沙門氏菌的食品污染及檢測(cè)鑒定研究進(jìn)展

◎ 劉 蘭，周培華，高 晗，雷云琛，鐘文濤，楊 滔

（湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院，食品安全監(jiān)測(cè)與預(yù)警湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410017）

近年來，微生物引起的食源性疾病已成為我國食品安全面臨的難題之首。沙門氏菌是一種革蘭氏陰性腸桿菌，為食源性致病菌，經(jīng)常引起人和畜禽患病，禽畜類感染居多，生鮮禽畜肉及其副產(chǎn)品經(jīng)常受到沙門氏菌的污染，沙門氏菌一直威脅著食品安全。據(jù)統(tǒng)計(jì)，世界各國每年有上百萬人感染沙門氏菌，且多次發(fā)生群體中毒事件，每年超40 萬人因食源性疾病死亡，僅沙門氏菌就導(dǎo)致23 萬人的死亡[1-4]。本文簡要論述了受沙門氏菌污染食品的現(xiàn)狀與種類，比較沙門氏菌的檢測(cè)鑒定方法，為沙門氏菌的快速檢測(cè)提供參考。

1 食品受沙門氏菌污染情況

1.1 禽類及禽副產(chǎn)品

禽類及禽副產(chǎn)品是人們?nèi)粘Ｑa(bǔ)充蛋白質(zhì)的重要食品，但其容易受到沙門氏菌的污染，雞肉和雞蛋是人致病沙門氏菌的主要傳播媒介。各國研究顯示，零售生雞肉中沙門氏菌的污染率一般大于10%，甚至高達(dá)80%[4]。國家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心2011 2013 年對(duì)市售生雞肉中沙門氏菌污染水平的調(diào)查結(jié)果顯示，國內(nèi)零售生雞肉中約40%存在沙門氏菌污染[4]。赫宏珊[5]調(diào)查了陜西、四川、河南等8 省份市售雞肉的沙門氏菌污染情況，發(fā)現(xiàn)各省市污染率均在42.4%～65.3%。宋晟等[6]研究發(fā)現(xiàn)，長沙市零售超市、菜市場采集的76 份生鮮整雞中沙門氏菌檢出率為78.9%。

1.2 畜肉及畜副產(chǎn)品

除了禽類及其副產(chǎn)品是沙門氏菌的主要傳播媒介外，畜肉類及其副產(chǎn)品也是重要的傳播媒介。韓依辛等[7]在廣東惠州和清遠(yuǎn)的10 個(gè)屠宰場采集了498份豬肉樣品，其中70 份檢出沙門氏菌，檢出率為14.06%。林本夫等[8]對(duì)廣州市屠宰環(huán)境中沙門氏菌的分型與耐藥性進(jìn)行分析，采集55 個(gè)樣本，沙門氏菌檢出率為18.18%，屠宰場存在沙門氏菌污染的情況。宋晟等[6]在長沙市零售超市、菜市場采集99 份生鮮豬肉樣本，沙門氏菌檢出率為83.8%。

1.3 其他各類食品

2020 年6 月25 日，成都市郫都區(qū)沙門氏菌食物中毒事件經(jīng)調(diào)查分析確認(rèn)感染源為外購的粽子，聚餐人員22 人，7 例病例，罹患率為31.28%，癥狀為腹瀉、腹痛、發(fā)熱[9]。張晶等[10]對(duì)廣州4 人小吃感染中毒事件中的倫敦沙門氏菌分離株進(jìn)行病原特征分析，發(fā)現(xiàn)75%的患者與2 名廚師攜帶的毒株一致，與冰箱中冷藏熟食分離到的10 株沙門氏菌血清型一致，這是因?yàn)樾〕缘晷l(wèi)生不合格，工作人員衛(wèi)生習(xí)慣差，生熟未分開存在交叉污染。目前，沙門氏菌病為人畜共患病，食源性污染源較多，環(huán)境衛(wèi)生也會(huì)引起沙門氏菌的污染，一旦發(fā)生群體性突發(fā)中毒事件就需要快速檢測(cè)方法鑒定致病源，以便及時(shí)止損、防止擴(kuò)散、對(duì)癥治療。

