家蠅變應(yīng)原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及誘導(dǎo)表達(dá)

魏川川 修江帆 王宇 國果 彭傳林 吳沁怡 吳建偉

（貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

家蠅變應(yīng)原Tropomyosin基因的克隆、序列分析及誘導(dǎo)表達(dá)

魏川川 修江帆 王宇 國果 彭傳林 吳沁怡 吳建偉

（貴陽醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴陽 550004）

對家蠅變應(yīng)原原肌球蛋白（Tropomyosin）基因進(jìn)行同源克隆，序列分析；構(gòu)建原核表達(dá)載體并在大腸桿菌中表達(dá)。從家蠅幼蟲cDNA文庫中篩選獲得Tropomyosin基因。以該基因的cDNA文庫質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得家蠅Tropomyosin完整編碼序列。運用生物信息學(xué)方法對該基因及其編碼蛋白的基本理化性質(zhì)、信號肽、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、抗原表位和亞細(xì)胞定位等方面進(jìn)行預(yù)測和分析。構(gòu)建pEASY-E1-Tropomyosin重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌OrigamiB（DE3）中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。Tropomyosin基因ORF全長828 bp，編碼275個氨基酸，理論分子量31.6 kD；等電點為4.65，具有Tropomyosin家族的蛋白保守結(jié)構(gòu)域。成功構(gòu)建重組原核表達(dá)pEASY-E1-Tropomyosin并誘導(dǎo)表達(dá)重組蛋白。

家蠅 Tropomyosin 克隆 生物信息學(xué) 變應(yīng)原

家蠅（Musca domestica）是世界性分布的蠅種，屬昆蟲綱、雙翅目、環(huán)裂亞目、家蠅科，是我國大部分地區(qū)最常見、數(shù)量最多的一種媒介昆蟲。其從幼蟲到成蟲均生活在雜菌橫生的環(huán)境里，表現(xiàn)出極強(qiáng)的適應(yīng)惡劣生存環(huán)境的能力，以機(jī)械性傳播和生物性傳播兩種方式在人類和其它動物之間傳播多種疾病，如痢疾、傷寒、霍亂等，但是家蠅自身鮮見被病原物感染的情況［1］，即使在高密度人工飼養(yǎng)的條件下也不會因大規(guī)模感染而死亡，說明家蠅有其獨特的免疫防御機(jī)制，比生活環(huán)境單一化的昆蟲更有效地抵御病原菌的感染［2］。

原肌球蛋白（Tropomyosin）是肌肉收縮過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)，廣泛分布于各種真核細(xì)胞中，在許多無脊椎動物中都被鑒定為一種重要的過敏原，它能引起過敏性疾病。研究表明，家蠶［3］、疥螨［4］、甲殼類動物［5］和蟑螂［6，7］體內(nèi)普遍存在原肌球蛋白，是一種過敏原。然而，蟑螂［8］和家蠅的糞及其肢體碎屑同樣具有致敏性。斑馬魚原肌球蛋白基因，經(jīng)免疫學(xué)鑒定發(fā)現(xiàn)其具有過敏原性［9］。

由于蟑螂重組變應(yīng)原較天然蟑螂變應(yīng)原更容易標(biāo)準(zhǔn)化，制備方便，Santos等［10］已經(jīng)將重組的蟑螂蛋白應(yīng)用于蟑螂的過敏診斷，并取得良好效果。研究表明，以重組變應(yīng)原用于免疫治療，可以顯著降低患者的IgE結(jié)合能力，具有良好的治療功效［11］。研究證實，重組過敏原可以達(dá)到甚至超過對應(yīng)的抽提制備過敏原與人IgE結(jié)合的能力。在支氣管霉菌性過敏癥血清學(xué)診斷中，使用重組過敏原已經(jīng)證實優(yōu)于天然過敏原［12］。

本課題組在前期采用菌落活性染色法［13］，構(gòu)建家蠅三齡幼蟲熱脅迫狀態(tài)下的cDNA文庫［14］，并從中篩選到一條Tropomyosin基因，經(jīng)序列分析及BLAST比對，提示該基因為原肌球蛋白家族。本研究克隆出家蠅的Tropomyosin基因，并且在大腸桿菌中表達(dá)及進(jìn)行生物信息學(xué)分析，旨在為進(jìn)一步研究其免疫學(xué)功能及臨床上脫敏治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 家蠅三齡幼蟲為本實驗室飼養(yǎng)，幼蟲均重26.5 mg，飼養(yǎng)溫度28℃，相對濕度65%，光照周期10N∶14D。

