γ-聚谷氨酸及其生物合成機(jī)制的研究進(jìn)展

關(guān)陽(yáng)，王國(guó)良，張國(guó)峰，賈力耕，梁穎超，吳延?xùn)|

（玉米深加工國(guó)家工程研究中心，吉林長(zhǎng)春130033）

γ－聚谷氨酸（γ－PGA）是一種聚陰離子多肽，它是由多個(gè)谷氨酸單體以γ－羧基和α－氨基經(jīng)肽鍵的形式縮合而成，且每一個(gè)谷氨酰基都包含各自的手性中心。γ－PGA自發(fā)現(xiàn)以來(lái)就已然成為現(xiàn)代生物高分子聚合物的研究熱點(diǎn)。有關(guān)γ－PGA的純化和測(cè)定方法比較成熟，這為開展基因工程和生物化學(xué)等方面的研究提供了便利條件[1]。從立體構(gòu)型的角度來(lái)分析，γ－PGA具有3種不同類型：γ－D－聚谷氨酸（γ－D－PGA）、γ－L－聚谷氨酸（γ－L－PGA）以及 γ－D/L－聚谷氨酸（γ－DL－PGA）。

在γ－PGA開始實(shí)際應(yīng)用之前，需解決一系列的問(wèn)題。首先是成本問(wèn)題，尤其是在現(xiàn)有條件下γ－PGA的成本遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其它材料。其次，截至目前還不能利用有機(jī)化學(xué)方法人工合成γ－PGA。此外，還需闡明γ－PGA的生物合成機(jī)制，進(jìn)而為隨后的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論支持。如今，我們國(guó)家正致力于構(gòu)建和諧社會(huì)，發(fā)展生態(tài)經(jīng)濟(jì)，實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，而“白色生物技術(shù)”功不可沒(méi)，這為γ－PGA的發(fā)展提供了強(qiáng)大的推動(dòng)力。

1 理化性質(zhì)

γ－PGA具有良好的成膜性、成纖維性、阻氧性、可塑性、粘結(jié)性、吸水性以及可生物降解性等，因而具有增稠、乳化、凝膠、成膜、保溫、助溶、緩釋和粘結(jié)等功能[2]。γ－PGA的pKa=2.23，這與谷氨酸α－羧基的pKa值非常接近[3]。通過(guò)熱重（TGA）和差示掃描量熱（DSC）分析可知，其熔點(diǎn)為223.5℃，熱分解溫度為235.9℃[4]。

γ－PGA 可溶于二甲基亞砜（DMSO）、熱的 N，N－二甲基甲酰胺（MSDS）、N－甲基－2－吡咯烷酮（NMP）[5]。分子量和多分散性是γ－PGA的重要特征參數(shù)，γ－PGA的聚合度在200～700之間，分子量分散性為2～5，分子量越大，其流變性越難控制，也越難被化學(xué)修飾，從而限制其應(yīng)用。可采用多種方法得到不同分子量的γ－PGA，如超聲波降解[6]、堿水解、微生物或酶降解[7]以及改變培養(yǎng)基成分[8]等。

γ-PGA易溶于水，能夠形成有粘彈性的弱凝膠，但有些物理或化學(xué)手段會(huì)破壞γ-PGA形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，甚至失去粘彈性，如長(zhǎng)時(shí)間高溫加熱、酸或堿處理、金屬離子等。研究表明，γ-PGA溶液屬于非牛頓型（假塑性）流體，其表觀粘度隨剪切速率的升高而降低[9]。此外，γ-PGA平均分子量的倒數(shù)與水解時(shí)間在80、100℃和120℃下呈線性關(guān)系，說(shuō)明在加熱條件下，水溶液中的γ-PGA多肽鏈可隨機(jī)斷裂而發(fā)生水解[10]。

