藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒抗氧化能力的研究

薛桂新

（延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)系，吉林 延吉 133002）

發(fā)酵果酒作為一種健康酒類，開發(fā)的種類逐漸增多。隨著研究的進(jìn)行，人們逐漸認(rèn)識(shí)到單一品種的果酒在色、香、味及營(yíng)養(yǎng)成分和保健價(jià)值方面存在一定的不足和缺陷。復(fù)合發(fā)酵果酒綜合了各種果汁的優(yōu)勢(shì)和特點(diǎn)，營(yíng)養(yǎng)更加豐富，保健價(jià)值也更加合理，釀出的果酒色香味俱佳、風(fēng)格獨(dú)特[1]。近年來復(fù)合型果酒的研究成為熱點(diǎn)，如黑莓山楂復(fù)合發(fā)酵果酒、金櫻子火棘復(fù)合果酒、椰子水腰果梨復(fù)合果酒、草莓金櫻子復(fù)合果酒[2-5]，柑橘梨汁復(fù)合酒、芒果木瓜復(fù)合酒、山楂葡萄復(fù)合酒、雪蓮果西番蓮復(fù)合酒、櫻桃番茄復(fù)合酒、藍(lán)莓葡萄復(fù)合酒和桑葚五味子復(fù)合發(fā)酵酒等[6-12]，但大都是加工工藝及生產(chǎn)技術(shù)等方面的研究。而集營(yíng)養(yǎng)保健于一身的藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒及其抗氧化能力的研究卻很少，除了楊占江[13]專利外，其他少見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同藍(lán)莓添加量的藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒進(jìn)行了研制，然后以自制的藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒為研究對(duì)象，比較研究了復(fù)合果酒在陳釀期間抗氧化能力的高低及其變化趨勢(shì)，為藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒最佳飲用期的確定提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藍(lán)靛果由延邊林業(yè)科學(xué)研究院種植基地提供，藍(lán)莓采自吉林省安圖縣藍(lán)莓種植基地。六氰合鐵酸鉀、三氯乙酸、硫酸亞鐵、抗壞血酸、鄰苯三酚和苯酚、三氯化鐵、三羥基氨基甲烷、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical 2,2-diphenyl-1-（2,4,6-trinitrophenyl）hydrazyl，DPPH）：北京Solarbio公司；以上藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1102分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；BSA124S-CW電子天平：賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì)：上海鵬順科學(xué)儀器有限公司；FJ-2000型高速分散均質(zhì)機(jī)：上海標(biāo)本模型廠；DW-86L828超低溫冰箱：青島海爾集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的研制

藍(lán)靛果、藍(lán)莓采收后放在低溫冰箱中凍結(jié)貯存。實(shí)驗(yàn)時(shí)將凍結(jié)的果實(shí)解凍后分選、破碎、果漿調(diào)整成分、發(fā)酵、過濾、后發(fā)酵、陳釀后，得到藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒。

本實(shí)驗(yàn)以不添加藍(lán)莓為對(duì)照，采用3種不同處理，每個(gè)處理藍(lán)靛果和藍(lán)莓總量為5 kg，每個(gè)處理藍(lán)靛果和藍(lán)莓復(fù)合比例不同，其中處理1、處理2、處理3藍(lán)莓添加量分別為10%、30%、50%。

1.3.2 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒指標(biāo)測(cè)定方法

酒精度：GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中的酒精計(jì)法；可溶性固形物：手持糖度計(jì)法；總酸：酸堿滴定法；總糖：采用苯酚硫酸法[14]；多酚：福林試劑法[15]。

1.3.3 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒抗氧化能力的實(shí)驗(yàn)方法

藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒抗氧化作用選擇了對(duì)DPPH自由基、超氧陰離子、羥自由基和還原力的測(cè)定四個(gè)指標(biāo)進(jìn)行研究。

（1）藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除DPPH·的實(shí)驗(yàn)方法

稱取0.012 8 g DPPH，用無水乙醇溶解于50 mL容量瓶，定容，搖勻，作為儲(chǔ)備液保存于冰箱中，使用時(shí)用無水乙醇稀釋10倍。吸取10 mL DPPH儲(chǔ)備液，用無水乙醇定容于100 mL容量瓶中搖勻，30 min后在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，按下列公式計(jì)算DPPH自由基清除率：

