杉木炭疽病拮抗菌AM53的發(fā)酵條件優(yōu)化

楊菁 周國(guó)英 譚益民 路宗巖

（中南林業(yè)科技大學(xué) 教育部經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004）

杉木炭疽病拮抗菌AM53的發(fā)酵條件優(yōu)化

楊菁 周國(guó)英 譚益民 路宗巖

（中南林業(yè)科技大學(xué) 教育部經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙 410004）

旨在優(yōu)化地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）AM53的發(fā)酵條件。通過Plackett-Burman試驗(yàn)篩選到影響AM53活菌數(shù)的重要因素為培養(yǎng)溫度、初始pH、搖床轉(zhuǎn)速。經(jīng)最陡爬坡試驗(yàn)和Box-Behnken試驗(yàn)，獲得AM53的最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)溫度30.5℃，初始pH8，搖床轉(zhuǎn)速185 r/min，接種量為5%，培養(yǎng)24 h。結(jié)果顯示，在此條件下，OD600平均為1.861，其值與預(yù)測(cè)值基本相符，說明該模型可信度高，可應(yīng)用于AM53發(fā)酵條件優(yōu)化。

拮抗菌AM53 發(fā)酵條件 Plackett-Burman試驗(yàn) Box-Behnken試驗(yàn)

炭疽菌的分布極為廣泛，且寄主繁多，可侵害多種樹木，尤其是對(duì)一些豐產(chǎn)速生林能夠造成嚴(yán)重危害［1，2］。杉木炭疽病是杉木栽培區(qū)的主要發(fā)生病害之一，幾乎有杉木的地區(qū)都會(huì)有炭疽病發(fā)生。病輕時(shí)，會(huì)導(dǎo)致杉木幼苗的針葉或嫩梢變褐枯萎，嚴(yán)重時(shí)，常會(huì)造成杉木幼林成片的枯黃、枯死，對(duì)杉木林造成了毀滅性的損害［3-5］。因此，需要尋找一種高效、安全的防病方法來控制及預(yù)防該病在杉木上的擴(kuò)散。利用生防細(xì)菌或其代謝產(chǎn)物來防治植物病害，使寄主植物周圍的有益微生物和有害微生物達(dá)到平衡，從而起到防病增產(chǎn)的目的［6］。

發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)微生物發(fā)酵液中的菌體含量和代謝產(chǎn)物都有較大的影響［7-9］。響應(yīng)面分析法（Response surface methodology，RSM）可同時(shí)對(duì)影響響應(yīng)值的各因子水平及他們的交互作用進(jìn)行優(yōu)化和分析，并快速有效地確定多個(gè)因子系統(tǒng)的最佳培養(yǎng)條件［10，11］。該方法可以減少試驗(yàn)步驟，提高準(zhǔn)確性。本研究通過對(duì)從湖南攸縣杉木根際土壤中篩選得到的杉木炭疽病拮抗細(xì)菌地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）AM53進(jìn)行發(fā)酵條件的優(yōu)化，旨在獲得最佳的拮抗效果，為后續(xù)杉木炭疽病微生物制劑的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 指示菌株：杉木炭疽病的病原菌，由本實(shí)驗(yàn)室分離及鑒定，保藏于本實(shí)驗(yàn)室的菌種保藏中心，編號(hào)為CSUFTCC F0101。

拮抗菌株：地衣芽孢桿菌AM53，由本實(shí)驗(yàn)室分離、篩選及鑒定，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC No. M2012273。

1.1.2 培養(yǎng)基 液體發(fā)酵培養(yǎng)基（NB液體培養(yǎng)基）：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

平板培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基，用于病原菌的活化及抑菌活性的測(cè)定。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液的制備、發(fā)酵及菌體濃度的測(cè)定 菌懸液的制備：將斜面上生長(zhǎng)良好的AM53菌株接種到含40 mL培養(yǎng)液的三角瓶中（100 mL），于28℃、160 r/min，振蕩培養(yǎng)24 h后獲得。

基礎(chǔ)發(fā)酵條件：按照一定的比例接種種子懸液到含20 mL NB培養(yǎng)液的三角瓶中（100 mL），于一定溫度下振蕩培養(yǎng)24-48 h后制成種子液。

菌體濃度的測(cè)定：取AM53菌株發(fā)酵液，空白培養(yǎng)液作為對(duì)照，在722s可見分光光度計(jì)上測(cè)600 nm時(shí)菌液的 OD（optical density）值，以O(shè)D值的大小來表示菌體的濃度［12］。

