以發(fā)芽大豆為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)富含納豆激酶食品工藝優(yōu)化

黃 勛，王常蘇，高澤鑫，高 冰*

（1.武漢生物工程學院 生物科學與技術系，湖北 武漢 430415；2.武漢輕工大學 生物與制藥工程學院，湖北 武漢 430023；3.湖北工業(yè)大學 輕工學部，湖北 武漢 430068）

血栓是由纖維蛋白原和血小板聚集形成的[1]，常引發(fā)腦梗塞、心肌梗塞和中風等疾病，是一種嚴重危害人類健康的心血管疾病[2]。納豆激酶屬于納豆枯草芽孢桿菌絲氨酸蛋白酶，體內(nèi)體外實驗都已證明具有高效的溶栓活性[3-4]，其不僅可以直接溶解交聯(lián)狀的血栓，而且可以催化血纖維蛋白原轉化成有活性的血纖維蛋白原溶酶，增加體內(nèi)血栓溶解因子的合成，增強體內(nèi)血栓的溶解活性[5]。目前，納豆激酶主要被用作功能食品使用，作為潛在藥品的應用正在研發(fā)中。與臨床常用的溶栓藥物相比，納豆激酶作為功能食品食用具有安全性好、生產(chǎn)成本低、無毒副作用、半衰期長、易口服等諸多優(yōu)點。因此，納豆激酶相關產(chǎn)品是纖溶酶產(chǎn)業(yè)化開發(fā)中最為熱門的產(chǎn)品。

以大豆為原料發(fā)酵制備的納豆激酶產(chǎn)品，因存在著不愉快的氣味和口感，限制其在國內(nèi)的推廣。大豆因營養(yǎng)價值豐富而被譽為“來自田野的肉制品”。以大豆為主要原料的豆制品近年來備受廣大消費者的青睞，其中豆芽是人們喜歡的食物之一[6]。大豆經(jīng)過適當?shù)陌l(fā)芽后，降低了大豆中的抗營養(yǎng)因子（如植酸、脹氣因子、脂肪氧化酶和胰蛋白酶抑制劑），提高了大豆的營養(yǎng)價值，并能形成獨特的風味和口感，近年來，用豆芽加工的產(chǎn)品的相繼問世[7]。大豆在發(fā)芽過程中脂肪、總糖含量降低，滿足了人們對于低脂肪、低糖、高蛋白大豆的需求[8-11]，尤其是大豆發(fā)芽過程中一些功能性因子的生物合成和積累引起了人們關注，如大豆經(jīng)適當?shù)陌l(fā)芽，提高了大豆中異黃酮的含量[12-13]以及γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，γ-GABA）的積累量。大豆異黃酮具有抗氧化，預防骨質疏松，預防心血管疾病以及抗癌等豐富的功能[14-20]。GABA是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動物和植物體內(nèi)，并具有多種人體的生理功能，是哺乳動物的神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性遞質。目前市售的GABA保健品藥物，多數(shù)是經(jīng)化學合成得到，對身體是有一定的副作用且價格昂貴。GABA具有多功能的生理保健作用，對于其應用到深度產(chǎn)品的研發(fā)中是十分有價值的[21-26]。

因此選用發(fā)芽大豆為原料制備富含納豆激酶的食品，不僅改善了產(chǎn)品的口感，而且豐富了產(chǎn)品的功能性，為納豆激酶相關食品的開發(fā)提供了理論依據(jù)和技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

納豆枯草芽孢桿菌（Bacillus natto）BN-05：由本實驗室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：10 g/L蛋白胨，5 g/L酵母提取物，10 g/L NaCl，15 g/L瓊脂，pH 7.0。液體種子培養(yǎng)基：10 g/L葡糖糖，5 g/L酵母提取物，10 g/L牛肉膏，5 g/L NaCl，pH 7.4～7.6。

1.1.3 主要試劑

纖維蛋白原標準試劑（88 mg可凝蛋白/支）、牛凝血酶（560 U/支）、尿激酶生物標準品（1 240 IU/瓶）：中國藥品生物制品檢定所；瓊脂糖：法國Biowest公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

SW-CJ-2D超凈工作臺：廣州瑞智科學儀器有限公司；WFJ2100紫外可見分光光度計：上海尤尼柯儀器有限公司；LHS-250SC 型智能型恒溫恒濕培養(yǎng)箱：上海浦東榮豐科學儀器有限公司；SLY-2112B立式雙層大容量恒溫培養(yǎng)搖床：金壇市盛藍儀器制造有限公司；5424R冷凍離心機：德國Eppendorf公司；SPS2001F感量2 000 g天平：奧豪斯公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 發(fā)芽大豆的制備