式中：SA為DPPH自由基的清除率，%；Ac為空白試劑的吸光度值；As為樣品的吸光度值。

（2）藍(lán)莓復(fù)合果酒清除超氧陰離子（O2-·）的實(shí)驗(yàn)方法

采用鄰苯三酚自氧化法。取4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液，加4.2 mL蒸餾水混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min后，取出立即加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL（以l0 mmol/L HCl配制，空白用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚HCl溶液），迅速搖勻后倒入比色杯，每隔0.5 min在320 nm處測(cè)定溶液的吸光度，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。

取4.5 mL pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCI緩沖液，加入3.3 mL蒸餾水混勻后在25 ℃恒溫水浴中保溫20 min后，取出立即加入復(fù)合果酒0.9 mL，再加入在25 ℃預(yù)熱過的3 mmol/L鄰苯三酚溶液0.3 mL，迅速搖勻后倒入比色杯，每隔0.5 min在320 nm處測(cè)定溶液的吸光度值，計(jì)算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值。

式中：△A0為一定時(shí)間內(nèi)對(duì)照吸光度值的變化；△A為一定時(shí)間內(nèi)樣品吸光度值的變化。

（3）藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除羥自由基（·OH）的實(shí)驗(yàn)方法

本實(shí)驗(yàn)采用水楊酸比色法。利用H2O2與Fe2+反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中依次加入10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，復(fù)合果酒1 mL，最后加8.8 mmol/L H2O21 mL啟動(dòng)反應(yīng)，在37 ℃條件下反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為對(duì)照，測(cè)定吸光度值?？紤]復(fù)合果酒本身的顏色，以10 mmol/L FeSO41 mL，10 mmol/L水楊酸-乙醇1 mL，復(fù)合果酒1 mL，1 mL蒸餾水作為復(fù)合果酒的本底值。

式中：A0為對(duì)照的吸光度值；A1為樣品反應(yīng)體系的吸光度值；A2為復(fù)合果酒本底值的吸光度值。

1.3.4 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒還原力的實(shí)驗(yàn)方法

取復(fù)合果酒2.5 mL，加入25 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH=6.6）和2.5 mL 1%六氰合鐵酸鉀溶液[K3Fe（CN）6]，于50 ℃水浴保溫20 min后快速冷卻，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA），離心10 min，取上清液2.5 mL，依次加入2.5 mL蒸餾水，0.5 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，充分混勻，靜置10 min后，在700 nm處測(cè)定其吸光度值（以蒸餾水為對(duì)照），吸光度值的大小代表復(fù)合果酒還原力的高低。

2 結(jié)果與分析

2.1 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的理化指標(biāo)

表1 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of Lonicera edulis and blueberries compound wine

由表1可知，四種復(fù)合果酒中可溶性固形物、總糖和總酸含量差異很?。痪凭群投喾哟嬖谝欢ǖ牟町?，對(duì)照均高于處理。三個(gè)處理相比，酒精度處理1＞處理2和處理3，多酚含量處理1＞處理2＞處理3，即隨著復(fù)合酒中藍(lán)莓添加量的增多，多酚含量隨之減少，這是因?yàn)樗{(lán)莓多酚含量顯著低于藍(lán)靛果（P＜0.01）[16]，所以藍(lán)莓添加量越多，多酚含量就越少。

2.2 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除DPPH·能力的比較

由圖1可知，藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒中，藍(lán)莓的添加量不同清除DPPH自由基的能力也不同。處理1和處理2清除DPPH自由基的能力好于對(duì)照（P＜0.05），處理3與對(duì)照相當(dāng)，這表明藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒具有清除DPPH自由基的能力，并且隨著藍(lán)莓添加量增多，清除DPPH自由基的能力反而減小，這是因?yàn)樗{(lán)莓中多酚、黃酮和花色苷含量顯著低于藍(lán)靛果（P＜0.01）[16]，這些成分具有較強(qiáng)的清除自由基能力和抗氧化活性[17]，所以藍(lán)莓添加量增多，抗氧化活性成分減少，清除DPPH自由基的能力也隨著降低。本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓添加量為10%的處理清除DPPH自由基的能力最強(qiáng)。從曲線的趨勢(shì)看，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)清除DPPH自由基的能力逐漸降低，陳釀5個(gè)月后藍(lán)莓添加量為10%、30%、50%和對(duì)照清除DPPH自由基的能力分別降低了42.17%、48.66%、50.67%和51.53%。

圖1 不同藍(lán)莓添加量對(duì)復(fù)合酒DPPH自由基清除率的影響Fig.1 Effect of blueberry addition on scavenging activity of DPPH free radical of compound wine