2 應(yīng)用

γ-PGA的3種構(gòu)型均安全無(wú)毒、可食用、可生物降解，很有潛力發(fā)展成為一種環(huán)境友好型高分子材料[11]。交聯(lián)γ-PGA具有很強(qiáng)的持水力，可以代替非降解型水凝膠成為新一代可降解水凝膠[12]。γ-PGA在環(huán)境、農(nóng)業(yè)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域都有應(yīng)用價(jià)值，包括生物可降解尿片、蓄水劑、藥物或肥料的緩釋劑等。其中，γ-PGA作為絮凝劑可用于污水處理以及食品和發(fā)酵工業(yè)的下游加工[13]。此外，γ-PGA在工業(yè)中的應(yīng)用領(lǐng)域急劇擴(kuò)大，可作為金屬/放射性核素交聯(lián)劑[11]、蛋白酶抑制劑、低溫防護(hù)劑[14]、苦味減緩劑[15]、增稠劑、飼料添加劑、骨質(zhì)疏松預(yù)防因子[16]、濕潤(rùn)劑、藥物載體[17]、基因載體[18]、治療性生物粘合劑[19]、分散劑和抗體/酶結(jié)合（固定）材料[20]。

3 生產(chǎn)菌株

自發(fā)現(xiàn)第一株生產(chǎn)菌Bacillus anthracis后，又相繼發(fā)現(xiàn)古生菌、細(xì)菌和動(dòng)物均能產(chǎn)生γ-PGA。

3.1 聚-γ-DL-谷氨酸產(chǎn)生菌

1913年，從日本納豆中分離出一株枯草芽孢桿菌（B.subtilis）。在后續(xù)研究中，在納豆粘液中發(fā)現(xiàn)了γ-DL-PGA[21]。

產(chǎn)γ-DL-PGA的芽孢桿菌可分為自產(chǎn)谷氨酸型和外源谷氨酸依賴型。B.subtilis 5E[15]、B.subtilis TAM-4[22]、B.licheniformis A35[23]和 B.licheniformis S173[24]等屬于前者。B.subtilis IFO 3335[25]、B.subtilis subsp.Chungkookjang[21]、B.licheniformis WBL-3[26]、B.licheniformis P-104[27]等屬于后者。地衣芽孢桿菌產(chǎn)生的γ-PGA具有立體結(jié)構(gòu)多樣性[28]，很可能具有兩種或兩種以上γ-PGA合成體系。除枯草芽孢桿菌外，Staphylococcus epidermidis的某些菌株也可以產(chǎn)生γ-DL-PGA以避免激發(fā)哺乳動(dòng)物的免疫反應(yīng)[29]。

3.2 聚-γ-D-谷氨酸產(chǎn)生菌

20世紀(jì)50年代，僅發(fā)現(xiàn)B.anthracis可以生產(chǎn)γ-D-PGA[30]。雖說(shuō)γ-D-PGA對(duì)哺乳動(dòng)物無(wú)毒害作用，但是它可以減弱宿主的免疫力甚至加重炭疽熱癥狀[31]。

3.3 聚-γ-L-谷氨酸產(chǎn)生菌

從很多極端微生物體中分離得到γ-L-PGA[11]。極端嗜堿菌Bacillus halodurans[32]和 Natronococcus Occultus[33]分泌的低分子量γ-L-PGA可以中和菌體周圍的堿性環(huán)境，而極端嗜鹽古生菌Natrialba aegyptiaca產(chǎn)生的高分子量γ-L-PGA可以在高鹽環(huán)境中防止菌體脫水[34]。有研究表明，Bacillus megaterium在鹽的誘導(dǎo)下可以產(chǎn)生以L型為主的γ-PGA[35]。此外，γ-L-PGA還廣泛分布于多種刺胞生物中，比如水螅中刺細(xì)胞分泌粘液的主要成分就是γ-L-PGA[36]。在產(chǎn)生γ-L-PGA的過(guò)程中，具有生物活性的陽(yáng)離子如K+、Mg2+和Ca2+可以輔助調(diào)節(jié)生物體內(nèi)滲透壓。

4 氨基酸多聚物的非核糖體聚合模式

抗菌多肽和抗菌聚氨基酸一般具有以下特點(diǎn)：含有非蛋白質(zhì)氨基酸（如γ-PGA中的D-谷氨酸殘基）、鍵合獨(dú)特（如γ-PGA中的γ-氨基參與成鍵）且修飾方式與眾不同。他們通常都是非核糖體合成模式。

