黃芪甲苷抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制研究

陳宜方 陳建國(guó) 王虹 鄭志貴 崔曉萌 何東元

●論 著

黃芪甲苷抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡的作用和機(jī)制研究

陳宜方 陳建國(guó) 王虹 鄭志貴 崔曉萌 何東元

目的 探討黃芪甲苷（AS-IV）抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡的作用及其機(jī)制，為糖尿病腎病的治療開(kāi)辟新途徑。方法將體重180～220g健康雄性SD大鼠按配伍法分為正常對(duì)照組、糖尿病組和糖尿病AS-IV治療組，每組10只，鏈脲霉素（STZ）腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型，糖尿病AS-IV治療組予AS-IV 10mg/（kg·d）治療，共8周；糖尿病組予等量1%CMC混懸液；正常對(duì)照組不予處理。第8周末測(cè)量大鼠體重、24h尿白蛋白、血糖、糖化血紅蛋白（HbA1c）、ALT、血尿素氮、肌酐水平；PAS、Masson染色，光鏡觀察腎臟病理變化；腎母細(xì)胞瘤基因1（WT-1）免疫組織化學(xué)染色觀察腎小球足細(xì)胞密度變化，TUNEL染色觀察足細(xì)胞凋亡，real-time PCR及Western blot測(cè)大鼠腎皮質(zhì)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax及其mRNA表達(dá)的變化。結(jié)果 與正常對(duì)照組相比，糖尿病組大鼠血糖、HbA1c和24h尿白蛋白增高，腎小球足細(xì)胞數(shù)量減少，系膜增生，足細(xì)胞凋亡增加，Bcl-2及其mRNA表達(dá)下調(diào)，Bax及其mRNA表達(dá)上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0．05）。AS-IV可顯著改善糖尿病大鼠蛋白尿，抑制腎小球足細(xì)胞數(shù)目減少、系膜區(qū)增生、足細(xì)胞凋亡，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，抑制Bax表達(dá)。結(jié)論 AS-IV對(duì)早期糖尿病大鼠足細(xì)胞具有保護(hù)作用，可能與其調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2和Bax，抑制足細(xì)胞凋亡相關(guān)。

黃芪甲苷 糖尿病腎病 足細(xì)胞 凋亡

糖尿病腎病是糖尿病微血管并發(fā)癥，是糖尿病患者死亡的重要原因之一。在歐美等發(fā)達(dá)國(guó)家和我國(guó)沿海發(fā)達(dá)城市，糖尿病腎病已經(jīng)成為慢性腎臟疾病的首要病因[1]。足細(xì)胞和腎小球基底膜、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞共同組成腎臟濾過(guò)屏障，足細(xì)胞功能障礙和（或）數(shù)量減少直接導(dǎo)致蛋白尿的產(chǎn)生[2]。既往研究顯示，足細(xì)胞凋亡在糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起重要作用，但目前尚無(wú)針對(duì)足細(xì)胞凋亡的特異性藥物[3]。黃芪是祖國(guó)中醫(yī)治療腎臟疾病的傳統(tǒng)中藥之一，黃芪甲苷（AS-IV）是黃芪主要活性成分之一。前期研究顯示，AS-IV可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[4]，現(xiàn)進(jìn)一步探索AS-IV能否抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡并探索相關(guān)機(jī)制，旨在為糖尿病腎病的治療提供新的思路，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 鏈脲霉素（STZ）、AS-IV單體（TLC純度達(dá)98%）、羧甲基纖維素（美國(guó)Sigma公司），Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript RT kit Total（美國(guó)Invitrogen公司），兔源性抗腎母細(xì)胞瘤基因1（WT-1）（一抗）、抗Bcl-2、抗Bax、抗β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔（二抗）、ECL化學(xué)發(fā)光劑（美國(guó)Santa Cruz公司），TUNEL染色試劑盒（美國(guó)Roche公司），Triton X-100裂解緩沖液、BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（中國(guó)上海聯(lián)碩生物科技有限公司）；便攜式血糖儀（美國(guó)Roche公司），自動(dòng)生化分析儀（美國(guó)Technicon公司），免疫發(fā)光分析儀（美國(guó)雅培公司），Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司），Rotor-Gene3000 PCR儀（澳大利亞Corbett Research公司）。

