伊曲康唑?qū)ewis肺癌荷瘤裸鼠惡性胸腔積液生成的抑制作用

王允芬，姚艷雯，劉紅兵，呂鏜烽，袁冬梅，宋勇

0 引言

肺癌在發(fā)病率和死亡人數(shù)方面已躍居全球首位，其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)因其極易發(fā)生淋巴管新生和區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差，5年生存率低于15%［1］。既往多項(xiàng)研究證實(shí)，腫瘤的血管生成在腫瘤形成、生長、浸潤和轉(zhuǎn)移方面起到促進(jìn)的作用［2］。相對于血管，腫瘤淋巴管管腔較粗大、迂曲，腫瘤細(xì)胞較易沿淋巴管道轉(zhuǎn)移。大量腫瘤細(xì)胞聚集在淋巴管內(nèi)易形成團(tuán)塊阻塞管腔，且淋巴管壁脆性高，因而更容易引起管腔破裂，導(dǎo)致淋巴液的滲漏，最終在腫瘤周圍形成淋巴水腫或積液，在胸膜轉(zhuǎn)移瘤附近則形成惡性胸腔積液(malignant pleural effusion，MPE)［3］。

Aftab等［4］的研究表明，抗真菌藥物伊曲康唑具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長作用，通過抑制腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞生長，進(jìn)而阻遏腫瘤的發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移。腫瘤的淋巴管新生與血管類似，但迄今未見有關(guān)伊曲康唑能否抑制淋巴管新生及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)方面報(bào)道。惡性腫瘤的淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與VEGF-C的高表達(dá)有關(guān)。VEGF-C的特異性酪氨酸激酶受體VEGFR-3主要表達(dá)于淋巴管上皮細(xì)胞內(nèi)，VEGF-C通過與VEGFR-3的結(jié)合，誘導(dǎo)瘤內(nèi)和瘤旁淋巴管形成及淋巴管轉(zhuǎn)移［5］。在胸膜轉(zhuǎn)移瘤中，腫瘤細(xì)胞分泌較多的VEGF-C，致使腫瘤淋巴管生成及區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移增多，且新生的淋巴管官腔較脆，較正常淋巴管更易于破裂，導(dǎo)致淋巴液滲漏形成MPE［6］。本實(shí)驗(yàn)擬通過動(dòng)物模型來測定伊曲康唑?qū)β闶笮厍环e液量及VEGF-C濃度的影響，進(jìn)而研究伊曲康唑在體內(nèi)對荷瘤裸鼠MPE抑制作用，為其臨床應(yīng)用于腫瘤MPE治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞及動(dòng)物GFP-LLC細(xì)胞購自美國組織細(xì)胞庫。BALB/c裸鼠雌雄各15只，4～6周齡，體重19～25 g。所有試驗(yàn)裸鼠由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院提供，在SPF級屏障系統(tǒng)中飼養(yǎng)并進(jìn)行試驗(yàn)，許可證編號:SCXK-(軍)2007-004。飼養(yǎng)環(huán)境溫度19～22℃，濕度50%～60%。

1.1.2 試劑及儀器伊曲康唑溶液(楊森公司，比利時(shí))，羥丙基β-環(huán)糊精(奧尼多福公司，南京)，小鼠VEGF-C ELISA試劑盒(R＆D，美國)，西門子SENSATION 16獲取CT掃描圖像，近紅外熒光Xenogen IVIS小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)購自美國Caliper公司。

1.2 方法

1.2.1 MPE裸鼠的建立GFP-LLC細(xì)胞系培養(yǎng)于10%小牛血清的高糖DMEM完全培養(yǎng)基中(100IU/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素)37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，每隔3天傳代1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。以PBS洗滌3次，將GFP-LLC細(xì)胞懸浮于PBS中，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/50 μL。無菌條件下10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小鼠仰臥位大字型固定，消毒胸前區(qū)皮膚，胸前第6肋間近右側(cè)胸骨處做一約3 mm切口。分開皮膚和皮下筋膜，于體視顯微鏡下避開血管及其他組織，經(jīng)肋間隙將腫瘤細(xì)胞懸液注入胸膜腔，建立裸鼠移植瘤模型，進(jìn)行抑制腫瘤生長實(shí)驗(yàn)的觀察［7］。

1.2.2 伊曲康唑?qū)闪雎闶竽[瘤生長的抑制實(shí)驗(yàn)GFP-LLC細(xì)胞注射后第4天開始，動(dòng)物單純隨機(jī)抽樣法分為3組，每組10只，雌雄各半。按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，分別經(jīng)胸膜腔注射25 mg/kg伊曲康唑溶液(H組)、8 mg/kg伊曲康唑溶液(L組)及50 μL 130 mg/mL羥丙基-β-環(huán)糊精溶液(C組)。每3天注射1次，持續(xù)4次。