4.1 γ-PGA的硫模板合成機(jī)制

有研究發(fā)現(xiàn)，從L-谷氨酸合成γ-D-PGA的過(guò)程中需要細(xì)胞膜的輔助；反之，D-谷氨酸既不能作為底物也不充當(dāng)抑制劑。這種核苷由副反應(yīng)產(chǎn)生，比如L-谷氨酸存在下，ATP水解成AMP[37]。

以上發(fā)現(xiàn)有力地支持了γ-PGA的硫模板機(jī)制假說(shuō)，尤其更適用于γ-D-PGA。酶中的兩個(gè)巰基基團(tuán)可參與催化：結(jié)合位點(diǎn)S1H和延伸位點(diǎn)S2H。首先，L-谷氨酸活化，ATP水解生成L-谷氨酰-γ-腺苷酸；然后以共價(jià)鍵形式連接到S1H基團(tuán)上，異構(gòu)成D-谷氨酸。γ-D-PGA鏈和S2H基團(tuán)的硫酯鍵受到S1H位點(diǎn)上的D-谷氨酰的親核攻擊，進(jìn)而使鏈得到延伸。最后，γ-DPGA鏈重新回到S2H位點(diǎn)或被終止子釋放從而反應(yīng)結(jié)束。雖然，B.licheniformis的基因組已被破解，但類似非核糖體肽合成酶（NRPS）的γ-PGA合成酶基因圖譜尚不清楚。而一旦被獲悉，人們將很可能發(fā)現(xiàn)一種全新的合成生物多聚氨基酸分子機(jī)制及其嚴(yán)格的立體結(jié)構(gòu)規(guī)則。

4.2 γ-PGA的氨基連接合成機(jī)制

在B.subtilis subsp.chungkookjang中發(fā)現(xiàn)，合成γ-PGA需要細(xì)胞膜的輔助[38]。與 B.licheniformis ATCC9945不同，它可以同時(shí)利用D-和L-谷氨酸作為底物；而且，ATP水解后得到的是ADP而非AMP[39]。有學(xué)者研究表明，B.subtilis中的γ-DL-PGA合成酶不是類似NRPS，而是一種內(nèi)含氨基連接酶的模塊蛋白復(fù)合體[40]。有趣的是，B.anthracis 合成 γ-D-PGA[41]、B.licheniformis合成 γ-DL-PGA[42]、S.epidermidis合成 γ-DL-PGA[29]的酶均與B.subtilis中PGA合成酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)相類似。

上述發(fā)現(xiàn)均與氨基連接機(jī)制假說(shuō)相一致。該假說(shuō)中，在任何反應(yīng)階段γ-PGA都不以共價(jià)鍵的方式與細(xì)胞膜輔助的酶相連接；因此，必須有一步與胞壁質(zhì)的粘合反應(yīng)[43]。首先，ATP中的磷酰基轉(zhuǎn)移到γ-PGA鏈末端的羧基上，處于活性位點(diǎn)的ADP得以釋放。然后D-/L-谷氨酸單體對(duì)γ-PGA的磷酸化羧基進(jìn)行親核攻擊，進(jìn)而形成一個(gè)新氨基連接。該反應(yīng)在酶活性位點(diǎn)上重復(fù)進(jìn)行，γ-PGA鏈便得以延伸。在解釋芽孢桿菌分泌的γ-PGA為何分子量差異較大且立體結(jié)構(gòu)多樣性時(shí)，氨基連接機(jī)制似乎比硫模板機(jī)制更加合理。

5 生物法合成γ-PGA的前體

毫無(wú)疑問(wèn)，谷氨酸是γ-PGA的直接前體，但D-谷氨酸是否可以成為γ-D-和γ-DL-PGA的底物？正因?yàn)槿绱?，才?huì)出現(xiàn)兩種截然不同的γ-PGA合成機(jī)制假說(shuō)。一項(xiàng)關(guān)于合成含有D-谷氨酸微囊藻毒素的NRPS研究中發(fā)現(xiàn)，由谷氨酸消旋酶生成的D-谷氨酸可以直接進(jìn)入相應(yīng)的氨基酸殘基位點(diǎn)[44]。但在硫模板機(jī)制中，L-到D-的單向異構(gòu)作用是不存在的。

