柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的篩選及其降解性能研究

徐曉宇 陳敬華

（江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，無錫 214122）

柴油降解菌Acinetobacter sp. AK5的篩選及其降解性能研究

徐曉宇 陳敬華

（江南大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院，無錫 214122）

從污水處理廠的活性污泥中分離到一株柴油降解菌，通過生理生化鑒定和16S rDNA序列分析，鑒定該菌為不動(dòng)桿菌Acinetobactersp. AK5。檢測了不同pH值、NaCl濃度、培養(yǎng)時(shí)間和各種柴油濃度下Acinertobactersp. AK5的柴油降解情況。結(jié)果表明，該菌的最適生長初始pH值為5-9，適合NaCl濃度為3%-4%，柴油濃度為5 g/L時(shí)，該菌7 d柴油降解率可達(dá)99%，柴油濃度為20 g/L時(shí)，7 d柴油降解率也可達(dá)67%。AK5在人工海水培養(yǎng)基中及無機(jī)鹽培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，在海水和淡水石油污染的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。

柴油 降解 不動(dòng)桿菌 降解率

由于全球性廣泛的石油開采、運(yùn)輸、使用和處置，石油及其產(chǎn)品的泄漏已經(jīng)成為世界性的環(huán)境問題。在土壤、海洋和大氣環(huán)境中的石油污染日益嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)全世界每年有1×109t原油及其產(chǎn)品進(jìn)入環(huán)境中，污染土壤、地下水、河流和海洋［1，2］。當(dāng)前，海洋的石油污染日趨加劇，石油的主要成分包括烷烴、芳香烴和多環(huán)芳烴等，石油進(jìn)入海洋水體后，會(huì)產(chǎn)生大面積的油膜，石油污染影響景觀，破壞物理環(huán)境，油膜能黏附魚卵與幼魚，使其死亡。同時(shí)油膜減少了太陽輻射投入海水的能量和進(jìn)入海水中氧的數(shù)量，阻隔了海水和空氣的相互作用和熱交換，阻止海水蒸發(fā)，造成水生動(dòng)物缺氧死亡，從而降低了海洋的自凈能力，影響海洋生物的光合作用和生物鏈循環(huán)，進(jìn)而使海洋生態(tài)系統(tǒng)遭到嚴(yán)重破壞，導(dǎo)致受污染的海洋生態(tài)系統(tǒng)經(jīng)過幾十年都難以修復(fù)［3］。

石油烴污染的處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法。其中生物處理方法相對于物理和化學(xué)方法具有費(fèi)用低、無二次污染等優(yōu)點(diǎn)。目前，國內(nèi)外針對石油烴的微生物降解首先集中于單純或混合微生物培養(yǎng)物對石油烴的降解動(dòng)力學(xué)及其降解情況［4-6］，近幾年，添加表面活性劑［7-9］、添加碳源［10-12］和其它技術(shù)［13-16］在提高微生物的石油烴降解效率的研究也有報(bào)道。國內(nèi)外學(xué)者也進(jìn)行了很多關(guān)于海洋石油降解菌的篩選研究［17-19］，本研究從污水處理廠的活性污泥中篩選出一株高效柴油降解菌，并對其進(jìn)行鑒定，研究其在人工海洋培養(yǎng)基中的柴油降解條件以及降解特性，旨在為其在海洋石油污染治理方面的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 從無錫某生活污水處理廠二沉池中采集活性污泥，用無菌采樣瓶帶回實(shí)驗(yàn)室，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基 菌株傳代用培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基）：蛋白胨10.0 g/L；酵母粉5.0 g/L；NaCl 10.0 g/L；pH 7.0-7.2。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基：柴油10.0 g/L；KH2PO4 2.0 g/L；K2HPO42.0 g/L；KNO31.0 g/L；（NH4）2SO42.0 g/L；NaCl 1.0 g/L；MgSO4·7H2O 0.2 g/L；CaCl2·H2O 0.02 g/L；FeCl2·7H2O 0.01 g/L［6］；微量元素液1 mL，維生素B1 0.004 g/L，pH7.0-7.2，121℃濕熱滅菌20 min后補(bǔ)加微量元素液混合液2 mL（經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌）。微量元素液配方：H3BO30.1 g/L；MnCl2·4H2O 0.1 g/L；ZnSO4·H2O 0.1 g/L；FeCl3·6H2O 0.1 g/L；CaCl21.0 g/L；CuCl2·2H2O 0.05 g/L。