1.1.2 主要試劑 總RNA提取試劑盒（RNAiso PLUS）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaqDNA聚合酶、DNA標(biāo)志物（DL2 000 DNA Marker）、pMD18-T 質(zhì)粒、瓊脂糖等購置于TaKaRa公司；pEASY-E1質(zhì)粒購置于北京全式金生物公司，大腸桿菌 BL21（DE3）由中山大學(xué)病原生物學(xué)實驗室饋贈，其余試劑購置于上海生工生物公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA合成 總RNA的抽提按照TaKaRa公司的RNAiso PLUS說明書進(jìn)行操作?？俁NA經(jīng)電泳檢測，GeneQuant公司核酸定量分析儀測定A260/A280比值及濃度，選取A260/A280的比值范圍為1.95-2.00的樣本，以1 μg總RNA為模板，按照cDNA合成試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2Tropomyosin基因全長cDNA的獲得 從課題組前期構(gòu)建的家蠅三齡幼蟲熱脅迫cDNA文庫［15-18］中篩選到克?。?02C03）進(jìn)行測序，獲得Tropomysin的 完 整ORF序 列， 運 用Primer Premier 5.0設(shè)計特異性引物。上游引物（Trop-F）：5'-ATGAAAATCGACAAGGATGCGGCC-3'，下游引物（Trop-R）：5'-TTATTCCTTGAGGATGAGCTCGACG-3'；進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將其PCR產(chǎn)物純化后亞克隆入pMD18-T載體，陽性克隆送上海生工生物公司測序鑒定。

1.2.3Tropomyosin基因的生物信息學(xué)分析 通過NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.blastX）對處于不同進(jìn)化地位的其它物種Tropomyosin的同源蛋白序列進(jìn)行序列比對，分析該基因蛋白的氨基酸序列與其他蛋白質(zhì)氨基酸序列的相似性；用DNAclub軟件分析cDNA 序列和開放閱讀框；運用Signal P分析信號肽序列；運用EMBL-EBI的在線分析工具InterProScan 4分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域及活性位點；利用蛋白分析專家系統(tǒng)（Expert Protein Analysis System，ExPASy）的在線分析軟件Protparam，分析預(yù)測蛋白質(zhì)的氨基酸殘基性質(zhì)、分子量及理論等電點等；利用PREDICTPROTEIN在線分析軟件預(yù)測蛋白質(zhì)中包含的結(jié)構(gòu)域和氨基酸功能位點；利用SWISS MODEL在線預(yù)測網(wǎng)站預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)。利用PSORTⅡ在線分析網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的定位；通過IEDB Analysis Recource分析蛋白抗原表位。

1.2.4 家蠅Tropomyosin重組蛋白表達(dá)

1.2.4.1 pEASY-E1-Tropomyosin重組質(zhì)粒的構(gòu)建 以家蠅pMD18-T-Tropomyosin質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，膠回收PCR產(chǎn)物。將純化產(chǎn)物與pEASY-E1載體25℃連接10 min，并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌Trans1-T1，挑取陽性克隆，放入含芐青霉素（50 mg/mL）的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒選用載體T7啟動子上游引物（T7F）、T7終止子下游引物（T7R）及Trop-F、Trop-R進(jìn)行PCR及測序鑒定。將陽性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，挑取陽性克隆，進(jìn)行PCR鑒定，試驗中所需的各引物序列見表1。

1.2.4.2 pEASY-E1-Tropomyosin重組蛋白的表達(dá)及鑒定 取過夜培養(yǎng)的菌液60 μL，加入含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min 震搖約5 h至OD600=0.6，加入IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，取過夜誘導(dǎo)表達(dá)菌液，SDS-PAGE電泳檢測。

2 結(jié)果

2.1 家蠅Tropomyosin全長cDNA的獲取

以家蠅三齡幼蟲cDNA為模板，使用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳鑒定，可見828 bp左右條帶（圖1）；經(jīng)測序鑒定，證實獲得家蠅Tropomyosin全長cDNA，該序列已上傳至GenBank（登錄號：KF974800）。