1.2 糖尿病模型的建立及處理 體重180～220g健康雄性SD大鼠30只（浙江大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心）按照配伍法分為正常對(duì)照組、糖尿病組和糖尿病AS-IV治療組，每組10只。STZ溶于0.1mol/L檸檬酸沖液（pH 4.2）中，65mg/kg一次性腹腔注射法建立糖尿病模型。STZ注射后72h斷尾采血，空腹血糖＞16.7mmol/L認(rèn)為糖尿病造模成功。AS-IV溶于1%羧甲基纖維素（CMC）中。糖尿病AS-IV治療組大鼠在造模成功后予AS-IV 10mg/（kg· d）灌胃，共8周。糖尿病組給予等量1%CMC混懸液。正常對(duì)照組不予處理。第8周末收集各組大鼠24h尿液，免疫比濁法測(cè)尿白蛋白。測(cè)量大鼠體重，戊巴比妥納麻醉后心臟取血，用于生化指標(biāo)檢測(cè)。留取雙側(cè)腎臟，用于光鏡病理、免疫組化、Western blot及real-time PCR檢測(cè)，多余組織液氮速凍后-80℃保存。

1.3 生化項(xiàng)目檢查 便攜式血糖儀檢測(cè)血糖，化學(xué)發(fā)光法測(cè)血糖化血紅蛋白（HbA1c），自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)ALT、肌酐、尿素氮。

1.4 病理檢查 腎組織以4%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，分別行PAS和Masson染色，光鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化。每張腎臟切片隨機(jī)觀察20個(gè)視野。PAS染色觀察腎小球系膜增生，用圖像分析軟件Image-Pro Plus 6.0[5]對(duì)腎小球系膜區(qū)進(jìn)行吸光度掃描，計(jì)算每個(gè)腎小球系膜區(qū)與腎小球總面積，以系膜區(qū)總面積/腎小球總面積半定量表示系膜增生情況。Masson染色觀察間質(zhì)纖維化，半定量評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0，無(wú)纖維化；1，纖維化面積＜10%；2，纖維化面積10%～25%；3，纖維化面積25%～50%；4，纖維化面積＞50%[6]。