人工海水培養(yǎng)基（MMC）：NaC1 24 g，KC1 0.7 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，NH4NO31 g，KH2PO42 g，Na2HPO4·12H2O 3 g，蒸餾水1 L，pH7.4，并補(bǔ)加柴油10 g作為唯一碳源（0.45 m濾膜過濾除菌）配制。121℃濕熱滅菌20 min后補(bǔ)加微量元素液混合液2 mL（經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌）。微量元素溶液：MgSO4·7 H2O 4 g，CuSO4·5H2O 1 g，MnSO4·H2O 1 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 g，CaC121 g，蒸餾水1 L。

1.2 方法

1.2.1 柴油降解菌的富集和分離

1.2.1.1 菌源富集 配制無機(jī)鹽培養(yǎng)基，250 mL的三角燒瓶加入100 mL培養(yǎng)基，滅菌后，加入活性污泥，加入1 mL柴油，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱以轉(zhuǎn)速120 r/min，30℃恒溫培養(yǎng)。取上述培養(yǎng)3 d后的混合培養(yǎng)液進(jìn)行接種馴化，30℃、150 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)7 d。馴化時(shí)，先取5 mL富集后的培養(yǎng)液到含有最低柴油濃度的新鮮馴化培養(yǎng)液中，培養(yǎng)7 d，然后從中取出5 mL培養(yǎng)液加入含有較高原油濃度的馴化培養(yǎng)液中，再次培養(yǎng)7 d。重復(fù)3次。

1.2.1.2 單菌株的分離 將篩選出的能以柴油為唯一碳源生長的混合菌分別接種到柴油濃度為0.5%的人工海水培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床上進(jìn)行振蕩培養(yǎng)，在LB固體培養(yǎng)基上利用平板劃線方法進(jìn)行單菌株的分離。

1.2.2 柴降解菌株的鑒定 將一株降解能力較好的菌株命名為AK5，將該菌株劃線接種LB培養(yǎng)平板上培養(yǎng)后挑取單菌落，于斜面培養(yǎng)進(jìn)行培養(yǎng)24 h，革蘭氏染色后并進(jìn)行生理生化鑒定。用DNA快速提取試劑盒提取菌株AK5基因組DNA，采用16S通用引物（27F：5'-AGAGTTTGAAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3；1492R：5'-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3'）對AK5的16S rDNA序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系（25 μL）為：模板DNA 1 μL，Taq10×緩沖液5 μL，dNTP 100 mol/L，DNA聚合酶2.5 U，上下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1.5 min，循環(huán)30次；72℃延伸10 min。電泳割膠回收后，將PCR產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞中，通過藍(lán)白斑篩選陽性重組子，送華大基因測序。將測得的16S rDNA序列在NCBI的GenBank進(jìn)行比對，對獲得的同源序列進(jìn)行分析，采用Neighbor-Joining（N-J）法構(gòu)建進(jìn)化樹。

1.2.3 柴油降解菌降解特性

1.2.3.1 pH對菌株柴油降解的影響 將體積分?jǐn)?shù)10%的AK5菌液接種到人工海水培養(yǎng)基中，在30℃，200 r/min，柴油濃度為10 g/L，pH分別為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0，培養(yǎng)7 d，分別檢測其柴油降解率。

1.2.3.2 NaCl濃度對菌株柴油降解的影響 將AK5菌液按照10%體積比接種到NaCl分別為0、1%、2%、3%、4%和5%的人工海水培養(yǎng)基中，在30℃，200 r/min，柴油濃度為10 g/L的條件下培養(yǎng)7 d，分別檢測其柴油降解率。

1.2.3.3 柴油濃度對菌株柴油降解的影響 將AK5按照10%體積比接種到人工海水培養(yǎng)基中，其柴油濃度分別為5、10、15和20 g/L，培養(yǎng)7 d，每天取樣，檢測其在不同柴油濃度下的柴油降解率。

1.2.3.4 培養(yǎng)基對AK5柴油降解的影響 將AK5按照10%體積比分別接種到無機(jī)鹽培養(yǎng)基和人工海水培養(yǎng)基中，柴油初始濃度為5 g/L。每天取樣，檢測其不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的柴油降解率。

