應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選急性心肌梗死早期標志蛋白的研究

張麗 謝建洪 勞迪波 酈衛(wèi)星 陳瑩

應(yīng)用蛋白質(zhì)組學技術(shù)篩選急性心肌梗死早期標志蛋白的研究

張麗 謝建洪 勞迪波 酈衛(wèi)星 陳瑩

目的 檢測急性心肌梗死早期（發(fā)病到就診時間＜2h）患者血清中的蛋白表達譜，篩選并鑒定出特異的標志蛋白。方法 選取20例急性心肌梗死早期患者（早期急性心肌梗死組）和40例穩(wěn)定性心絞痛患者（穩(wěn)定性心絞痛組），采用激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)，檢測兩組患者血清中的蛋白峰強度，尋找差異表達蛋白并建立蛋白分類模式，確定診斷的特異度和敏感度。采用液相質(zhì)譜技術(shù)進一步鑒定已篩選出來的蛋白。 結(jié)果 早期急性心肌梗死組有5個蛋白顯著高表達，質(zhì)荷比分別為1 530．32、4 301．46、8 683．44、23 386．1、23 625．5Da，與穩(wěn)定性心絞痛組患者比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0．01）。建立決策樹，早期診斷急性心肌梗死的敏感度為93．33﹪，特異度為85．00%，陽性預(yù)測值為93．33%。經(jīng)過鑒定，phosphoglycerate mutase 1在急性心肌梗死早期患者中高表達。結(jié)論 通過蛋白質(zhì)組學技術(shù)可以早期發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死，phosphoglycerate mutase 1為早期特異表達蛋白。

急性心肌梗死 質(zhì)譜 生物學標記 蛋白鑒定

急性心肌梗死致死率較高。如果缺少輔助試劑，很難確診。目前常用的生物學標記一般在發(fā)病后2h才能在血液中檢出，所以使得很多早期心肌梗死患者無法得到及時治療。有效的治療基于迅速準確的診斷。激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)在檢測臨床疾病時，可直接鑒定生物標志物，優(yōu)于酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫熒光試驗等間接測定生物標志物的方法[1-2]。本研究擬通過檢測早期急性心肌梗死患者（發(fā)病到就診時間＜2h）血清中的蛋白指紋圖譜，從中篩選出特異的分子標志物，建立診斷急性心肌梗死的蛋白分類模型，從而為急性心肌梗死早期診斷提供依據(jù)。同時鑒定發(fā)現(xiàn)蛋白峰，進一步探究急性心肌梗死的發(fā)病機制，現(xiàn)報道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選擇浙江省人民醫(yī)院2011-08—2012-12住院的早期急性心肌梗死（發(fā)病到就診＜2h）患者20例（早期急性心肌梗死組），其中男12例，女8例，年齡42～85（69±10）歲。穩(wěn)定性心絞痛患者40例（穩(wěn)定性心絞痛組），其中男23例，女17例，年齡48～83（68±11）歲。診斷根據(jù)2011 ACC/AHA診斷標準，均經(jīng)心肌損傷標志物、心電圖、冠狀動脈造影確定。通過病史和常規(guī)檢查排除其他心腦血管疾病。兩組患者性別、年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器 SELDI-TOF-MS和蛋白質(zhì)芯片CM10均購于美國Biorad公司，尿素、二硫蘇糖醇（DTT）、3-[3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸鹽（CHAPS）、芥子酸、三氟乙酸、去離子水、乙腈等試劑均購自美國Sigma公司。質(zhì)譜為Thermo公司的LCQ Deca Xp plus系統(tǒng)。液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）液相色譜為Thermo公司的Surveyor系統(tǒng)。

1.2.2 樣品處理 早期急性心肌梗死組入院立刻抽取靜脈血2ml，穩(wěn)定性心絞痛組患者入院后第2天清晨抽取靜脈血2ml，3 000 r/min離心出血清，-70℃冰箱凍存待測。血清樣品解凍后以10 000 r/min，4℃離心5min，將10μl上清與20μl裂解液（9MUrea，2%CHAPS，50mMTris-HCl，pH9.0）充分混勻，在冰盒上振蕩孵育30min，加入370μl緩沖液（50mM醋酸鈉，pH4.0）稀釋，加至蛋白芯片處理器Bioprocessor（美國Biorad公司）中，振蕩60min。去掉血清樣本，加入200μl的結(jié)合緩沖液（50mM醋酸鈉，pH4.0），室溫置振蕩器600r/min震蕩5min，棄出液體，重復(fù)1次。拆開芯片處理器，取出芯片，干后，在每個加樣孔上加芥子酸（0.5%三氟乙酸，50%乙腈）1μl。

1.2.3 芯片閱讀設(shè)置 將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到蛋白分子量誤差＜0.1%。為避免基質(zhì)峰對結(jié)果造成干擾，將相對分子質(zhì)量為1 000 Da以下的蛋白質(zhì)峰濾去，其優(yōu)化范圍為2 000～10 000 Da，讀取范圍為50 000 Da。芯片閱讀的參數(shù)設(shè)置：激光強度為200，檢測靈敏度為8。通過Ciphergen Pmteinchip 3.1軟件輔助，利用數(shù)字化的操作平臺，程序性完成數(shù)據(jù)讀取過程。

