利用CRISPR/Cas9基因編輯片段敲除技術(shù)創(chuàng)制玉米多樣化等位變異

摘要：利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)創(chuàng)制等位變異已經(jīng)成為眾多植物中增加種質(zhì)資源多樣性的重要手段。提高玉米等谷物中類胡蘿卜素含量是發(fā)展中國家解決維生素A缺乏癥的一種經(jīng)濟(jì)方法。本研究以玉米中調(diào)控類胡蘿卜素合成的基因crtRB1為研究對(duì)象，利用雙靶標(biāo)片段缺失性基因編輯技術(shù)，在原生質(zhì)體中對(duì)crtRBI的啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行片段敲除，獲得了具有片段缺失和InDel（插入或缺失）的多樣化等位變異，這為在玉米中實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定的crtRB1啟動(dòng)子元件的缺失突變奠定了基礎(chǔ)，對(duì)啟動(dòng)子元件的功能研究和玉米的品質(zhì)改良具有重要意義。

關(guān)鍵詞：玉米；crtRBI；基因編輯；片段敲除；啟動(dòng)子

中圖分類號(hào)：Q781：S503.531+3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2024）09-0001-05

糧食安全是世界首要問題，隨著人口不斷增長，現(xiàn)有的糧食產(chǎn)量和品質(zhì)越來越不能滿足人們的需求。玉米是三大作物之一，是我國乃至世界種植面積最大、產(chǎn)量最高的作物。玉米不僅是糧飼兼用作物，也是能源產(chǎn)品的重要原料植物。玉米傳統(tǒng)育種近幾十年取得長足的進(jìn)步，但主要基于現(xiàn)存的自然變異進(jìn)行人工選擇，再通過雜交聚合選育新品種，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。然而，現(xiàn)存的變異遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代育種的需求，這就需要用生物技術(shù)手段人工創(chuàng)制遺傳變異新種質(zhì)，以縮短育種周期，提高育種效率。

近年來，基因編輯技術(shù)的研究和發(fā)展突飛猛進(jìn)，新興的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)為育種家提供了能夠精確創(chuàng)造等位基因的大好機(jī)遇。CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)最早于2010年在原核免疫系統(tǒng)中被發(fā)現(xiàn)，也是繼第一代鋅指結(jié)構(gòu)核酸酶（ZFNs）和第二代轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)（TALENs）之后，被公認(rèn)的第三代基因組編輯技術(shù)。植物主要通過非同源末端連接（NHEJ）途徑來修復(fù)雙鏈DNA斷裂缺口（DSBs），以此進(jìn)行堿基的敲除和敲入，此過程可以導(dǎo)致基因移碼突變，使目的基因功能缺失，從而達(dá)到敲除基因的目的。

CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)在2013年第一次應(yīng)用于植物中，之后便成為植物科學(xué)界的明星技術(shù)被廣泛應(yīng)用，如擬南芥、玉米、水稻、大豆、番茄等。至此，CRISPR/Cas9在農(nóng)作物中的應(yīng)用已非常流行，近幾年用在農(nóng)作物上創(chuàng)造了很多有益變種，涉及產(chǎn)量、品質(zhì)、抗病和抗逆等。CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡(jiǎn)單，編輯效率高，可用來創(chuàng)造多倍體植物的突變體、基因組大片段的敲除以及產(chǎn)生多基因突變體等。當(dāng)同一條染色體相距一定距離的兩個(gè)靶位點(diǎn)同時(shí)被編輯時(shí)，靶標(biāo)之間的片段有一定的幾率被敲除。在模式植物擬南芥中，Zhao等通過此方法將含有多個(gè)基因的基因組大片段成功敲除：另外，水稻中就有長達(dá)245 kb的基因組片段用此方法被剪切掉。Rodriguez-Leal等利用CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)對(duì)SICLV3啟動(dòng)子順式元件進(jìn)行片段敲除，創(chuàng)造了多樣化的等位變異，并篩選得到了具有連續(xù)表型的多樣化順式元件突變體，并可以直接作為育種的種質(zhì)資源，為分子育種提供了新的思路和方法，使得通過改造玉米啟動(dòng)子獲得理想的變異新種質(zhì)成為可能。這些等位突變?nèi)绻脗鹘y(tǒng)的方法需要花費(fèi)大量的時(shí)間和精力去篩選，而這種基于CRISPR/Cas9基因組編輯技術(shù)的啟動(dòng)子變異方法成功繞開了傳統(tǒng)育種的限制，直接創(chuàng)造并且篩選獲得了科學(xué)家渴望得到的變異，為突破分子育種瓶頸提供了新的思路。

crtRBI是調(diào)控玉米籽粒中維生素A含量的關(guān)鍵基因，該基因中一個(gè)稀有變異降低了基因的轉(zhuǎn)錄水平，大幅提高了玉米籽粒中維生素A的含量。此舉惠及患有維生素A缺乏癥的數(shù)萬非洲兒童。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)對(duì)玉米crtRB1基因的啟動(dòng)子區(qū)域進(jìn)行編輯，旨在進(jìn)一步明確crtRBI的功能，同時(shí)為有效調(diào)節(jié)玉米籽粒中維生素A的含量提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