1.2.3 CT掃描及近紅外活體熒光成像GFP-LLC細(xì)胞接種后第14天，小鼠行胸部CT檢查，觀察胸腔積液形成情況。CT掃描方法:小鼠麻醉后，膠布固定其呈仰臥位，探測器準(zhǔn)直器64×0.6 m，機(jī)架旋轉(zhuǎn)時(shí)間為0.5 s，螺距為1.4，管電壓為120 kVp，參考管電流93 A，將掃描獲得的圖像實(shí)時(shí)傳輸?shù)蕉喙δ軋D像后處理工作站。GFP-LLC細(xì)胞接種后第16天麻醉處死全部實(shí)驗(yàn)小鼠，抽吸全部胸腔積液后進(jìn)行近紅外熒光成像。將小鼠放置近紅外熒光成像儀內(nèi)，觀察臟、壁層胸膜及肺內(nèi)腫瘤生成情況。

1.2.4 荷瘤小鼠MPE定量及VEGF-C濃度測定GFP-LLC細(xì)胞接種后第16天麻醉處死全部裸鼠，用1 mL注射器經(jīng)橫膈下抽取全部胸腔積液，計(jì)量各組胸腔積液平均體積。所有小鼠胸腔積液行ELISA法檢測VEGF-C濃度，胸腔積液離心后細(xì)胞涂片行改良吉姆薩染色，部分腫瘤組織行HE染色，其余腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)甲醛溶液固定保存。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。組間各參數(shù)比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差齊時(shí)用LSD法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，當(dāng)方差不齊時(shí)采用Dunnett T3法進(jìn)行多重比較。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠胸腔積液形成情況GFP-LLC細(xì)胞接種后第14天，各組小鼠行胸部CT檢查C組可見大量胸腔積液，L組也可見明顯胸腔積液，H組可見較少量胸腔積液。EGFP-LLC細(xì)胞接種后第16天處死小鼠后抽取胸腔積液，所有胸腔積液均為血性，靜止后不凝固。H組、L組和C組小鼠平均胸腔積液體積分別為(311.19±27.20)、(445.64±27.75)、(575.76±32.61)μL。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，隨著藥物濃度的增高，伊曲康唑?qū)PE生成的抑制作用愈加明顯，H組小鼠胸腔積液量最少。H組與L組及對照組之間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見圖1、圖2，表1。

圖1 小鼠胸腔積液CT掃描圖及解剖實(shí)物圖Figure 1 Malignant pleural effusion in the mouse models

圖2 各組小鼠胸腔積液量比較Figure 2 Comparison of MPE volume among the three groups of mouse models

表1 各組小鼠胸腔積液體積及胸腔積液中VEGF-C濃度Table 1 Volume of MPE and level of VEGF-C in the mouse models

2.2 胸膜上腫瘤形成鑒定近紅外熒光成像可見小鼠腫瘤廣泛轉(zhuǎn)移，遍及臟、壁層胸膜并累及肺門、縱膈淋巴結(jié)，少數(shù)腫瘤結(jié)節(jié)出現(xiàn)破潰和壞死。相對于肉眼大體觀察，近紅外熒光成像對腫瘤轉(zhuǎn)移灶顯像更加清晰，能夠更準(zhǔn)確的確認(rèn)腫瘤轉(zhuǎn)移病灶。見圖3。

圖3 小鼠解剖后胸腔腫瘤結(jié)節(jié)Figure 3 Tumor foci in the mouse models of MPE

2.3 胸腔積液脫落細(xì)胞學(xué)檢查壁層胸膜上腫瘤組織切片行HE染色，提示胸膜上腫瘤為腺癌。胸腔積液涂片改良型吉姆薩染色，見腺癌細(xì)胞，細(xì)胞核大，染色深。

2.4 ELISA法檢測小鼠胸腔積液VEGF-C濃度取全部小鼠胸腔積液按商品化ELISA試劑盒說明方法檢測VEGF-C濃度，H組、L組、C組胸腔積液VEGF-C濃度分別為(336.87±32.12)、(421.64±15.76)、(493.90±40.93)ng/L。隨著濃度升高，伊曲康唑?qū)PE中VEGF-C的抑制作用逐漸加強(qiáng)，各組間VEGF-C濃度比較，差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。見表1、圖4。

