重組人gdnf乳腺特異表達載體轉染牛胎兒成纖維細胞的研究

虞飛 李斌 張晶晶 丁海麥 張學明

（內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，包頭 014040）

重組人gdnf乳腺特異表達載體轉染牛胎兒成纖維細胞的研究

虞飛 李斌 張晶晶 丁海麥 張學明

（內蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，包頭 014040）

為了制備重組人GDNF牛乳腺生物反應器，采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)雌性牛胎兒成纖維細胞，連續(xù)繼代培養(yǎng)75 d，進行形態(tài)觀察和染色體分析，在此基礎上，轉染帶有新霉素抗性和紅色熒光蛋白雙重篩選標記的重組人gdnf乳腺特異表達載體pNR-GDNF，G418篩選陽性抗性克隆，進行PCR法鑒定。結果表明，分離培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細胞具有正常的形態(tài)、分裂增殖特性和染色體數(shù)目；目的基因已整合到轉基因細胞的染色體上。

牛胎兒成纖維細胞 分離培養(yǎng) 轉基因 GDNF

動物乳腺生物反應器是指通過轉基因動物乳腺大規(guī)模生產(chǎn)供治療人類疾病和保健用的藥用蛋白或其它生物活性物質［1］。轉基因動物的乳腺可代替細菌和細胞等生物發(fā)酵，對所生產(chǎn)的蛋白質進行翻譯后有效地加工和修飾。因而，動物乳腺生物反應器被國際上公認為是轉基因動物研究中最具有發(fā)展前景的方向之一，也是實現(xiàn)基因工程制藥的重要途徑。多年來對乳腺生物反應器的研究已積累了許多方法和經(jīng)驗，并在研究中產(chǎn)生了約100種藥物的乳腺生物反應器［2］，其中最具有標志性的成果是GTC公司用轉基因山羊乳腺生物反應器生產(chǎn)的人抗凝血酶ATryn?于2006年經(jīng)歐洲醫(yī)藥評價署批準進入治療應用［3］。

膠質細胞系源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial cell linedireved neurotrophic factor，GDNF）是一種分泌性糖蛋白，屬于TGF-β超家族成員［4］。GDNF對多巴胺能神經(jīng)元具有營養(yǎng)及保護作用，在帕金森病及其它神經(jīng)損傷疾病的治療方面顯示出了巨大的應用前景［4-9］?；趧游镌囼灥某晒ρ芯浚珿DNF用于帕金森病的治療已進入二期臨床研究［9-13］。然而GDNF在人和動物體中含量很低，從動物體中制備GDNF用于疾病動物模型和臨床試驗研究是不現(xiàn)實的［14］。因而，應用生物反應器大量生產(chǎn)重組人GDNF用于疾病動物模型和臨床試驗研究具有潛在的重大社會效益和經(jīng)濟效益。

本研究采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)了雌性牛胎兒成纖維細胞，用電擊轉染法將以neo基因和DsRed2作為雙篩選因子的牛β-casein基因5'端調控序列驅動的重組人gdnf乳腺特異表達載體轉入體外培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細胞，為進一步應用體細胞核移植法制備重組人gdnf牛乳腺生物反應器的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 活體材料 1-3月齡牛胎兒取自本地屠宰場。1.1.2 質粒載體 重組人gdnf乳腺特異表達載體pNR-GDNF（圖1），本實驗室構建。

1.1.3 主要試劑及耗材 DMEM/F12，G418，胰蛋白酶（Trypsin）購自Sigma公司；Taq DNA 聚合酶，限制性內切酶購自TaKaRa公司；標準胎牛血清為TBD產(chǎn)品；無機鹽類為日本和光試劑；無內毒素質粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒購自QIAGEN；培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿均為Corning公司產(chǎn)品；細胞培養(yǎng)板為Nunc產(chǎn)品；PCR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 組織塊法分離和培養(yǎng)牛胎兒成纖維細胞 采自屠宰場的牛子宮（含胎兒）于37℃滅菌生理鹽水中帶回實驗室，無菌操作挑選雌性胎兒，PBS清洗。參照文獻［15］方法，取胎兒耳部組織于DMEM/F12 + 10% FBS中剪成約1 mm3小塊，用相同培養(yǎng)液洗3遍，然后將組織塊連同培養(yǎng)液一起轉移到培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動使組織塊成均勻分布，吸干組織塊周圍的培養(yǎng)液，倒置放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h。待組織塊貼壁后，緩緩加入適量培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察并記錄細胞的生長情況。待生長的細胞鋪滿瓶底時，去除組織塊，傳代擴大培養(yǎng)后，冷凍保存。