1.5 腎小球足細(xì)胞密度檢測(cè) 免疫組化檢測(cè)足細(xì)胞特異抗原WT-1。加入一抗，二氨基聯(lián)苯胺顯色，WT-1陽(yáng)性的足細(xì)胞染成棕色。平均每只大鼠觀察20個(gè)腎小球，圖像分析軟件為Image pro plus 6.0，WT-1陽(yáng)性面積/腎小球面積代表足細(xì)胞密度，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.6 足細(xì)胞凋亡檢測(cè) 根據(jù)說(shuō)明書采用TUNEL染色試劑盒染色大鼠腎組織石蠟切片，凋亡細(xì)胞染成棕色。位于腎小球基底膜外側(cè)的陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡足細(xì)胞。平均每只大鼠觀察5個(gè)400倍視野，統(tǒng)計(jì)凋亡足細(xì)胞，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.7 Western blotTriton X-100裂解緩沖液溶解腎組織并在冰浴中充分勻漿。BCA蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)腎組織蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳分離樣品，100V電轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。含 2%牛血清白蛋白的TBST（20mmol/L Tris-HCl，150mmol/L NaCl，0.1%Tween 20）室溫孵育60min封閉非特異性位點(diǎn),抗Bax、Bcl-2、βactin抗體4℃孵育24h，加入二抗室溫孵育60min，ECL液顯色檢測(cè)蛋白信號(hào)，Bio-Rad2000凝膠成像系統(tǒng)掃描蛋白條帶的光密度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8 real-time PCR檢測(cè) Trizol法提取腎組織總RNA。根據(jù)說(shuō)明書采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScript RT kit Total合成cDNA。Bcl-2引物上游序列為5＇GGGATGCCTTTGTGGAACTATATG3＇，下游序列為5＇CAGCCAGGAGAAATCAAACAGA3＇。Bax引物上游序列為5＇AGACACCTGAGCTGACCTTGGA3＇，下游序列為5＇CGCTCAGCTTCTTGGTGGAT3＇;GAPDH為內(nèi)參，上游序列為5＇TCCCTCAACATTGTCAGCAA3＇，下游序列為 5＇AGCTCCACAACGGATACATT3＇。采用Rotor-Gene3000 PCR儀進(jìn)行real-time PCR檢測(cè)。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，59℃退火15s，72℃延伸20s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)最后72℃延伸5min。熒光定量分析軟件讀取并計(jì)算目標(biāo)mRNA/GAPDH mRNA的比值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算均值和標(biāo)準(zhǔn)差。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠8周末24h尿白蛋白水平的比較 正常對(duì)照組8周末24h尿白蛋白水平為（308.60±41.23）mg，糖尿病組為（3 203.78±492.14）mg，糖尿病AS-IV治療組為（2 080.52±412.31）mg。與正常對(duì)照組相比，糖尿病組、糖尿病AS-IV治療組大鼠尿白蛋白水平均顯著增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；糖尿病AS-IV治療組大鼠尿白蛋白水平低于糖尿病組，可見(jiàn)AS-IV能顯著降低糖尿病大鼠尿白蛋白水平。

2.2 各組大鼠腎組織光鏡及半定量分析結(jié)果的比較光鏡病理示糖尿病大鼠腎小球系膜增生，部分腎小管間質(zhì)纖維化，AS-IV治療后可顯著緩解糖尿病大鼠腎臟系膜增生和間質(zhì)纖維化；與正常對(duì)照組比較，糖尿病組、糖尿病AS-IV治療組的系膜增生比例、間質(zhì)纖維化指數(shù)均明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；AS-IV治療后系膜增生比例、間質(zhì)纖維化指數(shù)明顯低于糖尿病組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖1（見(jiàn)插頁(yè)）、表1。

表1 各組大鼠腎組織系膜增生比例和間質(zhì)纖維化指數(shù)比較

2.3 各組大鼠腎組織WT-1免疫組化染色及足細(xì)胞密度半定量分結(jié)果析的比較 WT-1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示，AS-IV可抑制糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞減少；半定量分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組足細(xì)胞密度為4.13×10-4±7.62×10-5，糖尿病組為8.67×10-5±1.64×10-5，糖尿病AS-IV治療組為2.48×10-4±7.29×10-5，糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞密度較正常對(duì)照組顯著降低，而糖尿病AS-IV治療組足細(xì)胞密度高于糖尿病組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖2（見(jiàn)插頁(yè)）。

2.4 各組大鼠腎臟TUNEL染色和凋亡足細(xì)胞半定量分析 TUNEL染色結(jié)果顯示，AS-IV可抑制糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡；半定量分析結(jié)果顯示，正常對(duì)照組凋亡足細(xì)胞（0.867±0.571）個(gè)，糖尿病組為（7.933±1.388）個(gè)，糖尿病AS-IV治療組為（6.033±1.326）個(gè)。糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡較正常對(duì)照組顯著增加，而AS-IV治療后凋亡足細(xì)胞數(shù)明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，詳見(jiàn)圖3（見(jiàn)插頁(yè)）。