1.2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì) 使用Design-expert 8.0 設(shè)計(jì)一個(gè)5因素2水平的Plackett-Burman（PB）試驗(yàn)，以菌體濃度OD600為響應(yīng)值，從搖床轉(zhuǎn)速、初始pH、溫度、接種量和培養(yǎng)時(shí)間眾多因素中，在最少的試驗(yàn)次數(shù)情況下，篩選出對(duì)菌體產(chǎn)量具有顯著作用的因素。一般情況下，高水平（+）取低水平（-）的1.0-1.5倍［13］。PB試驗(yàn)各因素及其水平如表1所示。

1.2.3 最陡爬坡試驗(yàn) 在確定影響菌體濃度的顯著性因素后，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)，從而進(jìn)一步確定各因素的變化方向和步長(zhǎng)，以逼近最大的菌體產(chǎn)量的極值點(diǎn)。

1.2.4 Box-Behnken試驗(yàn) 應(yīng)用Design-expert 8.0 設(shè)計(jì)的Box-Behnken design（BBD）試驗(yàn)法，包含了17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，主要分為兩類：析因點(diǎn)有12個(gè)，即為自變量取值在A、B、C所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)；零點(diǎn)即區(qū)域中心點(diǎn)，零點(diǎn)試驗(yàn)重復(fù)5次，用于估計(jì)試驗(yàn)誤差。最后通過對(duì)數(shù)據(jù)的分析，獲得最佳的發(fā)酵條件。試驗(yàn)中各因素水平如表2所示。

2 結(jié)果

2.1 Plackett-Burman篩選試驗(yàn)

對(duì)PB試驗(yàn)結(jié)果（表3）進(jìn)行方差分析，方差分析結(jié)果（表4）顯示，對(duì)菌體產(chǎn)量影響較為顯著的前3個(gè)因素分別為：培養(yǎng)溫度（P=0.018）、初始pH（P=0.076）、搖床轉(zhuǎn)速（P=0.090）。經(jīng)過方差分析，獲得多元一次不等式（已編碼）：

OD600=0.92467+0.23033 搖床轉(zhuǎn)速+0.24367初始pH-0.02900培養(yǎng)時(shí)間+0.06667接種量+0.36883培養(yǎng)溫度

在該等式中，培養(yǎng)溫度、初始pH，搖床轉(zhuǎn)速的系數(shù)分別為+0.36883，+0.24367，+0.23033，均為正數(shù)，即培養(yǎng)溫度、初始pH和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)OD600都呈正效應(yīng)［14］，因而提高pH和搖床轉(zhuǎn)速，升高培養(yǎng)溫度能夠增加OD600的值，即增加菌體濃度。根據(jù)Plackett-Burman的試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)最陡爬坡試驗(yàn)。

2.2 最陡爬坡試驗(yàn)

根據(jù)對(duì)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果的分析，設(shè)計(jì)爬坡試驗(yàn)，結(jié)果（表5）顯示，最優(yōu)的培養(yǎng)條件為處理3，因此以處理3中各因素的水平為Box-Behnken 試驗(yàn)的0水平點(diǎn)，設(shè)計(jì)試驗(yàn)。

2.3 Box-Behnken試驗(yàn)

采用Box-Behnken中心設(shè)計(jì)原理，對(duì)影響AM53菌株的活菌數(shù)的上述重要因素，即培養(yǎng)溫度（℃）、初始pH和搖床轉(zhuǎn)速（r/min），采用Design-expert V8.0軟件對(duì)其進(jìn)行3因素3水平的中心組合設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)以及結(jié)果見表6。

為考察各因素對(duì)AM53菌株活菌數(shù)的影響，以菌體發(fā)酵液在OD600的吸收值為指標(biāo)，利用 Designexpert 8.0軟件對(duì)表6中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，得到三因素與OD600值（Y）之間的回歸方程：

Y=-36.555+1.519A+1.189B+0.113C+0.011AB+2.688E-5AC-6.900E-4BC-0.0265E-3A2-0.087B2-2.927E-4C2

二次多項(xiàng)式方程擬合的方差分析結(jié)果（表7）顯示，本試驗(yàn)的回歸模型達(dá)到了極顯著水平（P＜0.0001），回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2=0.9889，說明該模型回歸顯著，另外，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.2518＞0.05，a=0.05），誤差項(xiàng)不顯著，表明實(shí)際情況與回歸方程之間吻合度較好，試驗(yàn)誤差較小，可用此回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。另外，該回歸模型各項(xiàng)的方差分析結(jié)果還表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有較顯著影響，則響應(yīng)值的變化較為復(fù)雜，與各具體試驗(yàn)因素之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。因此在一定范圍內(nèi)可變動(dòng)pH、培養(yǎng)溫度和搖床轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系，從而使發(fā)酵液中的活菌數(shù)達(dá)到最高水平。

利用 Design-expert 8.0軟件對(duì)表6中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到二次多項(xiàng)式回歸方程的響應(yīng)面圖及等高線圖（圖1-圖3）。

