土壤Cd脅迫對(duì)三七生長(zhǎng)和根系DNA損傷及抗氧化酶活性的影響

朱美霖, 魏富剛, 崔 斌, 陳中堅(jiān), 蔣艷雪, 曹紅斌,①

(1. 北京師范大學(xué): a. 中藥資源保護(hù)與利用北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， b. 資源藥物教育部工程研究中心， 北京100875；2. 苗鄉(xiāng)三七科技有限公司， 云南 文山 663000)

三七〔Panaxnotoginseng(Burk.) F. H. Chen〕隸屬于五加科 (Araliaceae) 人參屬 (PanaxLinn.)，根可入藥，為中國(guó)出口的大宗藥材之一。目前中藥材應(yīng)用領(lǐng)域和出口量日趨擴(kuò)大，但世界各國(guó)對(duì)中藥材質(zhì)量的要求日趨增高，除對(duì)其農(nóng)藥殘留的限制越來越嚴(yán)格外，還增加了Cd、Hg、Pb、Cu和 Cr等重金屬元素的檢測(cè)。中藥三七主要產(chǎn)區(qū)為云南及廣西的富Cd區(qū)[1]，這些地區(qū)擁有大量Cd富集的鉛鋅礦床，有可能造成土壤Cd污染，也可能導(dǎo)致三七藥材中Cd積累。馮江等[2]和韓小麗等[3]的研究結(jié)果均顯示三七藥材中存在Cd含量超標(biāo)的狀況。因此，研究土壤Cd污染對(duì)三七生長(zhǎng)發(fā)育的影響對(duì)保障三七藥材的品質(zhì)有重要意義。目前，已有研究者對(duì)三七植株內(nèi)Cd含量及殘留量進(jìn)行了分析[4-5]；馮光泉等[6]比較了土壤及三七藥材中重金屬的含量；Yan等[7]還研究了三七對(duì)重金屬As的耐性機(jī)制。但至今有關(guān)Cd污染對(duì)三七的毒害效應(yīng)特別是分子水平的毒害效應(yīng)尚未見研究報(bào)道。

Cd是植物生長(zhǎng)的非必需元素，當(dāng)植物體內(nèi)的Cd積累到一定程度時(shí)，植物表現(xiàn)出毒害癥狀。在形態(tài)上主要表現(xiàn)為根和莖生長(zhǎng)遲緩、葉面卷曲和黃葉??；而生理生化方面主要表現(xiàn)為光合作用和蒸騰作用受到抑制、體內(nèi)酶活性受到影響、引起氧化應(yīng)激反應(yīng)和細(xì)胞膜損傷等一系列反應(yīng)[8]，導(dǎo)致抗氧化酶活性產(chǎn)生適應(yīng)性變化。但Cd濃度較低時(shí)反而出現(xiàn)作物產(chǎn)量增加的情況[9-10]，說明低濃度Cd對(duì)某些植物的生長(zhǎng)發(fā)育有一定的促進(jìn)作用。SOD(超氧化物歧化酶)、POD(過氧化物酶)和CAT(過氧化氫酶)是植物體內(nèi)最重要的抗氧化酶，這些酶活性的改變可作為機(jī)體受到氧化脅迫的指標(biāo)。此外，Cd脅迫可不同程度損傷植物細(xì)胞DNA，對(duì)植物的繁衍及子代健康造成傷害，甚至可以改變植物的進(jìn)化過程，目前廣泛采用彗星實(shí)驗(yàn) (Comet assay)、通過對(duì)植物DNA損傷的評(píng)價(jià)確定污染物的毒理學(xué)[11-12]。

作者采用盆栽實(shí)驗(yàn)法，研究了不同程度土壤Cd脅迫對(duì)三七幼苗生長(zhǎng)以及根系保護(hù)酶活性的影響，并采用彗星實(shí)驗(yàn)分析了Cd脅迫對(duì)三七根系細(xì)胞DNA的損傷效應(yīng)，以期在宏觀及微觀水平上揭示土壤Cd污染對(duì)三七生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為三七藥材的標(biāo)準(zhǔn)化種植提供數(shù)據(jù)支撐和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