1.2.4 柴油降解率的檢測 將AK5在含不同石油烴組分培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以紫外分光光度法在230 nm波長下檢測柴油濃度［20］計(jì)算降解率。

2 結(jié)果

2.1Acineitobactersp. AK5菌株的形態(tài)特征與16S rDNA序列分析

柴油降解菌Acinetobactersp. AK5，菌落圓形，黃白色，表面光滑，革蘭氏染色陰性球桿菌、無鞭毛、有莢膜、不產(chǎn)芽孢、不發(fā)酵葡萄糖、乳糖、甘露糖、麥芽糖、吲哚試驗(yàn)陰性、甲基紅試驗(yàn)結(jié)果陰性、VP試驗(yàn)陰性，有溶血環(huán)。經(jīng)16S rDNA測序及GenBank比對，并采用N-J法構(gòu)建分子進(jìn)化樹，該菌與不動(dòng)桿菌屬有99%以上的相似性，綜合上述分析結(jié)果將此菌株鑒定為不動(dòng)桿菌菌屬，命名為AK5（圖1）。

2.2 AK5在不同初始pH值下的柴油降解率

柴油降解菌AK5在不同初始pH條件下的柴油降解率（圖2）顯示，AK5在初始pH為6時(shí)降解率最高，可達(dá)90%，而在初始pH10時(shí)柴油的降解率則降到10%以下。細(xì)菌在pH5-9的范圍內(nèi)均有較好的降解率，說明AK5適合在中性偏堿性的條件下生長。而AK5在pH6-9范圍內(nèi)7 d柴油降解率均可以達(dá)到50%以上，能更好地適應(yīng)海洋環(huán)境。

2.3 AK5在不同NaCl濃度下的柴油降解率

研究了NaCl濃度為0-5%條件下柴油降解菌的降解情況（圖3）表明，在NaCl濃度為0-4%的條件下，AK5均有較好的柴油降解率。其中不含NaCl條件下AK5的柴油降解率在62%，3% NaCl濃度下AK5的柴油降解率達(dá)95.6%，但在NaCl濃度為5%時(shí)，柴油降解率降到48%，因此AK5的最適生長的海水NaCl濃度為3%-4%，其最高耐受范圍是4%，適應(yīng)自然海洋環(huán)境水體中的NaCl濃度。

2.4 不同柴油濃度下AK5的柴油降解率

分別在不同初始柴油濃度下研究柴油降解率，結(jié)果（圖4）表明，AK5菌株的柴油降解率隨著柴油濃度升高而降低，柴油濃度為5 g/L時(shí)柴油的降解率最高，第1天降解率就在42.5%，第7天降解率為99%。柴油濃度為20 g/L時(shí)，AK5的柴油7 d降解率也能達(dá)到將近60%。而AK5對質(zhì)量濃度為5 g/L的柴油3 d降解率即超過60%。因此認(rèn)為AK5能更好地適用于降解高濃度柴油污染水體。

2.5 在不同培養(yǎng)基條件下AK5的柴油降解情況

分別將AK5按照10%的接種體積，接種到無機(jī)鹽培養(yǎng)基和人工海水培養(yǎng)基中，柴油初始濃度為5 g/L。每天取樣，檢測其不同培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下的柴油降解率，結(jié)果（圖5）表明，AK5在上述兩種培養(yǎng)基中均生長良好，在培養(yǎng)前4 d中，AK5在無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的柴油降解率要高于海水培養(yǎng)基，培養(yǎng)1 d后，無機(jī)鹽培養(yǎng)基中柴油降解率為50%以上，而人工海水培養(yǎng)基為40%，但是第6、7天，在兩種培養(yǎng)基中的柴油降解率趨于一致，在培養(yǎng)7 d后柴油降解率均達(dá)到99%。由此可見，AK5在淡水及海水環(huán)境下均生長良好并能夠保持較高的柴油降解率，因此可以用于淡水水體和海洋水體的柴油生物處理。