本研究所用植物CRISPR/Cas9基因編輯載體pCPB-ZmUbi-hspCas9由謝傳曉研究員提供。DL2000 DNA Marker、T4連接酶、DNALoading Buffer、DNA Marker、FastPfu、2x Taq Mix、大腸桿菌DH5a、EHA105農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞等購自北京全式金生物技術(shù)有限公司：限制性內(nèi)切酶BsaI購自紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；高保真酶購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司：氯仿，無水乙醇、異丙醇等試劑均購于國藥集團(tuán)。引物由青島擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，基因測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2雙靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

由于轉(zhuǎn)化所用受體自交系KN5585的基因組和B73的基因組有一定的差異，我們首先以B73基因組做參考，對(duì)選取的需要進(jìn)行片段敲除的序列兩端設(shè)計(jì)引物PRB/-T-F和pRBl-T-R（表1），然后以KN5585的DNA為模板擴(kuò)增測(cè)序確定要進(jìn)行片段敲除的啟動(dòng)子區(qū)域序列。通過CRISPR-P 2.0在線設(shè)計(jì)網(wǎng)站（http：//crispr.hzau.edu.cn/cgi-bin/CRISPR2/CRISPR）設(shè)計(jì)crtRBI啟動(dòng)子目標(biāo)區(qū)域的2個(gè)靶位點(diǎn)Tl和T2（圖1A）。

1.3片段敲除載體構(gòu)建

1.3.1靶標(biāo)引物退火形成雙鏈片段 靶標(biāo)T1對(duì)應(yīng)的兩個(gè)引物是pRBI-T1-F和PRB/-T1-R，靶標(biāo)T2對(duì)應(yīng)的兩個(gè)引物是pRB/-T2-F和pRB1-T2-R，將每個(gè)靶標(biāo)對(duì)應(yīng)的兩條引物分別成對(duì)混合，直接退火形成雙鏈：37℃20 min，95℃5min，以6℃/min的速度降至25℃，形成帶粘性末端Bsa I酶切位點(diǎn)的靶標(biāo)片段，備用。

1.3.2sgfRNA-U6片段的獲得 以pCPB-ZmUbi-hspCas9質(zhì)粒為模板，用引物sgU6Fl/sgRNA-R擴(kuò)增片段sgRNA，用U6-F/sgU6R1（表1）擴(kuò)增U6片段，然后將兩個(gè)PCR產(chǎn)物混合后為模板，利用兩個(gè)片段之間的重疊序列，以引物sgU6F1/sgU6R1（表1）（帶BsaI酶切位點(diǎn)）進(jìn)行重疊PCR。反應(yīng)體系：上、下游引物（10 umol/L）各2uL，2x Buffer 25 uL，dNTP Mix（10 mmol/L）1uL，兩個(gè)模板產(chǎn)物均為1 uL，PhantaMax高保真DNA聚合酶1uL，用ddH2O補(bǔ)至50 uL。反應(yīng)程序：95℃1min；95℃15 s、55℃15 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃5min。電泳，選擇合適大小的條帶切膠回收，回收產(chǎn)物用BsaI酶切純化，獲得帶BsaI粘性末端的sgRNA-U6片段，備用。

1.3.3載體線性化 載體pCPB-ZmUbi-hspCas9中具有毒性致死基因ccdb，使用限制性內(nèi)切酶BsaI將載體中的ccdb切除，形成兩端具有BsaI粘性末端的線性化載體，備用。

1.3.4連接形成最終載體 構(gòu)建敲除載體的每個(gè)靶位點(diǎn)分別由獨(dú)立的U6啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)（圖1B）。將上述獲得的T1和T2靶標(biāo)片段、sgRNA-U6片段、線性化載體pCPB-ZmUbi-hspCas9用T4連接酶進(jìn)行鏈接組裝，體系為：3個(gè)片段各0.5 uL，T4連接酶0.3 uL，加水至5uL。25℃連接1h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，之后于LB平板培養(yǎng)基（含Kan）上培養(yǎng)，挑取單克隆用引物BGK-T-F/BGK-T-R（表1）進(jìn)行菌落PCR鑒定及測(cè)序，比對(duì)篩選正確的克隆提取質(zhì)粒。

1.4玉米原生質(zhì)體的提取和轉(zhuǎn)化

參考文獻(xiàn)中玉米原生質(zhì)體的制備及轉(zhuǎn)化方法并稍作調(diào)整。將玉米種子在花盆中培養(yǎng)（25℃，16L：8D）8 d左右，取幼苗葉中間段切成寬0.5-1.0 mm的細(xì)條，轉(zhuǎn)移到酶解液[含0.6mol/L甘露醇、10 mmol/L MES（pH值5.7）、1.5％纖維素酶R10、0.75％離析酶、10 mmol/L CaCl2.0.1％ BSA]；用錫箔紙包住后放置28℃搖床，50r/rmn避光酶解5 h：加入等體積W5（含154mmol/L NaCI、125 mmol/L CaCL2、5 mmol/L KCl、2mmol/L MES），輕柔搖晃均勻后過40 um細(xì)胞篩：加入MMG溶液（含0.4 mol/L甘露醇、15mmol/L MgCl2、4 mmol/L MES）重懸原生質(zhì)體；將構(gòu)建好的質(zhì)粒利用PEG介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)入原生質(zhì)體，避光條件下28℃培養(yǎng)48 h：離心收集玉米原生質(zhì)體，用DNA快速提取試劑盒提取基因組DNA。