圖1 各組大鼠腎組織光鏡結(jié)果（腎組織PAS和Masson染色，×200）

圖2 各組大鼠腎組織WT-1免疫組化染色結(jié)果（棕色為WT-1陽(yáng)性足細(xì)胞；×200）

圖3 各組大鼠腎臟TUNEL染色結(jié)果（位于腎小球基底膜外側(cè)的棕色細(xì)胞為凋亡的足細(xì)胞；×400）

2.5 各組大鼠腎組織Bax、Bcl-2及其mRNA表達(dá)的比較 和正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠Bcl-2 mRNA表達(dá)降低，Bax mRNA表達(dá)增加；AS-IV可部分恢復(fù)Bcl-2 mRNA的表達(dá)，抑制Bax mRNA表達(dá)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Western blot檢測(cè)顯示，各組大鼠腎臟Bcl-2、Bax變化趨勢(shì)和mRNA表達(dá)一致。和正常對(duì)照組相比，糖尿病大鼠Bcl-2表達(dá)降低，而Bax表達(dá)增加，AS-IV治療可抑制Bax的升高和Bcl-2的降低，詳見(jiàn)圖4、表2。

表2 各組大鼠腎組織Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

2.6 各組大鼠8周末體重和生化指標(biāo)的比較 與正常對(duì)照組大鼠相比，糖尿病組大鼠體重明顯降低，血糖、HbA1c明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，ALT、尿素氮、肌酐雖有升高，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。AS-IV治療對(duì)血糖、HbA1c、尿素氮、肌酐無(wú)顯著影響，詳見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠8周末體重和生化指標(biāo)的比較

3 討論

目前糖尿病腎病已經(jīng)成為終末期腎衰竭的首要病因，其早期表現(xiàn)為微量白蛋白尿，晚期有腎小球?yàn)V過(guò)率(GFR)的下降以及心血管并發(fā)癥[7]。糖尿病腎病的主要病理改變有：腎小球基底膜增厚、系膜區(qū)擴(kuò)張、系膜細(xì)胞增生、基質(zhì)增多等。本研究通過(guò)STZ腹腔注射法建立糖尿病大鼠模型。糖尿病大鼠血糖、HbA1c和24h尿白蛋白水平顯著高于正常對(duì)照組，8周末血尿素氮、肌酐也顯著升高，光鏡病理顯示腎臟系膜增生和間質(zhì)纖維化，說(shuō)明AS-IV治療可改善糖尿病大鼠蛋白尿以及腎組織病理學(xué)。

足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過(guò)屏障的最外層，是高度分化的特異細(xì)胞，幾乎沒(méi)有增殖能力。足細(xì)胞數(shù)目減少直接導(dǎo)致蛋白尿的發(fā)生[8-9]。Siu等[10]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠足細(xì)胞數(shù)量和密度從2周起就出現(xiàn)減少，且隨著病程的延長(zhǎng)而加劇。Steffes等[11]研究發(fā)現(xiàn)1型糖尿病患者足細(xì)胞數(shù)量減少與年齡、病程長(zhǎng)短無(wú)明顯相關(guān)。因此，抑制足細(xì)胞減少應(yīng)成為糖尿病腎病的治療靶點(diǎn)。

圖4 各組大鼠腎組織Bax、Bcl-2及其mRNA表達(dá)和半定量分析（A：Bax、Bcl-2光密度圖；B：Bax表達(dá)半定量分析；C：Bcl-2表達(dá)半定量分析；與正常對(duì)照組比較，*P＜0.05；與糖尿病組比較，#P＜0.05）

WT-1為足細(xì)胞特異性蛋白，與腎臟發(fā)育密切相關(guān)，出生后僅在于成熟足細(xì)胞表達(dá)，對(duì)足細(xì)胞功能的維持起重要作用[12]。本研究中采用WT-1免疫組化染色標(biāo)記足細(xì)胞，并通過(guò)圖像分析軟件對(duì)足細(xì)胞密度進(jìn)行半定量分析，結(jié)果表明糖尿病大鼠足細(xì)胞密度較正常對(duì)照組顯著降低，而AS-IV治療可緩解足細(xì)胞密度下降。

