a multicentre,open-label,randomised phase 3 trial [J]．Lancet Oncol,2012,13(3):239-246．

[13]Engelman J A,Janne P A．Factors predicting response to EGFR tyrosine kinase inhibitors[J]．Semin Respir Crit Care Med,2005, 26(3):314-322．

[14]Zannetti A,Iommelli F,Fonti R,et al．Gefitinib induction of in vivo detectable signals by Bcl-2/Bcl-xL modulation of inositol trisphosphate receptor type 3[J]．Clin Cancer Res,2008,14(16): 5209-5219．

Association between BCL-2(-938C＞A)polymorphism and therapeutic efficacy of tyrosine kinase inhibitor in pretreated patients with advanced non-small cell lung cancer

Objective To investigate the association between BCL-2 gene polymorphism and therapeutic efficacy of tyrosine kinase inhibitor(TKI)in pretreated patients with advanced non-small cell lung cancer(NCSLC)．MethodsA total of 116 patients with advanced NSCLC were recruited from Zhejiang Cancer Hospital,all of whom were treated with gefitinib or erlotinib after failure to chemotherapy．BCL-2 gene polymorphism of peripheral blood lymphocytes was detected with polymerase chain reaction(PCR)．Statistical analysis was performed by SPSS version 13．0．ResultsThe overall response rate was 28．9%．No significant association was found between BCL-2(-938C＞A)polymorphism and the objective response rate．The disease control rate of patients with BCL-2 AA genotype was lower than that of patients with genotype CC or CA(40%vs 75．2%,P=0．005)．Univariate analysis identified gender,smoking history,histology and BCL-2(-938C＞A)polymorphism as predictive markers of progress free survival(PFS)(P=0．04,P=0．000,P=0．000 and P=0．05)．Multivariate analysis demonstrated that BCL-2(-938C＞A)polymorphism was correlated independently with PFS(P=0．049)．ConclusionOur data suggest that BCL-2(-938C＞A)AA genotype may be a predictive marker for poor DCR and PFS in advanced NSCLC patients treated with tyrosine kinase inhibitor．

BCL-2 Gene Polymorphism Non-Small Cell Lung Cancer Tyrosine Kinase Inhibitor

2013-11-01）

（本文編輯：田云鵬）

浙江省自然基金（LY13H160024）；衛(wèi)生部醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展研究中心課題（W2012FZ134）；衛(wèi)生部科研基金（201232200）；吳階平基金資助項目（320.6799.1106）；浙江省科技廳公益技術(shù)研究社會發(fā)展項目（2012C23081）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金（2012B032）

310022 浙江省腫瘤醫(yī)院、浙江省胸部腫瘤診治技術(shù)研究重點實驗室（洪衛(wèi)、余新民、毛偉敏、張沂平）；溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤內(nèi)科（林寶釵）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院內(nèi)科學(xué)專業(yè)（張貝貝）；浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸內(nèi)科（王凱）

張沂平，E-mail：hwya192@163.com