首先進行人工精選，再用蒸餾水沖洗，加入蒸餾水在室溫條件下浸種，放大鏡觀察大豆的種子生長狀況，并依據(jù)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》對發(fā)芽大豆中γ-氨基丁酸的含量進行檢測分析[27]。

1.3.2 固態(tài)發(fā)酵工藝

將精選的發(fā)芽大豆進行清洗除雜，加入5倍質量的清水，20～25 ℃浸泡6～8 h，瀝去水分，115 ℃滅菌30 min，待其冷卻至35 ℃以下，接種發(fā)酵培養(yǎng)，于37 ℃靜置恒溫培養(yǎng)，每隔12 h攪拌一次。發(fā)酵結束后，提取粗酶液，用瓊脂糖-纖維蛋白原平板法測定納豆激酶（nattokinase，NK）酶活。

1.3.3 固態(tài)發(fā)酵工藝試驗設計

（1）Plackett-Burman法篩選影響發(fā)酵的主要因素

通過單因素試驗確定了影響固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)納豆激酶的參數(shù)為發(fā)芽大豆的蒸煮時間、基質含水量、裝樣量、發(fā)酵溫度、葡萄糖添加量、發(fā)酵時間、接種量以及Mg2+的添加量。選用試驗次數(shù)N=12的Plackett-Burman設計安排，對這八個因素進行研究，分別記作A、B、D、E、G、H、K、L，每個參數(shù)分別取2個水平，另外設置3個虛擬項C、F、J，用于對試驗誤差進行估計，各因素水平取值見表1。

表1 Plackett-Burman試驗設計因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman test

（2）響應面試驗設計

在對Plackett-Burman試驗結果充分分析的基礎上，在最陡坡試驗確定的區(qū)域內(nèi)，采用中心組合設計（central composite design，CCD)響應面設計方法，以納豆激酶酶活為響應值對顯著因素進行優(yōu)化，各因素水平和編碼見表2。

表2 CCD試驗設計因素與水平Table 2 Factors and levels of CCD test

1.3.4 功能成分分析及產(chǎn)品營養(yǎng)分析

功能成分分析：納豆激酶活性的測定采用瓊脂糖-纖維蛋白原法進行測定[28]。γ-GABA含量的測定依據(jù)國標GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測定》。

產(chǎn)品營養(yǎng)成分分析：發(fā)酵發(fā)芽大豆的營養(yǎng)成分檢測委托武漢市產(chǎn)品質量監(jiān)督檢驗所和湖北省農(nóng)業(yè)科學院質量標準與檢驗技術研究所共同完成，檢測方法參考SB/T 10528—2009《納豆》、GB/T 5009.124—2003、GB 5009.5—2010《食品中蛋白質的測定》。

2 結果與分析

2.1 發(fā)芽大豆的制備工藝

（1）精選大豆，去除無胚粒、未成熟顆粒及雜質，用自來水沖洗三遍，洗去表面的灰塵；

（2）用0.05%NaClO溶液浸泡20～30 min，再用純凈水沖洗3～5 min去除表面的NaClO，瀝干水分；

（3）加入純凈水在20～25 ℃條件下浸泡6～8 h；

（4）浸泡完成后，瀝干水分，將大豆均勻地攤在底部有小孔的經(jīng)過消毒的培養(yǎng)籃中中，蓋上已消毒的紗布，在紗布上面噴灑適量的純凈水，移入23 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每隔2 h噴灑適量的純凈水以保持大豆的濕度，每隔8 h用純凈水沖洗大豆以免被霉菌污染，整個發(fā)芽過程，濕度控制在80%～95%，發(fā)芽時間為26～30 h，芽長1～2 mm。

（5）依據(jù)國家標準GB/T 5009.124—2003對發(fā)芽大豆進行檢測分析，γ-氨基丁酸的含量達到233.56 mg/100 g干基。

2.2 Plackett-Burman 試驗結果及分析

Plackett-Burman具體試驗設計及結果見表3。

表3 發(fā)酵條件優(yōu)化Plackett-Burman試驗結果Table 3 Results of Plackett-Burman experiment for fermentation conditions optimization

表4 發(fā)酵條件優(yōu)化Plackett-Burman 試驗因素方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiment for fermentation conditions optimization