5.1 L-谷氨酸的生物合成

在B.subtilis中，合成代謝和分解代謝均可生成L-谷氨酸。一般而言，一個(gè)L-谷氨酸分子和一個(gè)α-酮戊二酸分子在L-谷氨酰胺合成酶和L-谷氨酸合酶的催化下得到兩分子L-谷氨酸[45]。谷氨酸鹽缺乏時(shí)，α-酮戊二酸和NH4+經(jīng)L-谷氨酸脫氫酶催化生成L-谷氨酸。而L-天冬氨酸和α-酮戊二酸經(jīng)L-天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶生成草酰乙酸和L-谷氨酸。此外，谷氨酸族的外源氨基酸，如L-精氨酸和L-脯氨酸均可異化生成L-谷氨酸[15]。很可能是因?yàn)榘麅?nèi)過(guò)量的L-谷氨酸誘導(dǎo)合成γ-PGA。通過(guò)分析B.subtilis中的外源L-谷氨酸，有助于闡明外源L-谷氨酸依賴型γ-PGA的合成機(jī)制。

5.2 D-谷氨酸的生物合成

研究芽孢桿菌中D-谷氨酸的合成時(shí)，D-氨基酸轉(zhuǎn)氨酶（DAT）和谷氨酸消旋酶（GLR）是非常重要的兩種酶。除此之外，人們更關(guān)注兩種酶活性之間的關(guān)系和γ-PGA的立體結(jié)構(gòu)。一般而言，完全D-或優(yōu)先合成D-的 γ-PGA 產(chǎn)生菌（B.anthracis和 B.licheniformis），其DAT活性較高；γ-DL-PGA產(chǎn)生菌（B.subtilis）具有GLR活性；完全L-或優(yōu)先合成L-的γ-PGA產(chǎn)生菌（B.megaterium和N.aegyptiaca），其D-谷氨酸合成相關(guān)酶的活性較低或不存在[47]。

6 γ-PGA合成酶

若合成的γ-PGA分泌至胞外（分泌型），則相關(guān)基因命名為 pgs（Polyglutamate synthase）；若作為莢膜成分（結(jié)構(gòu)型），其相關(guān)基因命名為 cap（Capsule）[48]。

6.1 分泌型γ-PGA合成酶

Ashiuchi等人對(duì)一株野生型B.subtilis染色體DNA中合成γ-DL-PGA的基因簇進(jìn)行了鑒定，這個(gè)基因簇包含四個(gè)開放閱讀框（ORF），即 pgsB、pgsC、pgsA（或 pgsAA）和 pgsE[38]。

B.subtilis中的 γ-PGA 合成酶（PgsB，Pgs-C，Pgs-A，和Pgs-E）均位于膜上，但是Pgs組分的特點(diǎn)是含有一些可溶解的形式。有人發(fā)現(xiàn)PgsB只有在L-谷氨酸存在時(shí)才會(huì)催化ATP水解，而溶解的PgsBC和PgsBCA可以在D-/L-谷氨酸存在時(shí)水解ATP。到目前為止，已鑒定出來(lái)的所有水溶性的Pgs組分都不是γ-PGA合成酶。它們僅僅是依賴谷氨酸的ATP水解酶或者是特有的酰胺連接酶，可能會(huì)合成非常短的γ-谷氨?；亩巍Ｄ壳?，只有一種位于細(xì)胞膜的γ-PGA合成酶能催化合成高分子量的γ-PGA。

為了進(jìn)一步了解γ-PGA生物合成的分子機(jī)制，應(yīng)該對(duì)γ-PGA合成酶的結(jié)構(gòu)生物學(xué)進(jìn)行研究。下面總結(jié)了每種Pgs組分的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和預(yù)測(cè)的功能。