供試三七種苗由云南文山苗鄉(xiāng)三七科技有限公司提供，栽植于該公司硯山實(shí)驗(yàn)基地。實(shí)驗(yàn)用土取自基地附近0～20 cm的表層土，理化性質(zhì)為：pH 4.94，有機(jī)質(zhì)含量27.40 g·kg-1，陽(yáng)離子交換量19.27 mmol·kg-1，全磷含量0.21 mg·kg-1，速效磷含量117.95 mg·kg-1，粉粒141.9 g·kg-1，粘粒782.9 g·kg-1，砂粒75.1 g·kg-1，土壤Cd本底值0.45 mg·kg-1。

供試主要儀器包括ZM200 Pulverisette 14型高速旋轉(zhuǎn)粉碎機(jī)/儀(德國(guó)Fritsch公司)、PHG-9030A型烘箱(上海精宏設(shè)備有限公司)、ST-60型自動(dòng)消解儀(北京普利泰科儀器有限公司)和SPECTRO ARCOS EOP型ICP-AES(德國(guó)斯派克公司)等；彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒由北京博樂通生物科技有限公司提供，其余試劑均為分析純或優(yōu)級(jí)純。

1.2 方法

1.2.1 脅迫處理 于2012年1月進(jìn)行Cd脅迫處理。用CdCl2·2.5H2O配制Cd處理液。將實(shí)驗(yàn)用土過0.5 cm尼龍篩，稱取適量土壤，將Cd處理液噴灑至土壤中并攪拌均勻，使土壤中Cd添加量分別為0.0(對(duì)照)、 0.1、 0.3、 0.6、 1.0、 3.0、 6.0、 10.0和 30.0 mg·kg-1，土壤中Cd實(shí)際含量為添加量與本底量之和。將各處理土壤分別裝入花盆中，每個(gè)花盆5 kg，每處理設(shè)4次重復(fù)。將生長(zhǎng)健壯且生長(zhǎng)狀況相似的1年生三七種苗移栽至花盆中，每盆栽種3株，統(tǒng)一栽培管理。于2012年10月進(jìn)行生長(zhǎng)狀況觀察并采集根系樣品供酶活性測(cè)定及DNA損傷檢測(cè)。

1.2.2 生長(zhǎng)狀況觀察及生長(zhǎng)量測(cè)定 2012年10月，記錄各處理三七植株的成活率和單株復(fù)葉數(shù)，并測(cè)量植株的株高、葉長(zhǎng)和葉寬(用于單株葉面積計(jì)算)，測(cè)量精度0.1 cm。用普通天平(精度0.01 g)分別稱量三七單株根、莖和葉片的鮮質(zhì)量；將新鮮根、莖和葉置于55 ℃處理72 h，冷卻后分別稱量單株根、莖和葉片干質(zhì)量。

1.2.3 彗星實(shí)驗(yàn) 采集三七成熟植株根系，先將根尖取下，洗凈后于4 ℃保存。取4 ℃保存的根尖，切成適當(dāng)大小，采用機(jī)械法分離細(xì)胞核，使細(xì)胞核懸液密度為每個(gè)視野下20～40個(gè)[13]，按照彗星實(shí)驗(yàn)試劑盒說明進(jìn)行單細(xì)胞凝膠電泳和彗星圖像分析。以彗尾長(zhǎng)、尾部DNA相對(duì)含量(尾部DNA含量與總DNA含量的比值)和Olive尾矩 (尾部DNA含量與尾長(zhǎng)的乘積) 作為彗星實(shí)驗(yàn)定量分析指標(biāo)。

1.2.4 抗氧化酶活性測(cè)定 將去除根尖后的剩余根系洗凈，4 ℃保存。取0.2 g根系樣品置于預(yù)冷研缽中，加入預(yù)冷的50 mmol·L-1磷酸緩沖液 (pH 7.8)1.6 mL， 冰浴研磨至勻漿， 于4 ℃、 12 000g離心20 min，取上清液用于酶活性測(cè)定。參照文獻(xiàn)[14]，采用氮藍(lán)四唑光化還原法測(cè)定SOD活性，采用愈創(chuàng)木酚法測(cè)定POD活性，采用過氧化氫法測(cè)定 CAT活性。