1.2.2 牛胎兒成纖維細胞中期染色體數(shù)目分析 參照文獻［15-17］方法，待細胞生長至匯合度達到70%-80%時，于4℃冰箱中放置15 h后，加入終濃度為0.1 μg/mL秋水仙素，37℃處理3 h；收集脫壁細胞，加入37℃預熱的0.075 mol/L KCl 5 mL，于37℃低滲處理30 min后，再加入1 mL 4℃預冷的固定液預固定3 min，低速離心10 min，去上清液；加入固定液6 mL，室溫固定30 min，低速離心10 min，小心吸出大部分上清液，留少量固定液重懸細胞進行滴片；室溫自然干燥后，吉姆薩染色30 min，顯微鏡下觀察拍照，分析核型。

1.2.3 牛胎兒成纖維細胞對G418耐受性的檢測 將培養(yǎng)至第3代的細胞以5×104個細胞/孔的密度接種于兩個12孔板中，當細胞生長至80%匯合度時，更換培養(yǎng)液，同時在12孔板中分別加入G418至終濃度為0、100、200、300、400、500、600、700和800 μg/mL，每種濃度接種2孔細胞，每2 d換液1次，每天觀察細胞生長情況，記錄培養(yǎng)在不同G418濃度中的細胞全部被殺死的時間。試驗重復2次。以7-10 d內殺死全部細胞的G418的濃度作為篩選時的最適合濃度。

1.2.4 電穿孔法轉染牛胎兒成纖維細胞 取對數(shù)生長期的細胞，調整密度為1×107/mL；取400 μL細胞懸液加入到間距4 mm電擊杯中，加入12 μg線性化的質粒pNRTCNbG使其終濃度為30 μg/mL，輕輕敲擊杯底使DNA和細胞混勻，550 V電壓、50 μF電容條件下電擊轉染，電擊完成后，電擊槽中靜置1 min，冰浴2 min，然后將細胞以1×106密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，于37℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養(yǎng)。

1.2.5 穩(wěn)定轉染細胞的篩選 轉染的細胞培養(yǎng)48 h后，收集細胞，重新以3×105個細胞密度接種于100 mm培養(yǎng)皿中，加入G418至終濃度500 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液1次，8-10 d后，在熒光顯微鏡下標出紅熒光細胞克?。挥每寺”ǚ蛛x紅熒光克隆細胞，接種于6孔板中擴大培養(yǎng)，待細胞生長至基本匯合時，冷凍保存。

1.2.6 轉基因細胞的鑒定 提取穩(wěn)定轉染細胞基因組DNA，PCR檢測gdnfcDNA是否整合到細胞基因組DNA中。PCR上游引物：5'-GACCTCGAGATGAA GTTATGGGATGTCGTGGCTGTC-3'，下游引物：5'-GA GCTCGAGTCAGATACATCCACACCTTTTAG-3'；反應條件為：94℃變性45 s，58℃復性45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 使用SPSS11.0軟件對數(shù)據(jù)進行x2檢驗分析，P＜0.05為顯著差異。

2 結果

2.1 組織塊分離培養(yǎng)牛胎兒成纖維細胞的形態(tài)學觀察

組織塊貼壁培養(yǎng)3-4 h，加入培養(yǎng)液后僅有極少數(shù)組織塊漂浮，大部分組織塊已貼壁；培養(yǎng)1 d后，部分組織塊邊緣開始游離出少許成纖維細胞（圖2-A）；培養(yǎng)2 d后，多數(shù)組織塊周圍已有均勻的成纖維細胞遷出（圖2-B）；培養(yǎng)4 d后，組織塊周圍的成纖維細胞生長旺盛，數(shù)量明顯增多，向四周擴散（圖2-C）；培養(yǎng)6 d后，組織塊周圍的細胞已生長至完全匯合，且鋪滿了瓶底（圖2-D）；去除組織塊，胰蛋白酶消化，轉至T75培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，待細胞生長至80%匯合時，冷凍保存，留少量細胞繼續(xù)傳代培養(yǎng)；隨著傳代次數(shù)的增多，絕大部分細胞呈纖維狀，高度匯合的細胞呈旋渦狀生長（圖2-E）；說明在細胞生長過程中，成纖維細胞呈優(yōu)勢生長且在細胞群中占主導地位；傳代培養(yǎng)75 d后，細胞呈衰老狀態(tài)，生長變得極緩慢，細胞體積增大，扁平化，有空泡出現(xiàn)等現(xiàn)象（圖2-F）。