凋亡是糖尿病腎病足細(xì)胞減少的重要原因[13]，這一過(guò)程伴隨著抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的表達(dá)變化[14]。高糖的滲透作用不是糖尿病足細(xì)胞凋亡的原因，相同滲透濃度的D-甘露醇并不能誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[4]。為探索AS-IV的緩解足細(xì)胞丟失的相關(guān)機(jī)制，筆者觀察了足細(xì)胞凋亡和Bax、Bcl-2 mRNA的表達(dá)變化。Bax介導(dǎo)TGF-β1誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡[7]。在人類IgA腎病中，足細(xì)胞Bcl-2表達(dá)下降與腎小球進(jìn)行性損傷及預(yù)后不良相關(guān)[15]。本研究結(jié)果顯示糖尿病大鼠足細(xì)胞凋亡增加，腎皮質(zhì)Bax及其mRNA表達(dá)增加，Bcl-2及其mRNA表達(dá)降低。AS-IV可抑制糖尿病大鼠腎臟足細(xì)胞凋亡，抑制Bax、Bcl-2及其mRNA的表達(dá)變化，提示可能ASIV通過(guò)調(diào)節(jié)Bax和Bcl-2，抑制足細(xì)胞凋亡，抑制足細(xì)胞數(shù)量的減少。

最后，筆者研究了各組大鼠體重和生化指標(biāo)的變化。糖尿病AS-IV治療組和糖尿病組大鼠的血糖、HbA1c、ALT、血肌酐和尿素氮差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示AS-IV抗足細(xì)胞凋亡和降低蛋白尿的作用和血糖調(diào)控?zé)o關(guān)，且無(wú)明顯肝腎毒副反應(yīng)，表明AS-IV可能成為一種安全有效的藥物用于治療糖尿病腎病。

綜上所述，AS-IV可通過(guò)調(diào)節(jié)Bax、Bcl-2的表達(dá)，抑制足細(xì)胞凋亡，減少蛋白尿，緩解糖尿病腎病，該研究結(jié)果對(duì)開(kāi)發(fā)直接針對(duì)腎小球足細(xì)胞的腎臟保護(hù)藥物提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Inhibitory effects of astragaloside IV on apoptosis of podocytes and its mechanism in diabetic rats

Objective To investigate the effects of astragaloside IV(AS-IV)on apoptosis of podocytes and its mechanism in diabetic rats．Methods Male SD rats were randomly divided into normal control group,diabetes group and diabetes with AS-IV treatment group with 10 in each group．Diabetes was induced by STZ intraperitoneal injection in rats．Rats in treatment group were given AS-IV 10mg/kg/d for 8 weeks．At the end of the 8th week,24h microalbumin,body weight,blood glucose, blood glycated hemoglobin A1c,alanine aminotransferase,blood urea nitrogen and creatinine were measured;renal pathological changes were evaluated by light microscopy with PAS and Masson staining;glomerular podocyte density was examined by WT-1 immunohistochemical staining;podocyte apoptosis was detected by TUNEL;the mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2,apoptosis-related proteins in rat renal cortex were determined by Western blot and real time-PCR． Results Hyperglycemia,increased 24h microalbumin,mesangial expansion,interstitial fibrosis,podocyte loss and podocyte apoptosis,increased mRNA and protein expression of Bax and decreased mRNA and protein expression of Bcl-2 were detected in diabetic rats．AS-IV treatment inhibited podocyte apoptosis,ameliorated podocyte loss and renal histopathology,decreased microalbumin,partially restored mRNA and protein expression of Bax and Bcl-2．Conclusion AS-IV may inhibit podocyte apoptosis and ameliorate diabetic nephropathy by inhibiting the expression of Bax and restoring the expression of Bcl-2 in diabetic rats．

Astragaloside IV Diabetic nephropathy Podocyte Apoptosis

2014-07-03）

（本文編輯：嚴(yán)瑋雯）

浙江省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（LY12H05001）

310013 杭州，浙江醫(yī)院腎內(nèi)科

何東元，E-mail：hdy331@qq.com