2.2 家蠅Tropomyosin基因的生物信息學(xué)分析

家蠅Tropomyosin基因編碼區(qū)長度為828 bp，編碼275個氨基酸（圖2）。預(yù)測蛋白的理論分子量為31.599 kD，等電點為4.65。在哺乳細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)的半衰期為30 h；在酵母和大腸桿菌中體內(nèi)表達(dá)的半衰期分別大于20 h和10 h。在溶液中的不穩(wěn)定指數(shù)為39.06，預(yù)測在溶液中性質(zhì)穩(wěn)定。脂肪族指數(shù)86.73，總親水性平均系數(shù)GRAVY-0.998，蛋白質(zhì)總體疏水性系數(shù)高。

信號肽預(yù)測結(jié)果表明該蛋白不含信號肽，屬于非分泌型蛋白?？缒そY(jié)構(gòu)預(yù)測顯示Tropomyosin蛋白沒有跨膜區(qū)，PREDICTPROTEIN sec預(yù)測組成Tropomyosin多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)有2種類型，α螺旋（H）和無規(guī)則卷曲（L）的比例為98.55∶1.45，α螺旋占絕大多數(shù)。通過 Swiss-model 預(yù)測Tropomyosin蛋白的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖3）顯示，其結(jié)構(gòu)為線性，主要由α-螺旋構(gòu)成與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測所得結(jié)果能較好地吻合。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，家蠅Tropomyosin蛋白中含有Tropomyosin的功能域（1-272 aa），5個保守位點分別位于74-91 aa，110-130 aa，135-163 aa，165-188 aa，221-246 aa；活性位點位于222-230 aa，屬于Tropomyosin家族。

亞細(xì)胞定位分析結(jié)果顯示，其分布在細(xì)胞核的可能性為73.9%，分布在細(xì)胞骨架的可能性為17.4%分布在細(xì)胞質(zhì)的可能性為4.3%，分布在線粒體的可能性為4.3%。

根據(jù)蛋白質(zhì)抗原表位在線分析工具預(yù)測其主要線性抗原決定簇的位置分別是8-9 aa，14-35 aa，41-42 aa，44-51 aa，61-74 aa，89-98 aa，101-115 aa，125-133 aa，147-154aa，166-178 aa，199-213 aa，223-231 aa，244-245 aa，257-264 aa。

2.3 家蠅Tropomyosin重組質(zhì)粒構(gòu)建及蛋白表達(dá)

2.3.1 家蠅pEASY-E1-Tropomysin重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 選用組合引物：Trop-F和Trop-R，T7F和Trop-R，Trop-F和 T7R，T7F和T7R進(jìn)行菌液PCR鑒定重組質(zhì)粒pEASY-E1-Tropomysin；提取重組質(zhì)粒進(jìn)行測序鑒定，與預(yù)期結(jié)果一致，確定插入片段連接方向正確。所構(gòu)建的重組質(zhì)粒的表達(dá)產(chǎn)物帶有6個His標(biāo)簽，方便蛋白的純化。

2.3.2 家蠅Tropomyosin重組蛋白表達(dá) 將鑒定為陽性的重組表達(dá)質(zhì)粒導(dǎo)入到表達(dá)菌株BL21（DE3）中，經(jīng)終濃度為2 mmol/L的 IPTG誘導(dǎo)5 h獲得重組蛋白。SDS-PAGE 電泳分析（圖4）顯示，在約35 kD 處有外源蛋白表達(dá)條帶出現(xiàn)（pEASY-E1載體His標(biāo)簽及部分載體蛋白大小約為3.2 kD），與預(yù)期分子量一致。而未經(jīng)誘導(dǎo)菌株與空載體陰性對照菌在此位置確缺少該條帶，表明目的蛋白重組表達(dá)成功。

3 討論

自自然界中引起人們致敏的昆蟲有蠅類、蛾類（如麥蛾、燈蛾）、蝶類、蟑螂等較多見。這些昆蟲的肢體碎屑，鱗毛、排泄物、蛻皮、蟲卵以及昆蟲自身散發(fā)的特殊氣味，均可成為吸入性致敏原，通過空氣吸入而引起呼吸道過敏，亦有少數(shù)由昆蟲叮咬、螯刺而引起嚴(yán)重的過敏休克。為了解除昆蟲類致敏原對人類健康的危害，在臨床上通常將致敏昆蟲通過處理制作成為抗原，對過敏病人進(jìn)行皮試，以查找過敏原。此法是變態(tài)反應(yīng)臨床工作開展特異性診斷、治療的手段。故昆蟲變應(yīng)原疫苗的制備質(zhì)量對于患者的臨床診斷和脫敏治療有著十分重要的意義［19］。