1.2.4 蛋白純化 取100μlWCX磁珠（Bruker）加入1.5ml EP管中，加入醋酸鈉緩沖液50mM pH4.0進行活化5min 2次。加入1ml處理好的血清樣本震蕩孵育30min后棄除上清液，加入100ml 1%甲酸震蕩孵育10min后取上清。將上清液放入Millipore超濾離心管10KD中，10 000r/min，20min后取離心管中液體備用。

1.2.5 LC-MS/MS質(zhì)譜分析 色譜柱為熱電公司的BioBasic-18，150x0.18mm，流動相A為H2O+0.1%甲酸，流動相B為乙腈+0.1%甲酸，120min線性梯度洗脫；樣品進樣量為20μl，流速1μl/min；質(zhì)譜全掃描范圍：m/ z400-2000，MS/MS數(shù)據(jù)依賴掃描5次。

1.2.6 數(shù)據(jù)庫檢索 用上述質(zhì)譜數(shù)據(jù)對蛋白質(zhì)進行數(shù)據(jù)庫檢索，檢索軟件為pFind Ver 2.6，檢索參數(shù)為：非特異酶切，無修飾位點，前體離子寬度為2 Da，產(chǎn)物離子寬度為0.5 Da。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫為IPI human Ver.3.83，肽段的Score值＜1.0E-5才被認為是可靠的[3-4]。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用BioMarker Wizard 3.1軟件，由峰值強度反映組與組間具有相同質(zhì)荷比蛋白質(zhì)的含量差異，對采集圖譜進行均一化處理，去噪平滑，過濾信噪比（S/N）＜5的蛋白峰。初步篩選出的差異蛋白峰采用BioMarker Pattern 5.0（用的是決策樹方法對目標對象進行分類）對數(shù)據(jù)分組及建立蛋白質(zhì)峰分類決策樹診斷模型，評價該模型的感敏度及特異度。采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 急性心肌梗死早期差異標志蛋白的篩選結(jié)果 與穩(wěn)定性心絞痛組比較，早期急性心肌梗死組有5個異常蛋白峰，質(zhì)荷比分別為1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da，見圖1。兩組蛋白的峰值強度比較，見表1。

表1 兩組蛋白的峰值強度比較（%）

由表1可見，兩組5個蛋白的峰值強度比較，差異有顯著統(tǒng)計學意義（P＜0.01），早期急性心肌梗死組5個蛋白均為急性組高表達。

2.2 診斷決策樹模型的敏感度、特異度和陽性預(yù)測值 見圖2-3。

由圖2可見，根據(jù)這5個蛋白峰1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da建立診斷決策樹模型，對兩組患者進行分析，早期心肌梗死組的敏感度為93.33%，特異度為85.00%，陽性預(yù)測值為93.33%。

圖1 5個蛋白在早期心肌梗死組高表達。橫坐標為分子量（質(zhì)荷比），縱坐標為蛋白峰的強度（百分比）

由圖3可見，早期心肌梗死組和穩(wěn)定性心絞痛組的ROC曲線下面積為0.916，＞0.9說明診斷價值較高。2.3 LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用分析結(jié)果 見圖4。

由圖4可見，采用LC-MS/MS鑒定肽段，其總離子流圖提示具有相當高豐度的肽段，經(jīng)過LC-MS/MS分析，得到相應(yīng)的肽段序列。將所有鑒定出的肽段序列，經(jīng)過BIoworks軟件搜索IPIhuman蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，確定吻合率最高的蛋白質(zhì)為候選差異蛋白質(zhì)，即phosphoglycerate mutase 1。其中與phosphoglycerate mutase 1蛋白質(zhì)吻合的肽段數(shù)有20個，排除重復(fù)的肽段，獨特性的肽段數(shù)有8個。

3 討論

急性心肌梗死屬于臨床常見疾病之一，其發(fā)病原因為患者體內(nèi)冠狀動脈血管出現(xiàn)閉塞，且此閉塞現(xiàn)象為急性，導(dǎo)致患者冠狀動脈血流情況發(fā)生中斷，心肌發(fā)生缺血導(dǎo)致壞死。其臨床表現(xiàn)為心律失常、具有持久性的胸骨后疼痛、休克以及心力衰竭等，若患者未得到及時有效的治療措施，將發(fā)生嚴重后果，預(yù)后效果較差，甚至致其死亡。因此，臨床對于急性心肌梗死患者進行治療時，正確的診斷患者病情并采取有效的治療措施是搶救患者生命的關(guān)鍵因素。研究表明，近年來隨著人們生活習慣的不斷改變，急性心肌梗死疾病的臨床發(fā)生率呈現(xiàn)出顯著上升趨勢，嚴重影響患者生活質(zhì)量與生命安全。目前常用的心肌損傷標志物包括：肌紅蛋白：胸痛發(fā)作后2～4h開始升高，肌酸激酶同工酶（CK-MB）4h、肌鈣蛋白（cTNI/cTNT）4～8h、AST 6～7h、乳酸脫氫酶（LDH）8～10h開始升高。