2.3 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除超氧陰離子（O2-·）能力的比較

圖2 不同藍(lán)莓添加量對(duì)復(fù)合酒超氧陰離子清除率的影響Fig.2 Effect of blueberry addition on scavenging activity of superoxide anion of compound wine

由圖2可知，藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒中藍(lán)莓的添加量不同清除超氧陰離子的能力也不同，處理1＞處理2＞處理3，處理1和處理2清除超氧陰離子的能力明顯好于對(duì)照（P＜0.05），而處理3清除超氧陰離子的能力低于對(duì)照，這可能是因?yàn)樗{(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的抗氧化能力不僅與總多酚、總黃酮和總原花青素等含量水平相關(guān)，還與其各自組分的含量相關(guān)，并且它們之間存在著增效或拮抗作用[18]。處理3藍(lán)莓添加量為50%，在這個(gè)含量水平總多酚、總黃酮和總原花青素及其各自組分可能存在拮抗作用，所以其抗氧化能力低于對(duì)照，而處理1和處理2藍(lán)莓添加量分別為10%和30%，在這個(gè)含量水平總多酚、總黃酮和總原花青素及其各自組分可能存在增效作用，所以其抗氧化能力高于對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓添加量為10%的處理清除超氧陰離子的能力最強(qiáng)。從曲線的趨勢(shì)看，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)清除超氧陰離子的能力逐漸降低。陳釀5個(gè)月后藍(lán)莓添加量為10%、30%、50%和對(duì)照清除超氧陰離子的能力分別降低了49.05%、59.43%、59.19%和58.62%。

2.4 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除羥自由基（·OH）能力的比較

圖3 不同藍(lán)莓添加量對(duì)復(fù)合酒羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of blueberry addition on scavenging activity of hydroxyl radical of compound wine

由圖3可知，藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒中藍(lán)莓的添加量不同清除羥自由基的能力也不同。處理1＞處理2＞處理3，處理1、處理2清除羥自由基的能力明顯強(qiáng)于對(duì)照（P＜0.05），而處理3清除羥自由基的能力低于對(duì)照，這一結(jié)果與圖2清除超氧陰離子的結(jié)果一致，其原因也是因?yàn)樗{(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的抗氧化能力與總多酚、總黃酮和總原花青素等含量、各自組分的含量以及它們之間存在著增效或拮抗作用有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)中藍(lán)莓添加量為10%的清除羥自由基的能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他處理。從曲線的趨勢(shì)看，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除羥自由基的能力逐漸降低。陳釀5個(gè)月后藍(lán)莓添加量為10%、30%、50%和對(duì)照清除羥自由基的能力分別降低了47.63%、62.29%、83.50%和71.07%。

2.5 藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒還原力的比較

圖4 不同藍(lán)莓添加量對(duì)復(fù)合酒還原力的影響Fig.4 Effect of blueberry addition on reducing power of compound wine

由圖4可知，處理1的OD值明顯大于對(duì)照（P＜0.05），處理2的OD值與對(duì)照幾乎一致，處理3的OD值比對(duì)照低。以O(shè)D值的高低來衡量各個(gè)處理的還原力的大小，處理1還原力最好，處理2與對(duì)照基本一致，處理3低于對(duì)照。從曲線的趨勢(shì)看，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的還原力逐漸降低，可能是因?yàn)樗{(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒在陳釀期間存在著一定量的溶解氧，這些溶解氧與總多酚、總黃酮、總原花青素等活性成分發(fā)生反應(yīng)，降低了活性物質(zhì)的含量，也可能使活性成分的結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致抗氧化能力降低；而且藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒是一種復(fù)雜的混合體系，陳釀期間發(fā)生多種生理生化變化和酶促反應(yīng)，這些反應(yīng)可能影響活性成分的抗氧化機(jī)理，也會(huì)導(dǎo)致抗氧化能力降低。陳釀5個(gè)月后藍(lán)莓添加量為10%、30%、50%和對(duì)照的還原力分別降低了40.02%、41.29%、52.94%和38.70%。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)選擇的DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子及鐵離子還原力是目前常用于評(píng)價(jià)天然抗氧化成分體外抗氧化活性高低的四種方法[19]。藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒中藍(lán)莓添加量不同表現(xiàn)出的抗氧化能力也不同，藍(lán)莓添加量為10%和30%的復(fù)合果酒，其DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子的清除率均高于對(duì)照，而鐵離子還原力則不同，只有添加10%藍(lán)莓的復(fù)合酒明顯高于對(duì)照。由此可見，由于各種評(píng)價(jià)方法的機(jī)理有所差異，同一物質(zhì)在不同評(píng)價(jià)體系里可能表現(xiàn)出不同的抗氧化活性[20]。所以采用多種方法綜合評(píng)價(jià)藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒的抗氧化能力是很有必要的。