通常認(rèn)為PgsB是發(fā)揮催化作用的最主要組分[49]，因?yàn)樗囊患?jí)結(jié)構(gòu)跟那些依賴Mg/ATP的水溶性的酰胺連接酶相類似，而酰胺連接酶可以催化短的γ-L-谷?；溞纬梢粋€(gè)葉酸基[50]。

PgsC很有可能是這種酶嵌入膜內(nèi)的一種組分[11]。PgsC與N-乙酰谷氨酸合成酶的N-乙酰轉(zhuǎn)移酶域結(jié)構(gòu)域相似[51]。而ε-聚-L-賴氨酸合成酶在C-末端也有類似于N-乙酰轉(zhuǎn)移酶的三個(gè)串聯(lián)重復(fù)單元，并且所有重復(fù)單元在催化過(guò)程中都發(fā)揮著重要的作用[52]。

PgsA有膜錨定區(qū)域[11]，可以使酶固定在細(xì)胞表面[53]，在很多微生物中都可以找到類似的組分。B.subtilis中的PgsA可能在γ-PGA分泌和（或）含有D-谷氨酸的γ-PGA合成酶的翻譯后修飾中發(fā)揮重要作用。

與Pgs的其他組分相比，PgsE的作用還不完全清楚。不過(guò)有研究結(jié)果顯示，它可能和一種膜相關(guān)的CapE（γ-PGA合成酶結(jié)構(gòu)型）在功能上相同，這種CapE在B.anthracis中以質(zhì)粒為負(fù)載的γ-PGA合成體系內(nèi)是一種主要成分[43]。

6.2 結(jié)構(gòu)型γ-PGA合成酶

B.anthracis的莢膜中含有γ-D-PGA，其為該病原菌毒性的主要成分之一[31]。B.anthracis中包含兩個(gè)質(zhì)粒 pXO1（108 kb）和 pXO2（951 kb）。研究表明，在質(zhì)粒pXO2上鑒定出基因簇狀的三個(gè)ORF，即capB、capC和capA；它們對(duì)消除了質(zhì)粒pXO2的B.anthracis突變體的莢膜恢復(fù)至關(guān)重要，并推斷γ-D-PGA的合成體系是一位于膜上的多酶復(fù)合體[54]。將capBCA克隆到Escherichia coli中，表達(dá)后發(fā)現(xiàn)capB為重疊基因，它能夠編碼兩種蛋白CapB和CapB′，CapBCA以膜結(jié)合蛋白形式存在；另外，在capBCA基因簇下游發(fā)現(xiàn)了編碼γ-D-PGA降解酶的基因dep[46]。

7 結(jié)論與展望

自從γ-PGA發(fā)現(xiàn)以來(lái)已有整整一百年了。盡管現(xiàn)代遺傳學(xué)的發(fā)展有助于闡明γ-PGA的產(chǎn)生機(jī)制，但是酶學(xué)研究仍然處于初期階段。鑒于一些帶有γ-L-/γ-D-谷氨酰胺殘基相對(duì)較小的化合物是通過(guò)酰胺連接形成的，因此可以推測(cè)γ-PGA也是通過(guò)同樣的途徑合成的；另一方面，鏈延伸的過(guò)程在γ-PGA的合成中并不多見(jiàn)，仍需進(jìn)一步闡明γ-PGA生物合成的分子機(jī)制。γ-PGA合成酶的膜關(guān)聯(lián)性是否對(duì)鏈的延伸起著關(guān)鍵作用還有待研究。

塑料和水凝膠因其便利性和經(jīng)濟(jì)性逐漸成為一種現(xiàn)代工業(yè)和日常生活中的必需品，而絕大多數(shù)都來(lái)自于石油化工產(chǎn)品。但是不合理的利用會(huì)對(duì)環(huán)境和健康帶來(lái)負(fù)面影響。因此，當(dāng)今社會(huì)亟需環(huán)境友好型生物可降解大分子材料，從而有助于節(jié)約資源和能源、抑制溫室效應(yīng)、提高糧食產(chǎn)量、實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展。γ-PGA正是這樣一種順應(yīng)潮流的生物高分子材料，希望γ-PGA合成機(jī)制的闡明可以幫助確立一個(gè)有效的γ-PGA生產(chǎn)體系，進(jìn)而被以γ-PGA為原材料的制造業(yè)所采用，來(lái)生產(chǎn)適合未來(lái)生活方式的生態(tài)材料。