1.5基因編輯方式檢測(cè)

以提取的原生質(zhì)體DNA為模板，使用特異性引物pRB1-T-F/pRBl-T-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化后連接pEASY-Blunt載體，并將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，涂板LB固體培養(yǎng)基（Kana），37℃倒置培養(yǎng)過夜。等菌落長到合適大小后，選取大于50個(gè)獨(dú)立的菌落分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。通過測(cè)序結(jié)果比對(duì)判定兩個(gè)靶位點(diǎn)之間有無大片段缺失以及兩個(gè)靶位點(diǎn)各自區(qū)域的編輯情況（插入、替換或缺失）。

2結(jié)果與分析

2.1片段敲除載體的構(gòu)建及鑒定

以構(gòu)建好的片段敲除載體質(zhì)粒為模板，PCR擴(kuò)增后分別用上游和下游引物測(cè)序，通過比對(duì)測(cè)序結(jié)果中靶標(biāo)T1（BGK-T-F測(cè)序）和T2（BGK-T-R測(cè)序：序列反向互補(bǔ)）以及側(cè)翼序列，篩選獲得了預(yù)期的重組載體（圖1B，圖2），證明所需的片段敲除載體構(gòu)建成功。

2.2原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及編輯情況檢測(cè)

對(duì)原生質(zhì)體DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接pEASY-Blunt載體后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，長出菌點(diǎn)后，選取獨(dú)立的50個(gè)進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增并測(cè)序。通過對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)（圖3）發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)編輯區(qū)域發(fā)生了大片段缺失和替換，同時(shí)，兩個(gè)靶標(biāo)各自位點(diǎn)也發(fā)生InDel（替換、插入或缺失）。發(fā)生編輯的位點(diǎn)大部分是雙等位基因，只有6％（50個(gè)中有3個(gè)）包含一個(gè)野生型拷貝。雙靶標(biāo)之間發(fā)生大片段缺失的概率為8％（圖3a），發(fā)生大片段替換的概率為2％（50個(gè)中有1個(gè)）（圖3b）。兩個(gè)靶標(biāo)各自位點(diǎn)也有InDel，T1位點(diǎn)發(fā)生的編輯類型包括2 bp缺失（圖3e）和單堿基（T）插入（圖3d），概率分別為48％和16％；T2位點(diǎn)發(fā)生了3 bp的缺失（圖3e），概率為32％。對(duì)于單個(gè)突變體來講，兩個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)編輯方式都有InDel的概率為8％（圖3e），只有一個(gè)靶標(biāo)位點(diǎn)區(qū)域有InDel的概率為8％（圖3d）。表明本研究所用的CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)編輯效率較高，能夠滿足片段敲除和多樣化等位變異的需求。

3討論與結(jié)論

在育種過程中，經(jīng)常遇到需要微調(diào)某種性狀來尋找眾多育種性狀的最優(yōu)平衡點(diǎn)，從而達(dá)到品種選育與改良的目的?；蚓庉嫾夹g(shù)的突飛猛進(jìn)給育種帶來了重大機(jī)遇。利用CRSIPR/Cas9雙靶標(biāo)基因編輯技術(shù)，對(duì)啟動(dòng)子的順式作用元件進(jìn)行片段缺失性突變，來調(diào)節(jié)基因的功能，能夠在創(chuàng)制新的等位突變的同時(shí)，微調(diào)相應(yīng)性狀，從中選擇最優(yōu)的新種質(zhì)資源應(yīng)用到育種中，從而達(dá)到品種改良的目的。

本研究將構(gòu)建的CRSIPR/Cas9雙靶標(biāo)片段敲除載體轉(zhuǎn)入玉米原生質(zhì)體，通過編輯方式和效率檢測(cè)，證明該系統(tǒng)的有效性，能夠滿足片段敲除的需求，同時(shí)編輯方式的多樣性具備創(chuàng)制多樣化變異材料的條件。本研究結(jié)果可為評(píng)估啟動(dòng)子順式元件的功能及其在育種中的價(jià)值提供理論參考，也為發(fā)展一套全面詳細(xì)研究啟動(dòng)子順式元件的方法以及評(píng)估啟動(dòng)子不同調(diào)控元件在育種中的應(yīng)用潛力提供理論支撐。至此，通過人工改造順式元件來調(diào)控基因功能成為可能，作物遺傳改良已經(jīng)進(jìn)入一個(gè)新的時(shí)代，需要我們共同探索。