1.3 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果和分析

2.1 土壤Cd脅迫對(duì)三七生長(zhǎng)的影響

不同程度土壤Cd脅迫對(duì)三七植株成活率、株高、單株復(fù)葉數(shù)和單株葉面積的影響見表1；不同程度土壤Cd脅迫對(duì)三七單株根、莖和葉片鮮質(zhì)量及干質(zhì)量的影響見表2；在不同程度土壤Cd脅迫條件下種植10個(gè)月后三七植株的形態(tài)見圖1。

表1 土壤Cd脅迫對(duì)三七植株4個(gè)生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

表1結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，隨土壤Cd添加量的增加，三七植株的成活率、株高、單株復(fù)葉數(shù)和單株葉面積均呈先升高后下降的變化趨勢(shì)。在Cd脅迫條件下三七植株的成活率均高于對(duì)照，且在Cd添加量0.6、1.0和3.0 mg·kg-1條件下植株成活率較高(均超過80%)，顯著高于對(duì)照(P<0.05)，而其余處理組的成活率均與對(duì)照無(wú)顯著差異。在Cd添加量0.1～6.0 mg·kg-1條件下株高均高于對(duì)照，而在Cd添加量10.0和30.0 mg·kg-1條件下株高則均低于對(duì)照；其中，在Cd添加量0.3 mg·kg-1條件下株高最大(23.19 cm)且顯著高于對(duì)照(P<0.05)，其余處理組的株高與對(duì)照均無(wú)顯著差異。各處理組的單株復(fù)葉數(shù)均多于對(duì)照，其中Cd添加量3.0 mg·kg-1處理組的單株復(fù)葉數(shù)最多(5.01片)；在Cd添加量0.1、0.3、1.0和3.0 mg·kg-1條件下單株復(fù)葉數(shù)顯著多于對(duì)照(P<0.05)，其余處理組的單株復(fù)葉數(shù)與對(duì)照差異不顯著。在Cd添加量0.1～3.0 mg·kg-1條件下三七植株的單株葉面積均高于對(duì)照、而在Cd添加量6.0、10.0和30.0 mg·kg-1條件下單株葉面積則低于對(duì)照，但各處理組的單株葉面積與對(duì)照均無(wú)顯著差異；其中，在Cd添加量0.3 mg·kg-1條件下單株葉面積最大，達(dá)到16.39 cm2。

表2 土壤Cd脅迫對(duì)三七單株不同器官質(zhì)量的影響

1-9: 土壤Cd添加量分別為 0.0(對(duì)照)、0.1、0.3、0.6、1.0、3.0、6.0、10.0和30.0 mg·kg-1 Adding amount of Cd in soil is 0.0 (CK), 0.1, 0.3,0.6, 1.0, 3.0, 6.0, 10.0 and 30.0 mg·kg-1, respectively.

表2結(jié)果顯示：隨土壤Cd添加量的增加，三七單株根、莖和葉的鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均呈波動(dòng)但總體上先升高后下降的變化趨勢(shì)。三七單株根鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、單株莖鮮質(zhì)量和干質(zhì)量、單株葉鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的最大值分別出現(xiàn)在土壤Cd添加量0.3、1.0和1.0 mg·kg-1處理組, 其中僅單株根鮮質(zhì)量和單株葉干質(zhì)量的最大值與對(duì)照有顯著差異(P<0.05)，其余處理組的各項(xiàng)指標(biāo)均與對(duì)照無(wú)顯著差異。在土壤Cd添加量30 mg·kg-1條件下，單株根、莖和葉的鮮質(zhì)量及干質(zhì)量均小于對(duì)照但差異不顯著。

從上述生長(zhǎng)指標(biāo)可見：在土壤Cd水平較低的條件下，三七的各項(xiàng)生長(zhǎng)指標(biāo)均高于對(duì)照，表明低水平Cd處理對(duì)三七生長(zhǎng)有促進(jìn)作用。從不同處理組植株的形態(tài)(圖1)也可看出這一結(jié)果。