[1]Ashiuchi M,Misono H.Biochemistry and molecular genetics of polyγ-glutamate synthesis[J].Applied microbiology and biotechnology,2002,59(1):9-14

[2] 陳詠竹,孫啟玲.γ-多聚谷氨酸的性質(zhì)、發(fā)酵生產(chǎn)及其應(yīng)用[J].微生物學(xué)通報(bào),2004,31(1):122-126

[3] Crescenzi V,D'Alagni M,Dentini M,et al.Aqueous solution properties of bacterial poly-γ-D-glutamate[M].In：Ottenbrite RM,Huang SJ,Park K.(eds)Hydrogels and biodegradable polymers for bioapplications,vol 627.Washington,DC：ACS Symposium Series,1996:233-242

[4] Weman K,Kihlgren M,Fagerberg I.Solution conformation of poly(L-lysyl-L-glutamic acid)and poly(L-lysyl-L-glutamine)[J].International journal of peptide and protein research,1984,24(1):48-54

[5] Kim K S,Kim T K,Graham N B.Controlled release behavior of prodrugs based on the biodegradable pPoly(L-glutamic acid)microspheres[J].Polymer journal,1999,31(10):813-816

[6]Lu Z R,Wang X H,Parker D L,et al.Poly(L-glutamic acid)Gd(III)-DOTA conjugate with a degradable spacer for magnetic resonance imaging[J].Bioconjugate chemistry,2003,14(4):715-719

[7] King E C,Blacker A J,Bugg T D H.Enzymatic breakdown of poly-γ-D-glutamic acid in Bacillus licheniformis：identification of a polyglutamyl γ-hydrolase enzyme[J].Biomacromolecules,2000,1(1):75-83

[8] Birrer G A,Cromwick A M,Gross R A.γ-Poly(glutamic acid)formation by Bacillus licheniformis 9945a：physiological and biochemical studies[J].International journal of biology and macromolecules,1994,16(5):265-275

[9] 楊革,陳堅(jiān),曲音波,等.細(xì)菌聚-γ-谷氨酸溶液流變性能的研究[J].高分子學(xué)報(bào),2002(3):345-348

[10]Goto A,Kunioka M.Biosynthesis and hydrolysis of poly(γ-glutamic acid)from Bacillus subtilis IFO3335[J].Bioscience,biotechnology,and biochemistry,1992,56(7):1031-1035

[11]Ashiuchi M,Misono H.Poly-γ-glutamic acid[M].In：Fahnestock SR,Steinbüchel A.(eds)Biopolymers,vol 7.Weinheim：Wiley,2002：123-174

[12]Choi H J,Kunioka M.Preparation conditions and swelling equilibria of hydrogel prepared by γ-irradiation from microbial poly-γ-glutamic acid[J].Radiation physics and chemistry,1995,46(2):175-179

[13]Taniguchi M,Kato K,Shimauchi A,et al.Proposals for wastewater treatment by applying flocculating activity of cross-linked poly-γglutamic acid[J].Journal of bioscience and bioengineering,2005,99(3):245-251

[14]Yokoigawa K,Sato M,Soda K.Simple improvement in freeze-tolerance of baker′s yeast with poly-γ-glutamate[J].Journal of bioscience and bioengineering,2006,102(3):215-219

[15]Shih I L,Van Y T.The production of poly-(γ-glutamic acid)from microorganisms and its various applications[J].Bioresource technology,2001,79(3):207-225

[16]Yang LC,Wu JB,Ho GH,et al.Effects of poly-γ-glutamic acid on calcium absorption in rat[J].Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2008,72(12):3084-3090

[17]Ikumi Y,Kida T,Sakuma S,et al.Polymer-phloridzin conjugates as an anti-diabetic drug that inhibits glucose absorption through the Na+/glucose cotransporter(SGLT1)in the small intestine[J].Journal of controlled release,2008,125(1):42-49