Design-expert 8.0軟件對(duì)表6中的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析后，可得到發(fā)酵液的最大OD600值為1.864。各試驗(yàn)因素的最佳取值分別為：培養(yǎng)溫度為30.52℃，初始pH為8.09，搖床轉(zhuǎn)速為184.67 r/min。為了驗(yàn)證本次分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)合實(shí)際情況，將菌株AM53發(fā)酵培養(yǎng)條件的最佳條件修正為：培養(yǎng)溫度30.5℃，初始pH=8，搖床轉(zhuǎn)速185 r/min，進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)，所得發(fā)酵液的實(shí)際OD600值的平均值約為1.861。可見，實(shí)際結(jié)果與Design-expert 8.0軟件的預(yù)測(cè)結(jié)果符合良好，說明采用響應(yīng)面法（RSM）優(yōu)化菌株AM53的發(fā)酵培養(yǎng)條件是可行的。

3 討論

杉木炭疽病是潛伏侵染性的病害，針葉帶菌率隨著氣溫的升高而增加，到8月份達(dá)到最高。入秋后，溫度適宜時(shí)又會(huì)有少量的植株感??；11月后逐漸下降，到3月底降到最低，4月份又開始回升，危害嫩葉、嫩梢。目前，已見報(bào)道的杉木炭疽病防治方法大多是營(yíng)林防治和化學(xué)防治。其中，化學(xué)防治方法是在病害發(fā)生的早期，采用波爾多液、可濕性退菌特、多菌靈或炭疽福美等各藥劑交替使用，從而防治杉木炭疽病的發(fā)生與擴(kuò)散。但是，化學(xué)藥劑基本上只有預(yù)防作用，卻沒有很有效的治療作用［15-17］。同時(shí)，化學(xué)農(nóng)藥的使用，也會(huì)破壞了自然界的生態(tài)平衡。

本研究從杉木葉片中分離得到了杉木炭疽病的拮抗細(xì)菌AM53，并鑒定了該菌株為地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）。在抑菌試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，新鮮的發(fā)酵液具有穩(wěn)定的抑菌效果，這與發(fā)酵液中的活菌數(shù)、菌活力及代謝產(chǎn)物有著密切的關(guān)系，由于拮抗菌AM53的培養(yǎng)基是基礎(chǔ)的細(xì)菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，因而不再對(duì)其進(jìn)行優(yōu)化研究，對(duì)拮抗細(xì)菌AM53的發(fā)酵條件展開了優(yōu)化研究。經(jīng)過Plackett-Burman篩選試驗(yàn)表明，培養(yǎng)溫度、初始pH和搖床轉(zhuǎn)速對(duì)AM53活體數(shù)有顯著的影響作用，且均為正效應(yīng)。通過最陡爬坡試驗(yàn)的結(jié)果分析，找到逼近響應(yīng)值的區(qū)域。最后通過對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果的分析，找到拮抗菌AM53的最佳發(fā)酵條件，在該發(fā)酵條件下，拮抗菌AM53的平均OD值為1.861。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)杉木拮抗菌AM53的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度30.5℃，初始pH=8，搖床轉(zhuǎn)速185 r/min，接種量為5%，培養(yǎng)24 h。在此條件下，OD600平均值為1.861。經(jīng)驗(yàn)證表明該模型能較好的預(yù)測(cè)該菌株實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)酶的情況，說明該模型可以在實(shí)踐中應(yīng)用。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Optimization of Fermentation Conditions of Antagonistic Bacterium AM53 Against Colletotrichum gloeosporioides

Yang Jing Zhou Guoying Tan Yimin Lu Zongyan
（The Key Laboratory for Economic Forest Cultivation and Conservation of Education Ministry，Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004）

It was to optimize the fermentation conditions ofBacillus licheniformis.The Plackett-Burman design was used to optimize the fermentation conditions, and the results showed that culture temperature, the initial pH and the rotating speed had significant influence on the count of the living AM53. After the steepest ascent test and Box-Behnken design, the optimal fermentation conditions of AM53 that we got were：culture temperature was 30.5℃, the initial pH was 8, rotating speed was 185 r/min and inoculation volume was 2%, cultured 24 hours. Under this condition, the average of OD600was 1.861, which means the experimental values agreed with the predicted values, the predicted model was reliable and available for the optimization of AM53 fermentation conditions

Antagonistic bacterium AM53 Fermentation conditions Plackett-Burman design Box-Behnken design

2013-12-10

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)（201004014）

楊菁，女，碩士研究生，研究方向：應(yīng)用微生物；E-mail：123196515@163.com

周國(guó)英，女，博士，教授，研究方向：林業(yè)微生物；E-mail：gyzhou2118@163.com