由表4可知，發(fā)酵溫度（E）、接種量（K）、Mg2+（L）對固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶有顯著的影響，因此最終篩選的主效應參數(shù)為E、K、L，接種量的增加、Mg2+及發(fā)酵溫度的降低，納豆激酶的活力呈先升后降的趨勢，且在不同的處理時間都存在著顯著性差（P＜0.05），因此后續(xù)試驗選擇E、K、L這三個因素進行中心點的設計。

2.3 響應面中心組合設計結果及分析

2.3.1 中心組合設計結果及回歸模型分析

根據(jù)Plackett-Burman試驗確定的主效應參數(shù)，通過Design-expert 8.0軟件設計響應面中心組合試驗，CCD的試驗設計結果見表5，回歸方程方差分析見表6。

表5 發(fā)酵條件優(yōu)化CCD試驗結果Table 5 Design and results of CCD experiment for fermentation conditions optimization

最小乘法擬合二次多項式，試驗因子和響應面的關系可用以下方程表示：

由表6可知，模型本身（P＜0.000 1）非常顯著，且模型失擬項0.229 4＞1.902 296，差異不顯著，故模型選擇合適，有實際應用意義?；貧w模型的R2=94.04%，表明相關性顯著，失擬項不顯著，表明多項式對試驗擬合情況較好，試驗誤差小。決定系數(shù)R2adj=0.886 909，說明該模型能解釋94.05%響應值的變化決定系數(shù)反映了方程對數(shù)據(jù)擬合的程度，因此響應值的94.05%可以通過該二次回歸方程來解釋，說明擬合的模型較合適。

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of the regression model

根據(jù)上述的回歸方程及回歸模型方差分析表，繪制各因素交互作用響應面和等高線圖，結果見圖1。

圖1 發(fā)酵溫度、接種量、Mg2+含量對納豆激酶酶活交互影響的響應面和等高線Fig.1 Response surface plots and contour line showing the effect of interactions of fermentation temperature,inoculum,Mg 2+concentration on NK activity

由圖1可看出，當發(fā)酵溫度、接種量與Mg2+添加量三個變量中的某一個因素固定于中心水平時，其他兩個因素共同作用對試驗結果的影響呈拋物面型關系，變化趨勢都是先增大后減小，且響應面均存在一個極大值點。接種量與Mg2+添加量的交互效應對納豆激酶活力影響較顯著，其結果和表6描述的一致。

此回歸模型得出CCD試驗的最優(yōu)培養(yǎng)條件為培養(yǎng)溫度35.16 ℃，接種量7.17%，Mg2+的添加量0.20%，納豆激酶的活力6 987.67 IU/g。

2.3.2 驗證試驗

為方便實際操作，將回歸模型中得到的最佳工藝參數(shù)定為培養(yǎng)溫度為35 ℃，接種量為7%，Mg2+的添加量為0.20%，按此條件進行3次平行試驗，發(fā)酵完成后，測定納豆激酶的活力為6 918.76 IU/g，結果表明納豆激酶的活力與預測值相差不大，說明該方程與實際值擬合情況很好，結果見表7。

表7 響應面分析的驗證試驗Table 7 Verification test of the response surface analysis

在優(yōu)化單因素和響應面條件，選擇大豆及發(fā)芽大豆進行對照，由表8可知，發(fā)芽大豆為發(fā)酵底物優(yōu)于大豆。

表8 發(fā)酵底物對照試驗Table 8 Control test of fermentation substrate

3 結論

相比大豆而言，發(fā)芽大豆不僅降低了抗營養(yǎng)因子，富集了豐富的γ-氨基丁酸（γ-GABA），而且發(fā)芽大豆的營養(yǎng)成分滿足了人們對于低糖、低脂肪、高蛋白大豆的需要，所以選用發(fā)芽大豆作作為原料更符合現(xiàn)代食品發(fā)展的理念，以此作為發(fā)酵底物優(yōu)化產(chǎn)納豆激酶的發(fā)酵條件。

通過單因素預試驗確定影響產(chǎn)NK酶活的因素，采用Plackett-Burman法篩選出影響發(fā)酵的主要因素為發(fā)酵溫度、接種量和Mg2+的添加量，再通過中心組合設計方法，建立了產(chǎn)酶回歸模型，確定了該模型最佳取值時各參數(shù)水平：蒸煮時間15 min、基質含水量55%、裝樣量30 g/250 mL、發(fā)酵溫度35 ℃、接種量7%、發(fā)酵時間36 h、Mg2+添加量0.20%，其中接種量與Mg2+添加量的交互效應對產(chǎn)酶活力影響最顯著。再次通過驗證性試驗，證明了在響應面優(yōu)化條件下，納豆激酶的活力為6 918.76 IU/g，比以大豆為原料提高了58.35%。

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