[18]Dekie L,Toncheve V,Dubruel P,et al.Poly-L-glutamic acid derivatives as vectors for gene therapy[J].Journal of controlled release,2000,65(1-2):187-202

[19]Sekine T,Nakamura T,Shimizu Y,et al.A new type of surgical adhesive made from porcine collagen and polyglutamic acid[J].Journal of biomedical materials research,2001,54(2):305-310

[20]Cheng S W,Shaw J F,Yang K H,et al.Studies of optimum conditions for covalent immobilization of Candida rugosa lipase on poly(γ-glutamic acid)by RSM[J].Bioresource technology,2008,99(8):2800-2805

[21]Ashiuchi M,Kamei T,Baek D H,et al.Isolation of Bacillus subtilis(chungkookjang),a poly-γ-glutamate producer with high genetic competence[J].Applied microbiology and biotechnology,2001,57(5/6):764-769

[22]Ito Y,Tanaka T,Ohmachi T,et al.Glutamic acid independent production of poly(γ-glutamic acid)by Bacillus subtilis TAM-4[J].Bio－science,Biotechnology,and Biochemistry,1996,60(8):1239-1242

[23]Cheng C,Asada Y,Aida T.Production of γ-polyglutamic acid by Bacillus licheniformis A35 under denitrifying conditions[J].Agriculture and biological chemistry,1989,53(9):2369-2375

[24]Kambourova M,Tangney M,Priest FG.Regulation of polyglutamic acid synthesis by glutamate in Bacillus licheniformis and Bacillus subtilis[J].Applied and environmental microbiology,2001,67(2):1004-1007

[25]Kunioka M.Biosynthesis and chemical reactions of poly(amino acid)s from microorganisms[J].Applied microbiology and biotechnology,1997,47(5):469-475

[26]楊革,陳堅(jiān),曲音波,等.金屬離子對(duì)地衣芽孢桿菌合成多聚γ-谷氨酸的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2001,17(6):706-709

[27]張業(yè)偉,魏雪團(tuán),胡中波,等.地衣芽孢桿菌P-104發(fā)酵生產(chǎn)γ-聚谷氨酸條件優(yōu)化[J].過(guò)程工程學(xué)報(bào),2012,12(2):288-292

[28]Pérez-Camero G,Congregado F,Bou JJ,et al.Biosynthesis and ultlasonic degradation of bacterial poly(γ-glutamic acid)[J].Biotechnology and bioengineering,1999,63(1):110-115

[29]Kocianova S,Vuong C,Yao Y,et al.Key role of poly-γ-DL-glutamic acid in immune evasion and virulence of Staphylococcus epidermidis[J].The journal of clinical investigation,2005,115(3):688-694

[30]Thorne C B,Molnar D M.D-Amino acid transamination in bacillus anthracis[J].Journal of bacteriology,1955,70(4):420-426

[31]Keppie J,Harris-Smith PW,Smith H.The chemical basis of the virulence of Bacillus anthracis.IX.Its aggressins and their mode of action[J].British journal of experimental pathology,1963,44：446-453

[32]Aono R.Characterization of structural component of cell walls of alkalophilic strain of Bacillus sp.C-125[J].The biochemical journal,1978,245(2):467-472

[33]Niemetz R,K?rcher U,Kandlera O,et al.The cell wall polymer of the extremely halophilic archaeon,Natronococcus occultus[J].European journal of biochemistry,1997,249(3):905-911

[34]Hezayen F F,Rehm B H A,Tindall B J,et al.Transfer of Natrialba asiatica B1T to Natrialba taiwanensis sp.nov.,a novel extremely halophilic,aerobic,non-pigmented member of the Archaea from E－gypt that produces extracellular poly(glutamic acid)[J].International journal of systematic and evolutionary microbiology,2001,51(3):1133-1142

[35]Shimizu K,Nakamura H,Ashiuchi M.Salt-inducible bionylon polymer from Bacillus megaterium[J].Applied and environmental microbiology,2007,73(7):2378-2379

[36]Weber J.Poly(γ-glutamic acid)s are the major constituents of Nematocysts in Hydra(Hydrozoa,Cnidaria)[J].The journal of biological chemistry,1990,265(17):9664-9669