2 沙門氏菌屬、種鑒定方法比較分析

目前，常見的沙門氏菌的鑒定檢測(cè)方法分為屬的鑒定和種的鑒定。沙門氏菌屬種的鑒定方法主要有傳統(tǒng)生化方法、快速測(cè)定方法、熒光定量PCR 法和血清分型的方法。傳統(tǒng)生化方法有國標(biāo)檢測(cè)分離純化培養(yǎng)、傳統(tǒng)抗原分型診斷，快速測(cè)定方法有全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫檢測(cè)、病原微生物快速檢測(cè)，熒光定量PCR 法有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR、G-四鏈體/ThT PCR-RCA 雙重?cái)U(kuò)增技術(shù)、實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法和恒溫隔絕式PCR檢測(cè)法，血清分型的方法有玻片凝集法、全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法。

2.1 傳統(tǒng)方法生化培養(yǎng)鑒定

食品中沙門氏菌按照《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 沙門氏菌檢驗(yàn)》（GB 4789.4 2016）[11]檢驗(yàn)，對(duì)樣品增菌、純化，用常規(guī)的生化試劑盒或者全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)鑒定后進(jìn)行血清分型。初步檢測(cè)需要5 d，如果需要血清分型，還需2 d，從樣品到結(jié)果檢定共需7 d。國家標(biāo)準(zhǔn)中選擇性分離平板上的多種干擾菌的菌落形態(tài)與目標(biāo)菌相近，不易區(qū)分，如果實(shí)驗(yàn)操作人員經(jīng)驗(yàn)不足，很容易漏檢，報(bào)告假陰性結(jié)果，使檢測(cè)結(jié)果失實(shí)[12]。

2.2 快速檢測(cè)方法比較分析

何志勇[13]研究了沙門氏菌鑒定的快速檢測(cè)方法，對(duì)比了全自動(dòng)熒光酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和BAX system Q7病原微生物快速檢測(cè)法。2 種方法均具有簡便、快速、結(jié)果可靠、對(duì)實(shí)驗(yàn)人員和實(shí)驗(yàn)條件要求一般的特點(diǎn)。根據(jù)GB 4789.4 2016 中的相關(guān)內(nèi)容，使用全自動(dòng)生化分析儀鑒定沙門氏菌存在儀器和試劑卡昂貴的情況，大多數(shù)只能鑒定到屬，只有少數(shù)鑒定到種，但是相較于傳統(tǒng)的試劑生化鑒定，可以縮短檢驗(yàn)時(shí)間。

2.3 基因等分子檢測(cè)方法比較分析

陳秀琴等[14]建立了一種可快速、特異性地檢測(cè)生鮮肉中沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌O157:H7 的多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR 方法。30 份樣品中檢出3 份沙門氏菌、4 份金黃色葡萄球菌、7 份大腸桿菌O157:H7，其中，1 份樣品的大腸桿菌結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不符，1 份樣品的金黃色葡萄球菌結(jié)果與國家標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果不符。該方法的準(zhǔn)確性存在一定偏差。劉健慧等[12]將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)與滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)聯(lián)用，雙重?cái)U(kuò)增，通過特異性結(jié)合的G-四鏈體的硫黃素T（ThT）熒光信號(hào)的增強(qiáng)作用檢測(cè)沙門氏菌，該法檢測(cè)牛奶樣品的檢出限為4.28 CFU·mL-1，G-四鏈體/ThT 熒光信號(hào)強(qiáng)度容易受到緩沖體系中的一價(jià)陽離子濃度的影響，對(duì)復(fù)雜樣品和低濃度樣品的檢測(cè)存在局限性。戴冠蘋等[15]分別采用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法輔助國家標(biāo)準(zhǔn)方法和全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法全面鑒定分離出可疑菌落，樣品N1 和N3中檢出沙門氏菌，樣品N2 中未檢出沙門氏菌，兩法測(cè)定結(jié)果相同。實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法簡便、快速、特異性強(qiáng)，可與國家標(biāo)準(zhǔn)法搭配使用。采用實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法進(jìn)行輔助鑒定的耗時(shí)短，全程約18 h，且操作簡單，方便快捷。楊若璇等[16]根據(jù)沙門氏菌的特定基因設(shè)計(jì)特異性的引物和探針，通過水浴提取DNA，設(shè)計(jì)引物、探針，優(yōu)化模板用量，建立了恒溫隔絕式 PCR 法鑒定食品中沙門氏菌的方法。該方法較傳統(tǒng)PCR 縮短了檢測(cè)時(shí)間。