藍(lán)莓添加量為10%的復(fù)合果酒其抗氧化能力最高，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒清除DPPH自由基、羥自由基、超氧陰離子的能力和鐵離子還原力均很快下降，陳釀5個(gè)月后其抗氧化能力下降幅度可達(dá)40%以上。

不論是藍(lán)靛果藍(lán)莓復(fù)合果酒還是單一藍(lán)靛果果酒，隨著陳釀時(shí)間的延長(zhǎng)，四種抗氧化評(píng)價(jià)指標(biāo)均很快下降，尤其清除羥自由基的能力下降的幅度更大。從果酒風(fēng)味的角度看，酒是陳的香，但從抗氧化的角度評(píng)價(jià)，果酒釀造后應(yīng)盡快適量飲用更有利于身體健康。所以，從風(fēng)味和保健兩方面評(píng)價(jià)果酒比單從風(fēng)味或保健一個(gè)方面評(píng)價(jià)果酒更科學(xué)更全面。

[1]吳 翔，高 亮，羅澤章.復(fù)合發(fā)酵果酒的研制[J].釀酒科技，2003（6）：75-76.

[2]杜云建，朱孔岳，付 瑾.黑莓山楂復(fù)合發(fā)酵果酒的研究[J].中國(guó)釀造，2009，28（12）：149-151.

[3]杜 琨.金櫻子火棘復(fù)合果酒研制[J].中國(guó)釀造，2010，29（8）：164-166.

[4]袁 璐，劉四新，陳文學(xué).椰子水腰果梨復(fù)合果酒的研制[J].中國(guó)釀造，2011，30（11）：186-189.

[5]江明珠，顏 輝，聞 燕，等.草莓金櫻子復(fù)合果酒的發(fā)酵工藝研究[J].中國(guó)釀造，2011，30（12）：189-192.

[6]熊海燕，陳興勉，康 玲，等.柑橘梨汁復(fù)合酒的初步發(fā)酵工藝研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010（5）：414-416.

[7]盧璽羽.芒果和木瓜復(fù)合發(fā)酵果酒的研制[D].長(zhǎng)春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2012.

[8]潘中田，蒙艷紅.山楂葡萄果酒釀造技術(shù)研究[J].賀州學(xué)院學(xué)報(bào)，2013，29（3）：132-134.

[9]潘嫣麗，農(nóng)志榮.雪蓮果-西番蓮混合果酒發(fā)酵工藝的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（9）：5367-5369.

[10]肖春玲，李桂峰，尉豐嬋，等.櫻桃番茄果酒加工工藝技術(shù)的研究[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（2）：420-423.

[11]蘇俊峰，程建軍，劉宏杰.正交法優(yōu)化藍(lán)莓-葡萄復(fù)合果酒[J].北方園藝，2010（6）：188-191.

[12]龐少華.桑葚五味子復(fù)合發(fā)酵酒工藝研究[D].煙臺(tái)：煙臺(tái)大學(xué)碩士論文，2013.

[13]楊占江.一種開胃型藍(lán)莓藍(lán)靛果復(fù)合果酒及其制備方法，中國(guó)：201110314535[P].2012.

[14]王岸娜.福林法測(cè)定獼猴桃多酚含量的研究[J].食品科學(xué)，2008，29（7）：398-401.

[15]孫璐宏.柿果醋生產(chǎn)過程中抗氧化性能的變化研究[D].楊凌：西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)碩士論文，2011.

[16]樊梓鸞，王振宇，程翠林，等.5 種野生漿果的抗氧化和抗細(xì)胞增殖活性[J].食品科學(xué)，2010，31（17）：147-152.

[17]朱海芳.幾種藥食兩用中草藥抗氧化作用的功能評(píng)價(jià)[D].泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士論文，2009.

[18]張 昂.葡萄冬剪枝條抗氧化特性及活性酚類成分的研究[D].楊凌：西北農(nóng)業(yè)科技大學(xué)博士論文，2013.

[19]張桂芝，耿 莎，楊海燕，等.植物抗氧化成分的研究進(jìn)展[J].食品科學(xué)，2007，28（12）：551-55.

[20]成喜雨，崔 馨，劉春朝，等.中草藥抗氧化活性研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2006（18）：514-518.