2.2 土壤Cd脅迫對(duì)三七根系DNA損傷的分析

在不同程度土壤Cd脅迫條件下種植10個(gè)月后三七根尖細(xì)胞DNA的彗星圖像見圖2；對(duì)照組與各處理組根尖細(xì)胞DNA損傷參數(shù)見表3。

由圖2可以看出：沒有受損的三七根尖細(xì)胞DNA呈現(xiàn)出圓形的熒光核心，而受損的DNA則出現(xiàn)彗星狀拖尾。由表3可以看出：不同程度土壤Cd脅迫條件下三七根尖細(xì)胞DNA的損傷程度有一定差異，但各指標(biāo)與對(duì)照均無(wú)顯著差異。其中，彗尾長(zhǎng)以1.0和6.0 mg·kg-1Cd處理組最長(zhǎng)，平均值分別達(dá)到0.24和0.23 μm；10.0和30.0 mg·kg-1Cd處理組彗尾也較長(zhǎng)，平均值分別達(dá)到0.18和0.19 μm，均明顯高于對(duì)照(0.15 μm)。尾部DNA相對(duì)含量以6.0和10.0 mg·kg-1Cd處理組最高，平均值分別為14.16%和15.05%，均明顯高于對(duì)照(12.98%)。Olive尾矩以6.0、 10.0和30.0 mg·kg-1Cd處理組最大，平均值分別為0.45、0.34和0.33，均明顯高于對(duì)照(0.12)。說明在土壤Cd添加量較高的條件下(6.0、10.0和30.0 mg·kg-1Cd)，Cd對(duì)三七根尖細(xì)胞的DNA損傷較為嚴(yán)重。

1-9: 土壤Cd添加量分別為 0.0(對(duì)照)、0.1、0.3、0.6、1.0、3.0、6.0、10.0和30.0 mg·kg-1 Adding amount of Cd in soil is 0.0 (CK), 0.1, 0.3,0.6, 1.0, 3.0, 6.0, 10.0 and 30.0 mg·kg-1, respectively.

表3 土壤Cd脅迫條件下三七根尖細(xì)胞DNA損傷參數(shù)比較

2.3 土壤Cd脅迫對(duì)三七根系抗氧化酶活性的影響

經(jīng)不同程度土壤Cd脅迫處理后三七根系SOD、POD和CAT活性的變化見表4。結(jié)果表明：隨Cd添加量的提高，三七根系中SOD、POD和CAT活性均有明顯變化，但變化趨勢(shì)有差異。SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降、然后再緩慢上升再下降的波動(dòng)趨勢(shì)，其中0.3 mg·kg-1Cd處理組的SOD活性顯著(P<0.05)高于對(duì)照，而0.6、1.0、3.0和30.0 mg·kg-1Cd處理組的SOD活性極顯著(P<0.01)或顯著(P<0.05)低于對(duì)照。POD活性總體上隨土壤Cd添加量的提高逐漸升高，僅0.1 mg·kg-1Cd處理組的POD活性低于對(duì)照，其余處理組的POD活性均高于對(duì)照；其中，1.0、3.0、6.0、10.0和30.0 mg·kg-1Cd處理組的POD活性與對(duì)照有極顯著差異(P<0.01)，以10.0 mg·kg-1Cd處理組的POD活性最高。CAT活性的變化趨勢(shì)也呈先上升后略有下降、再上升再下降的波動(dòng)趨勢(shì)，各處理組的CAT活性均高于對(duì)照，其中，1.0、3.0、6.0、10.0和30.0 mg·kg-1處理組的CAT活性與對(duì)照有極顯著差異(P<0.01)，以6.0 mg·kg-1處理組的CAT活性最高。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在 Cd添加量較低的條件下，三七根系中SOD、POD和CAT活性有所提高，但Cd添加量超過一定限制值，則抗氧化酶活性受到抑制。不同酶的Cd限制值不同，三七根系中SOD、POD和CAT活性的Cd限制值分別為0.3、10.0和6.0 mg·kg-1。