原肌球蛋白在許多無脊椎動物中被鑒定為一種重要的過敏原，例如屋塵螨，蟑螂［20］，魷魚，蝸牛和牡蠣［21］，并且相互之間有交叉反應(yīng)［22］。然而，脊椎動物的原肌球蛋白雖然與無脊椎動物的原肌球蛋白有較高的同源性，卻不引起過敏。

大腸埃希菌原核表達(dá)系統(tǒng)由于其遺傳背景清楚、轉(zhuǎn)化及表達(dá)效率高、成本低廉，被廣泛地用于異源蛋白的表達(dá)。本研究選用的pEASY-E1 expression vector由pET載體改造而成，利用5 min快速TA克隆技術(shù)克隆PCR產(chǎn)物，無需酶切，無需純化，直接克隆，提供氨芐青霉素篩選標(biāo)記；利用T7lac啟動子嚴(yán)謹(jǐn)調(diào)控、高效表達(dá)目的基因；其N端含有6-His蛋白純化標(biāo)簽，便于采用鎳離子金屬螯合劑親和層析柱［23］進(jìn)行重組蛋白純化。

本研究成功克隆出家蠅原肌球蛋白基因的全序列，約為828bp，編碼275個氨基酸，序列已上傳至GenBank（登錄號：KF974800.1），家蠅Tropomyosin蛋白中含有Tropomyosin的功能域（1-272 aa），5個保守位點分別位于74-91 aa，110-130 aa，135-163 aa，165-188 aa，221-246 aa；活性位點位于222-230 aa，屬于Tropomyosin家族。蛋白質(zhì)抗原表位分析Tropomyosin具有較強(qiáng)的抗原性，根據(jù)潛在的抗原表位，可以獲得低致敏變應(yīng)原，從而降低重組蛋白的致敏性，減弱脫敏治療過程中可能誘發(fā)的過敏反應(yīng) 。

此外，成功構(gòu)建家蠅Tropomyosin的高效原核表達(dá)載體，得到相對分子質(zhì)量為35 kD的重組原肌球蛋白，并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。這將為后續(xù)家蠅原肌球蛋白的免疫學(xué)功能研究，以及由家蠅引起的變態(tài)性反應(yīng)疾病的特異性診斷和治療打下堅實的基礎(chǔ)。。

4 結(jié)論

本研究克隆出家蠅原肌球蛋白基因的全序列，約為828 bp。成功構(gòu)建家蠅Tropomyosin的高效原核表達(dá)載體，得到相對分子質(zhì)量為35 kD的重組原肌球蛋白，并進(jìn)行相關(guān)的生物信息學(xué)分析。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Cloning，Sequence Analysis and Prokaryotic Expression of Musca domestica Allergen Tropomyosin Gene

Wei Chuanchuan Xiu Jiangfan Wang Yu Guo Guo Peng Chuanlin Wu Qinyi Wu Jianwei
（Basic Medical College，Guiyang Medical College，Guiyang 550004）

It was to probe into the homologous cloning of the Musca domestica allergen Tropomyosin gene, and then construct the prokaryotic expression vector which was expressed in Escherichia coli. Screening and isolation of Musca domestica Tropomyosin gene from Musca domestica cDNA library was carried out. The gene and encoded protein sequence of Tropomyosin was analyzed by bioinformatics methods , including general physical and chemical properties, signal peptide, secondary structure, tertiary structure, epitope and subcellular localization. Then plasmid pEASY-E1-Tropomysin were transformed into Escherichia coli BL21(DE3) competent cells for expression. The open reading frames of the Tropomyosin gene was 828 bp that encded a putative protein with 275 amino acids. The protein, with predicted molecular weight 31.6 kD and pI of 4.65, has the conserved Tropomyosin domain so belongs to Tropomyosin family. The result showed that the recombinant prokaryotic expression vector pEASY-E1-Tropomysin was successfully constructed and fusion protein was expressed in E. coli.

Musca domestic Tropomyosin Cloning Bioinformatics Allergen

2014-01-08

國家科技支撐計劃（2011BAC06B12），國家自然科學(xué)基金項目（81360254），貴州省科學(xué)技術(shù)基金項目（黔科合J字[2012]2038號）

魏川川，男，碩士研究生，研究方向：昆蟲分子免疫學(xué)研究；E-mail：752308241@qq.com

吳建偉，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：昆蟲分子免疫學(xué)研究；E-mail：wjw@gmc.edu.cn