圖4 小鼠胸腔積液中VEGF-C表達(dá)水平Figure 4 Expression of VEGF-C in MPE in the mouse models

3 討論

MPE是腫瘤累及胸膜或發(fā)生胸膜轉(zhuǎn)移所致，是晚期惡性腫瘤常見并發(fā)癥之一，治療難度大、預(yù)后差［8］。MPE引起的胸痛、咳嗽、嚴(yán)重的呼吸困難及其他相關(guān)癥狀，影響患者的生存質(zhì)量［9］。目前MPE的發(fā)病原因及相關(guān)機(jī)制尚未完全明確，缺乏有效的治療手段，臨床常以臨終關(guān)懷或姑息方法治療，故MPE患者生存時(shí)間短、病死率高，其成為了惡性腫瘤治療的瓶頸之一［10-11］。原發(fā)于胸膜或經(jīng)血管、淋巴管轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞進(jìn)入胸膜腔內(nèi)，并分泌VEGF等細(xì)胞因子，促進(jìn)新生血管及淋巴管的形成，并增加腫瘤細(xì)胞周圍組織的通透性，易于胸膜表面腫瘤脈管形成及產(chǎn)生MPE［12］。

淋巴管新生是腫瘤實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移的重要因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，惡性腫瘤的淋巴管新生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與VEGF-C高表達(dá)密切相關(guān)［13-14］。目前VEGF-C作為強(qiáng)勢的促淋巴管生成因子，在腫瘤轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。VEGF-C主要通過與特異性酪氨酸激酶受體VEGFR-3結(jié)合，使其胞內(nèi)酪氨酸發(fā)生自身磷酸化，促發(fā)促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPK)級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞增生、瘤內(nèi)和瘤旁淋巴管形成，并促進(jìn)淋巴管轉(zhuǎn)移［5，14-15］。

伊曲康唑是經(jīng)美國食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的三唑類抗真菌藥物，廣泛應(yīng)用于臨床，不良反應(yīng)較小。研究證明，伊曲康唑在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和體內(nèi)試驗(yàn)均表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞能力，且其抑制血管增生是通過抑制具有重要血管生成作用的固醇類激素的生物合成［4，16］。如上所述，相對于血管，淋巴管在腫瘤晚期MPE的形成過程中發(fā)揮更為重要的作用［17-18］。兩者生成機(jī)制類似，但迄今沒有關(guān)于伊曲康唑是否能夠抑制淋巴管新生或淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移方面的研究。因此通過相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證伊曲康唑抗淋巴生成機(jī)制或找到有力的抑制淋巴生成藥物在MPE的治療中顯得尤為重要。

根據(jù)既往經(jīng)驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)采取胸腔注射的方式來建立胸膜轉(zhuǎn)移瘤及MPE動(dòng)物模型，這為驗(yàn)證藥物對MPE的抑制作用提供了更加直觀的觀察手段。實(shí)驗(yàn)中選擇了GFP-LLC腫瘤細(xì)胞系來建立模型。GFP轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞后，將隨著腫瘤細(xì)胞的分裂、生長而傳給下代，也將隨著腫瘤細(xì)胞的死亡而消亡。本實(shí)驗(yàn)用GFP轉(zhuǎn)染的LLC腫瘤細(xì)胞建立小鼠胸膜轉(zhuǎn)移瘤模型，增加了實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性及有效性。其次，用近紅外熒光顯微鏡手段輔助證實(shí)了荷瘤裸鼠模型的成功建立。在熒光顯微鏡下，臟、壁層胸膜上的腫瘤結(jié)節(jié)發(fā)出熒光，與病理染色結(jié)果具有一致性。這為直接辨認(rèn)實(shí)驗(yàn)小鼠模型的成功建立提供了簡便快捷的手段。

實(shí)驗(yàn)組分別用高、低濃度伊曲康唑及安慰劑注射荷瘤裸鼠胸腔，胸部CT掃描輔助證實(shí)了3組小鼠胸腔積液量的差異。解剖小鼠后經(jīng)縱膈開窗抽吸胸腔積液進(jìn)行精確定量，3組小鼠胸腔積液平均值結(jié)果也顯示高劑量伊曲康唑處理組小鼠胸腔積液量最少，低劑量伊曲康唑組次之，對照組胸腔積液最多。且3組積液量差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，進(jìn)一步證實(shí)伊曲康唑能抑制荷瘤裸鼠MPE的生成。最后，使用ELISA法檢測胸腔積液中VEGF-C的表達(dá)。與之前結(jié)果類似，高劑量伊曲康唑組胸腔積液中VEGF-C濃度最低，對照組濃度最高。各組間差異分別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

VEGF-C是影響淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的重要細(xì)胞因子。通過之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察有理由推測伊曲康唑可能通過抑制VEGF-C的表達(dá)來抑制腫瘤淋巴管生成，最終抑制MPE形成。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要大規(guī)模的臨床試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證。如今，淋巴循環(huán)在MPE形成中的作用逐步受到人們的重視，期待伊曲康唑抗淋巴管生成和抑制胸腔積液生成治療能為腫瘤MPE的治療現(xiàn)狀帶來突破。

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