2.2 牛胎兒成纖維細胞的染色體數(shù)目分析

取傳代培養(yǎng)15 d和60 d的牛胎兒成纖維細胞進行分裂中期相染色體制片，其中選擇分散良好、輪廓清晰的分裂相進行染色體形態(tài)觀察和數(shù)目統(tǒng)計。結果（圖3）表明，絕大多數(shù)細胞染色體為2n=60，58條常染色體為端部著絲粒，2條性染色體為中部著絲粒。染色體倍型分析結果表明，培養(yǎng)15 d的牛胎兒成纖維細胞染色體成二倍性的比例為83.3%，培養(yǎng)60 d的細胞二倍體比例為77.8%，經(jīng)x2檢驗，二者之間無顯著差異（表1）。染色體組型分析表明體外長期培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細胞能夠進行正常的染色體復制和分裂。

2.3 牛胎兒成纖維細胞對G418的耐受性檢測

利用不同濃度的G418篩選，結果發(fā)現(xiàn)，G418的濃度在200-900 μg/mL的范圍時，對牛胎兒成纖維細胞有明顯的毒害作用，細胞全部被殺死的培養(yǎng)時間隨G418濃度的增大而縮短。G418濃度為500 μg/mL時，細胞培養(yǎng)7 d被全部殺死；G418濃度為600 μg/mL時，細胞培養(yǎng)6 d被全部殺死（圖4）。因此后續(xù)轉染試驗中使用的G418濃度為500 μg/mL。

2.4 穩(wěn)定轉染細胞的篩選及PCR鑒定

電擊轉染的牛胎兒成纖維細胞，用G418篩選7 d后，用克隆杯分離形態(tài)正常、生長旺盛的紅熒光抗性克隆，接種到6孔板中生長至基本匯合度時（圖5），胰蛋白酶消化，冷凍保存。取少量擴培細胞，提取基因組DNA，PCR法檢測，得到了576 bp預期條帶（圖6）表明，目的基因已整合到轉基因細胞的染色體上。

3 討論

自1997年體細胞克隆羊多莉［18］誕生以來，對體細胞進行遺傳修飾后作為核移植供體細胞制備轉基因動物已成為乳腺生物反應器研制的一種理想策略。用于體細胞核移植的供體細胞種類非常廣泛，包括來自胎兒或成體的成纖維細胞、乳腺上皮細胞、顆粒細胞、肌肉細胞、輸卵管上皮細胞、睪丸生殖細胞、支持細胞、肝細胞、神經(jīng)細胞等［19］。由此可見，多種分化的體細胞甚至是分化終端的體細胞，其細胞核在卵母細胞質的作用下經(jīng)重編程后仍具有全能性。但由于受到轉基因技術的要求，外源基因穩(wěn)定轉染后用于核移植的供體細胞的種類卻很少。對于轉基因體細胞克隆動物的制備，從細胞的轉染到陽性克隆的獲得再到擴大培養(yǎng)至少需要30-40 d，再加上原代細胞培養(yǎng)及細胞純化，到轉基因細胞核移植時，細胞在體外培養(yǎng)至少需要50-60 d，遠比大多數(shù)體細胞核移植所用的供體細胞在體外培養(yǎng)的時間長［15］。胎兒成纖維細胞具有易分離、易培養(yǎng)、傳代次數(shù)較多、體外培養(yǎng)時間長、核型較穩(wěn)定等優(yōu)點，可以滿足篩選時體外培養(yǎng)時間長的要求，是目前最理想的可用于遺傳修飾的供體細胞。已成功的轉基因克隆綿羊［20，21］、山羊［22］、豬［23］、牛［24，25］都是使用基因打靶胎兒成纖維細胞作為核供體細胞而制備的。本研究分離培養(yǎng)的牛胎兒成纖維細胞呈典型的纖維狀，生命力旺盛，可連續(xù)傳代培養(yǎng)達75 d，對連續(xù)培養(yǎng)60 d的細胞進行初步的核型分析表明細胞仍具有穩(wěn)定的遺傳特性，可以滿足體外遺傳修飾的要求。