圖2 兩組決策樹模型圖

圖3 兩組ROC曲線下面積（A：ROC穩(wěn)定性心絞痛組，B：ROC早期心肌梗死組）

圖4 總離子流圖

蛋白質(zhì)芯片結(jié)合SELDI-TOF-MS技術(shù)是近年來發(fā)展起來的一種蛋白質(zhì)組學研究技術(shù)，它將蛋白質(zhì)芯片（或磁珠）技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，通過引入基質(zhì)分子，使待測分子不產(chǎn)生碎片。與傳統(tǒng)技術(shù)相比，能高通量、高效率、高靈敏度的檢測微量粗制樣本中的差異蛋白，可在短時間內(nèi)利用0.5～400μl樣本得到fmol（10～15mol）數(shù)量級的質(zhì)荷比在500～500 000Da的蛋白質(zhì)肽質(zhì)量指紋圖譜，已成為檢測和鑒定多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多種合成聚合物的強有力工具[3-4]。已廣泛用于腫瘤及非腫瘤性疾病[5]。

本研究則通過蛋白質(zhì)芯片和飛行時間質(zhì)譜技術(shù)（SELDI-TOF-MS）在早期急性心肌梗死患者和穩(wěn)定性心絞痛患者之間找到5個蛋白質(zhì)峰1 530.32、4 301.46、8 683.44、23 386.1、23 625.5Da有統(tǒng)計學意義，并用BioMarker Patterns構(gòu)建急性心肌梗死早期患者血清學診斷模型，其敏感度為83.6%，特異度為90%，陽性預(yù)測值為90.2%。張更謙等[6]用SELDI-ToF-Ms觀察大鼠急性心肌缺血后心肌蛋白質(zhì)譜的變化規(guī)律，篩選心肌缺血的蛋白標記物。大鼠心肌組織中6 304、8 337、8 375Da蛋白峰都是急性心肌缺血后的較為特異性改變，可在心肌缺血后5min內(nèi)出現(xiàn)，有可能作為心肌缺血的蛋白標記，亦可能用于心肌缺血和法醫(yī)學心源性猝死的診斷。Menger[7-8]也發(fā)現(xiàn)通過SELDI可檢測到急性心肌梗死患者血清中磷酸化的肌鈣蛋白存在。這些均為心血管疾病的早期診斷提供依據(jù)。同時，本研究中對其中急性心肌梗死患者早期高表達的質(zhì)荷比23 386.1Da蛋白進行LC-MS/MS液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜分析，結(jié)果質(zhì)荷比23 386.1Da為phosphoglycerate mutase 1。PGAM是一種重要的糖酵解酶，具有分子內(nèi)轉(zhuǎn)移酶活性，與碳水化合物轉(zhuǎn)運、新陳代謝、催化活性及生長發(fā)育有關(guān)?？梢源呋?-磷酸甘油酸鹽轉(zhuǎn)化為2-磷酸甘油酸鹽。在腫瘤細胞中，PGAM可調(diào)節(jié)糖酵解與其他ATP產(chǎn)生通路以及糖異生之間的平衡。目前對該酶進行的研究較少，尚無對某種生物PGAM的深入研究[9-10]。但本研究中，phosphoglycerate mutase 1在急性心肌梗死患者早期的高表達可用于作早期診斷的生化學標記，其在急性心肌梗死過程中的產(chǎn)生、變化機制有對于進一步深入研究。

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Screening of early marker proteins for acute myocardial infarction by SELDI-TOF mass spectrometry

Objective To screen early serum protein markers for acute myocardial infarction by SELDI-TOF mass spectrometry．Methods Twenty patients with acute myocardial infarction admitted within 2h after onset of symptoms,and 40 patients with stable angina pectoris were enrolled in this study．Serum protein profile was analyzed by surface enhanced laser desorption ionization-time of flight-mass spectrometry(SELDI-TOF-MS)．The differentially expressed proteins were identified by high performance 1iquid chromatography-electrospray ionization mass spectrometry(LC-MS)． Results Compared to stable angina pectoris,5 proteins were significantly over-expressed in acute myocardial infarction(P＜0．01):1 530．32,4 301．46,8 683．44, 23 386．1,23 625．5Da．Based on differentially expressed proteins a diagnosis model for acute myocardial infarction was constructed．The sensitivity,specificity and positive predictive value of this model were 93．33%,85%and 93．33%,respectively．A-mong 5 differentially expressed proteins phosphoglycerate mutase 1 was identified,which was over-expressed in patients with early stage myocardial infarction．Conclusion Some serum proteins are over-expressed in patients with acute myocardial infarction including phosphoglycerate mutase 1．

Acute myocardial infarction SELDI-TOF-MS Biological Markers Protein Identification

2014-02-10）

（本文編輯：楊麗）

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學研究基金計劃（2007B007）

310014 杭州，浙江省人民醫(yī)院干部科（張麗、謝建洪、勞迪波），檢驗科（酈衛(wèi)星、陳瑩）

張麗，E-mail：blueapplezl@163.com