3 討論

生物技術(shù)修復(fù)是海洋受到石油烴污染后采用的一種主要修復(fù)手段，而其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)就是獲得具有高效降解活性的降解微生物。目前已知海洋中最主要的石油烴降解細(xì)菌有：無色桿菌屬（Achromobacter）、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）等。近年來國內(nèi)分離到的海洋石油烴降解菌有：劉陳立等［21］分離得到的食烷菌（Alcanivoraxsp. B-5）；陳碧娥等［22］從湄洲灣污染水樣中分離得到的假單胞菌（Pseudomonassp. H1），譚田豐等［23］從勝利油田黃河碼頭近岸表層海水分離得到的不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp. PN3-2）和蘇瑩［24］分離到的不動(dòng)桿菌（Acinetobactersp. HB-1）和周常義［25］的Acinetobactersp. JMUXMS-100等。

從已經(jīng)報(bào)道的柴油降解菌的種屬分布來看，它們可以分布在廣泛的種屬中，但是以Acinetobacter居多，本研究分離得到的菌株也屬Acinetobacter，但是與其他研究不同的是，本研究獲得菌種的來源并非從受到石油烴污染的海洋環(huán)境中獲得，而是從城市生活污水處理廠活性污泥中分離得到，這說明石油烴類降解菌分布廣泛，具有很強(qiáng)的適應(yīng)性。柴油降解菌的生長條件和降解能力對后續(xù)的應(yīng)用非常重要，因此本試驗(yàn)進(jìn)一步研究了其生長條件和降解特性。從初始pH和NaCl濃度來看，AK5主要是在中性偏堿性的條件下生長較佳，這與其他研究者分離得到的柴油降解菌生長條件類似。在NaCl濃度為0-4%的條件下，AK5均有較好的柴油降解率，但是從降解率曲線可以看出，AK5在NaCl濃度為3%-4%條件下，其柴油降解率（95.6%）反而高于在不含NaCl條件下的降解率（62%），說明該菌非常適合海洋環(huán)境（鹽分含量約3.5%）下應(yīng)用。

有關(guān)AK5降解能力的結(jié)果表明，其降解能力優(yōu)良，在已經(jīng)報(bào)道的一些菌屬中，降解效果較佳，表1列出了一些公開報(bào)道的柴油降解菌的降解條件和性能。此外，AK5在人工海水培養(yǎng)基和普通的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，均具有較好的柴油降解能力，說明該菌種適合于淡水和海水條件下的應(yīng)用。

4 結(jié)論

本研究從污水處理廠的活性污泥中篩選出一株高效柴油降解菌，經(jīng)鑒定為不動(dòng)桿菌，Acinetobactersp. AK5。AK5在人工海水培養(yǎng)基條件下，在pH5-9時(shí)，NaCl濃度0-4%，柴油濃度5-20 g/L的條件下均能高效降解柴油。其中柴油濃度為20 g/L時(shí)7 d柴油降解率仍可達(dá)67%，優(yōu)于已報(bào)道的海洋微生物。AK5在無機(jī)鹽培養(yǎng)基及人工模擬海水培養(yǎng)基中均生長良好，在淡水水體及海水水體中的石油烴污染處理中均有良好的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯 馬鑫）

Isolation of Diesel Degrading Strain Acinetobacter sp. AK5 and Its Degrading Performance

Xu Xiaoyu Chen Jinghua
（School of Pharmaceutical Science，Jiangnan University，Wuxi 214122）

A diesel degradable bacterial strain was isolated from activated sludge and identified asAcinetobactersp. AK5 through physiological, biochemical identification and 16S rDNA sequence analysis. Experiments of the different pH values, NaCl concentrations, culture time and diesel concentrations were detected to evaluate the diesel degradability byAcinetobactersp. AK5. The results show that the optimal initial pH scope for the bacterial growth is from 5 to 9, the optimum NaCl concentrations is between 3% and 4%. When the diesel concentration is 5 g/L, the 7 d diesel degradation rate can reach 99%, while when the concentration of diesel is 20 g/L, 7 d diesel degradation rate can be 67%. TheAcinetobactersp. AK5 can grow well in artificial seawater medium and inorganic salt culture medium, therefore it has promising application prospect in seawater and freshwater oil pollution treatment.

Diesel Degradation Acinetobacter Degradation rate

2014-01-07

江蘇省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（BK2012557）

徐曉宇，女，碩士，研究方向：環(huán)境微生物；E-mail：iist@jiangnan.edu.cn