研究者［26，27］認為，用混合的轉基因細胞克隆進行隨機整合轉基因克隆動物的制備可以避免將研究集中于少數(shù)幾個發(fā)育潛能未知的單細胞克隆而導致災難性后果，而且短期抗性篩選得到的混合轉基因克隆細胞比轉染后長期藥物篩選得到的單克隆細胞更適合于核移植；同時，這種策略可以增加后代中基因插入位點的可能性，從而有可能篩選出高表達的轉基因系。本研究使用重組人gdnf乳腺特異表達載體以neo基因和DsRed2作為雙篩選因子，電擊轉染的牛胎兒成纖維細胞，用G418篩選7 d后，用克隆杯分離形態(tài)正常、生長旺盛的紅熒光抗性克隆，接種到6孔板中生長至基本匯合度時，冷凍保存，避免了長時間抗性篩選對核供體細胞帶來的不利影響；同時使用DsRed2作為篩選因子，選用表達紅熒光蛋白的細胞作為核供體可排除非轉基因細胞用于核移植的風險。

4 結論

本研究采用組織塊貼壁法分離培養(yǎng)了雌性牛胎兒成纖維細胞，用重組人gdnf乳腺特異表達載體pNR-GDNF轉染細胞，經(jīng)抗性篩選及PCR鑒定，獲得了穩(wěn)定轉染重組人gdnf的轉基因細胞，為進一步應用體細胞核移植法制備重組人GDNF 牛乳腺生物反應器的研究奠定了基礎。

［1］Clark AJ. The mammary gland as a bioreactor：expression, processing, and production of recombinant proteins［J］. J Mammary Gland Biol Neoplasia, 1998, 3（3）, 337-350.

［2］Houdebine LM. Use of transgenic animals to improve human health and animal production［J］. Reprod Dom Anim, 2005, 40：269-281.

［3］B?sze Z, Baranyi M, Whitelaw CB. Producing recombinant human milk proteins in the milk of livestock species［J］. Adv Exp Med Biol, 2008, 606：357-393.

［4］Kitagawa H, Hayashi T, Mitsumoto Y, et al. Reduction of ischemic brain injury by topical application of glial cell line-derived neurotrophic factor after permanent middle cerebral artery occlusion in rats［J］. Stroke, 1998, 29（7）：1417-1422.

［5］Li L, Wu W, Lin LF, et al. Rescue of adult mouse motoneurons from injury-induced cell death by glial cell line-derived neurotrophic factor［J］. Proc Natl Acad Sci USA, 1995, 92：9771-9775.

［6］Kim BT, Rao VL, Sailor KA, et al. Protective effects of glial cell linederived neurotrophic factor on hippocampal neurons after traumatic brain injury in rats［J］. J Neurosurg, 2001, 95：674-679.

［7］Tomac A, Lindqvist E, Lin LF, et al. Protection and repair of the nigrostriatal dopaminergic system by GDNF in vivo［J］Nature, 1995, 373：335-339.

［8］Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in parkinsonian monkeys treated with GDNF［J］. Nature, 1996, 380：252-255.

［9］Gill SS, Patel NK, Hotton GR, et al. Direct brain infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in Parkinson disease［J］. Nat Med, 2003, 9：589-595.

［10］Love S, Plaha P, Patel NK, et al. Glial cell line-derived neurotrophic factor induces neuronal sprouting in human brain［J］. Nat Med, 2005, 11：703-704.

［11］Patel NK, Bunnage M, Plaha P, et al. Intraputamenal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor in PD：a two-year outcome study［J］. Ann Neurol, 2005, 57：298-302.

［12］Slevin JT, Gerhardt GA, Smith CD, et al. Improvement of bilateral motor functions in patients with Parkinson disease through the unilateral intraputaminal infusion of glial cell line-derived neurotrophic factor［J］. J Neurosurg, 2005, 102：216-222.

［13］Patel NK, Pavese N, Javed S, et al. Benefits of putaminal GDNF infusion in Parkinson disease are maintained after GDNF cessation［J］. Neurology, 2013, 81：1176-1178.