[37]Gardner J M,Troy F A.Chemistry and biosynthesis of the poly(γ-D-glutamyl)capsule in Bacillus licheniformis[J].The journal of biological chemistry,1973,248(1):305-315

[38]Ashiuchi M,Shimanouchi K,Nakamura H,et al.Enzymatic synthesis of high-molecular-mass poly-γ-glutamate and regulation of its stereochemistry[J].Applied and environmental microbiology,2004,70(7):4249-4255

[39]Urushibata Y,Tokuyama S,Tahara Y.Characterization of the Bacillus subtilis ywsC gene,involved in γ-polyglutamic acid production[J].Journal of bacteriology,2002,184(2):337-343

[40]Terui Y,Iida H,Ono E,et al.Biosynthesis of poly-γ-glutamic acid in plants：Transient expression of poly-γ-glutamate synthetase complex in tobacco leaves[J].Journal of bioscience and bioengineering,2005,100(4):443-448

[41]Candela T,Fouet A.Poly-γ-glutamate in bacteria[J].Molecular microbiology,2006,60(5):1091-1098

[42]Veith B,Herzberg C,Steckel S,et al.The complete genome sequence of Bacillus licheniformis DSM13,an organism with great industrial potential[J].Journal of molecular microbiology and biotechnology,2004,7(4):204-211

[43]Candela T,Fouet A.Bacillus anthracis CapD,belonging to the γ-glutamyltranspeptidase family,is required for the covalent anchoring of capsule to peptidoglycan[J].Molecular microbiology,2005,57(3):717-726

[44]Sielaff H,Dittmann E,De Marsac NT,et al.The mcyF gene of the microcystin biosynthetic gene cluster from Microcystis aeruginosa encodes an aspartate racemase[J].The biochemical journal,2003,373(3):909-916

[45]Belitsky B R,Wray L V Jr,Fisher S H,et al.Role of TnrA in nitrogen source-dependent repression of Bacillus subtilis glutamate synthase gene expression[J].Journal of bacteriology,2000,182(21):5939-5947

[46]Urushibata Y,Tokuyama S,Tahara Y.Difference in transcription levels of cap genes for γ-polyglutamic acid production between Bacillus subtilis IFO16449 and Marburg 168[J].Journal of bioscience and bioengineering,2002,93(2):252-254

[47]Hamano Y.Amino-acid homopolymers occurring in nature[M].In：Steinbüchel A (eds).Microbiology monographs,vol 15.Münster：Springer,2010：77-93

[48]曹名鋒,金映虹,解慧,等.γ-聚谷氨酸的微生物合成、相關(guān)基因及應(yīng)用展望[J].微生物學(xué)通報(bào),2011,38(3):388-395

[49]Kimura K,Tran L S P,Do T H,et al.Expression of the pgsB encoding the poly-γ-DL-glutamate synthetase of Bacillus subtilis(natto)[J].Bioscience,biotechnology,and biochemistry,2009,73(5):1149-1155

[50]Tomosho J W,Moran R G,Coward J K.Concentration-dependent processivity of multiple glutamate ligations catalyzed by folylpolyγ-glutamate synthetase[J].Biochemistry,2008,47(34):9040-9050

[51]Min L,Jin Z,Caldovic L,et al.Mechanism of allosteric inhibition of N-acetyl-L-glutamate synthase by L-arginine[J].The journal of biological chemistry,2009,284(8):4873-4880

[52]Yamanaka K,Maruyama C,Takagi H,et al.ε-Poly-L-lysine dispersity is controlled by a highly unusual nonribosomal peptide synthetase[J].Nature chemical biology,2008,4(12):766-772

[53]Narita J,Okano K,Kitao T,et al.Display of α-amylase on the surface of Lactobacillus casei cells by use of the PgsA anchor protein,and production of lactic acid from starch[J].Applied and environmental microbiology,2006,72(1):269-275

[54]Makino S,Uchida I,Terakado N,et al.Molecular charac-terization and protein analysis of the cap region,which is essential for encapsulation in Bacillus anthracis[J].Journal of bacteriology,1989,171(2):722-730