各類PCR 法鑒定沙門氏菌的屬，特異性強(qiáng)，檢出限較低，靈敏度高。PCR 檢測(cè)法需要結(jié)合擴(kuò)增培養(yǎng)確認(rèn)結(jié)果，PCR 僅鑒定存在的核酸，不能檢出菌種的活性，需要結(jié)合培養(yǎng)和生化特征進(jìn)行鑒定。

2.4 血清分型檢測(cè)方法比較分析

目前，血清分型有3 個(gè)方法，玻片凝集法血清分型為國家標(biāo)準(zhǔn)方法，血清凝集反應(yīng)時(shí)，會(huì)出現(xiàn)假陽性結(jié)果；全自動(dòng)微生物鑒定系統(tǒng)只針對(duì)小部分含有尿素酶活性的沙門氏菌進(jìn)行血型鑒定；飛行時(shí)間質(zhì)譜法目前還沒有形成系統(tǒng)的譜庫，有待更新和完善。按照GB 4789.4 2016，從取樣到結(jié)果鑒定需要7 d，檢測(cè)周期長。玻片凝集法測(cè)定雞白痢的假陽性率達(dá)40%[17]。玻片凝集法對(duì)血清的質(zhì)量和操作人員的經(jīng)驗(yàn)要求較高，解決玻片凝集法存在的問題是目前亟待解決的技術(shù)難題之一[18]。李詩瑤等[19]發(fā)現(xiàn)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法、熒光定量PCR 技術(shù)與國家標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定沙門氏菌的結(jié)果一致。目前，部分實(shí)驗(yàn)室采用MOLDI-TOF-MS 法對(duì)沙門菌進(jìn)行種屬鑒定與血清型比較，符合率為70.0%，但此法與血清學(xué)分型不能完全等同，這是因?yàn)楝F(xiàn)有譜庫的信息不足或有誤差，往往造成結(jié)果不準(zhǔn)確，需要對(duì)譜庫進(jìn)行持續(xù)的補(bǔ)充和完善[20-21]。

3 結(jié)語

現(xiàn)階段，沙門氏菌仍是食品安全監(jiān)管的重要檢測(cè)項(xiàng)目，大部分食品中的檢測(cè)方法及判定標(biāo)準(zhǔn)已完善，但生鮮食品有檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)方法，無明確的判斷依據(jù)，沒有作為日常的監(jiān)管項(xiàng)目，有提升的空間。目前，沙門氏菌的檢驗(yàn)及鑒定的方法中分子生物化學(xué)法居多，物理化學(xué)法較少，每一種檢測(cè)技術(shù)都有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)合理使用檢測(cè)方法，相互驗(yàn)證，使結(jié)果更加可靠。隨著各學(xué)科的快速發(fā)展，應(yīng)將傳統(tǒng)的微生物檢測(cè)技術(shù)與新興的化學(xué)物理手段相結(jié)合，取長補(bǔ)短，以準(zhǔn)確、快速、靈敏地檢測(cè)食品中的沙門氏菌。