［14］張學明, 羅奮華, 蘇惠敏, 等. 人gdnf基因的克隆及其在牛β-酪蛋白基因座定位整合載體的構建［J］. 生物技術通報, 2009（5）：113-118.

［15］尹明, 章軼哲, 多曙光. 胎牛成纖維細胞的分離培養(yǎng)［J］. 實驗動物科學, 2010, 27（3）：1-6.

［16］梁偉, 肖紅, 高笑宇, 等. 小鼠KGF基因毛囊特異性表達載體的構建及mESC脂質體懸浮轉染條件的優(yōu)化［J］. 生物技術通報, 2011（11）：107-117.

［17］Yan XR, Yang YH, Liu W, et al. Differentiation of neuron-like cells from mouse parthenogenetic embryonic stem cells［J］. Neural Regeneration Research, 2013（4）：293-300.

［18］Wilmut I, Schnieke AE, McWhir J, et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells［J］. Nature, 1997, 385（6619）：810-813.

［19］Denning C and Priddle H. New frontiers in gene targeting and cloning：success, application and challenges in domestic animals and human embryonic stem cells［J］. Reproduction, 2003, 126：1-11.

［20］Schnieke AE, Kind AJ, Ritchie WA, et al. Human factor IX transgenic sheep produced by transfer of nuclei from transfected fetal fibroblasts［J］. Science, 1997, 278（5346）：21.

［21］McCreath KJ, Howcroft J, Campbell KHS, et al. Production of gene targeting sheep by nuclear transfer from cultured somatic cells［J］. Nature, 2000, 405：1066-1069.

［22］Baguisi A, Behboodi E, Melican DT, et al. Production of goats by somatic cell nuclear transfer［J］. Nat Biotechnol, 1999, 17（5）：456-461.

［23］Lai L, Kolber-Simonds D, Park KW, et al. Production of a-1, 3-galactosyl transferase knockout pigs by nuclear transfer cloning［J］. Science, 2002, 295：1089-1092.

［24］Wells DN, Misica PM, McMillan WH, et al. Production of cloned bovine fetuses following nuclear transfer using cells from a fetal fibroblast cell line［J］. Theriogenology, 1998, 49：330.

［25］Kuroiwa Y, Kasinathan P, Matsushita H, et al. Sequential targeting of the genes encoding immunoglobulinm and prion protein in cattle［J］. Nat Genet, 2004, 36：775-780.

［26］Chen SH, Vaught TD, Monahan JA, et al. Efficient production of transgenic cloned calves using preimplantation screening［J］. Biol Reprod, 2002, 67：1488-1492.

［27］楊東山, 杜晨光, 高飛, 等. 牛胎兒成纖維細胞的組織塊貼附法分離培養(yǎng)與電穿孔法基因轉染［J］. 動物學研究, 2006, 27（1）：41-47.

（責任編輯 李楠）

Transfection of Bovine Fetal Fibroblast with the Vector for Expressing Human GDNF Specifically in Mammary Gland

Yu Fei Li Bin Zhang Jingjing Ding Haimai Zhang Xueming
（Baotou Medical College，Inner Mongolia University of Science and Technology，Baotou 014040）

In order to prepare bovine mammary gland bioreactor for production of human recombinant GDNF, the female bovine fetal fibroblast cells were successfully isolated using tissue bulk attachment. The fibroblast cells were cultured consecutively for 75 days for further morphologic observation and chromosome analyzing. The plasmid vector pNR-GDNF, which contained the Neorgene and the DsRed2 gene as positive selection marker genes and human GDNF cDNA gene regulated by bovine beta-casein promoter for specific expression in mammary gland, was transfected into the bovine fetal fibroblast cells by electroporation. After selection with G418 for 7 days, resistant cells expressing red fluorescence protein were isolated, cultured, expanded and cryopreserved by standard procedures. The transgenic cells were indentified by PCR. The results showed that bovine fetal fibroblast cells possessed normal morphology, multiplication characteristics and chromosome number and the foreign gene was integrated into the genome.

Bovine fetal fibroblast Isolation and culture Gene transfer GDNF

2014-01-18

國家自然科學基金資助項目（31060304），內蒙古高等學校科學研究項目（NJ10184）

虞飛，男，碩士研究生，研究方向：基因工程；E-mail：1012058164@qq.com

張學明，男，副教授，研究方向：重組藥物蛋白；E-mail：byzhxm@126.com