表4 土壤Cd脅迫對(duì)三七根系中SOD、 POD和CAT活性的影響

3 討論和結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：Cd對(duì)三七生長(zhǎng)的抑制作用不是簡(jiǎn)單的毒害作用，而是在低濃度條件下促進(jìn)其生長(zhǎng)、在高濃度條件下抑制三七生長(zhǎng)，而在其他植物中也有類似現(xiàn)象[15-18]。低濃度Cd脅迫能促進(jìn)植物生長(zhǎng)，其原因是低濃度Cd可提高或加速根系的某些生理生化反應(yīng)，從而促進(jìn)根系生長(zhǎng)[19]；也有研究者[20]認(rèn)為低濃度Cd脅迫對(duì)根毛生長(zhǎng)有一定的促進(jìn)作用，從而增強(qiáng)植物對(duì)Cd的耐性。但根系的這種作用因植物種類不同而異。

通過彗星實(shí)驗(yàn)研究Cd脅迫條件下三七根尖DNA損傷，但通過肉眼觀察并不能從各處理組的彗星圖像中發(fā)現(xiàn)明顯的拖尾現(xiàn)象，而且雖然某些Cd處理組的DNA損傷參數(shù)較高，但與對(duì)照無(wú)顯著差異。分析其原因可能為：其一，其他研究者[21-22]是用Cd鹽溶液直接處理植物組織，而本研究采用的脅迫方法是將Cd鹽加入土壤中進(jìn)行脅迫處理，由于土壤的緩沖性能[23-24]使Cd毒性明顯減弱。其次，本研究采用機(jī)械法分離三七根尖細(xì)胞核，細(xì)胞核的分離效果可能不佳，從而影響彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，有待利用其他方法(如酶解法)進(jìn)行進(jìn)一步研究。第三，一些植物組織中含有某些特殊的化學(xué)成分，這些成分會(huì)增加凝膠的粘性進(jìn)而阻礙DNA在電場(chǎng)中的遷移[25]，但三七根尖中是否含有這類成分則需進(jìn)一步研究。此外，不同植物種類及不同器官間彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也存在很大差異，如在Cd脅迫條件下，洋蔥(AlliumcepaLinn.)[26]、蠶豆(ViciafabaLinn.)[22]及豌豆(PisumsativumLinn.)[27]的DNA損傷程度不同，而且Cd對(duì)豌豆根部DNA的損傷遠(yuǎn)大于其對(duì)葉片DNA的損傷[27]。這些因素均對(duì)彗星實(shí)驗(yàn)的結(jié)果有影響。

SOD、POD和CAT是清除植物體內(nèi)活性氧的抗氧化酶，在逆境條件下通過抗氧化酶降低體內(nèi)活性氧的積累，從而減輕逆境因子對(duì)機(jī)體的傷害。在Cd脅迫條件下，抗氧化酶活性也有類似的適應(yīng)性作用，且這種作用與Cd脅迫水平有關(guān)[28-29]。本研究中，三七根系的SOD和CAT活性隨Cd添加量的提高呈波動(dòng)的變化趨勢(shì)，在其他植物種類中也有類似現(xiàn)象。如Cd脅迫條件下狹葉香蒲(TyphaangustifoliaLinn.)葉片中SOD和POD活性隨Cd濃度提高呈低濃度時(shí)上升、高濃度時(shí)下降的變化趨勢(shì)[30]；Al脅迫條件下小麥(TriticumaestivumLinn.)的SOD、CAT和POD活性隨脅迫強(qiáng)度的增加而升高,重度脅迫下會(huì)有所下降[31]。其原因可能是：在低濃度脅迫條件下，植物體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)受到誘導(dǎo)，其活性增強(qiáng)以清除過量的活性氧；而當(dāng)脅迫水平持續(xù)增加時(shí)，植物體內(nèi)的活性氧積累超過了抗氧化酶的清除能力，使植物細(xì)胞及組織功能受到影響，進(jìn)而導(dǎo)致抗氧化酶活性降低[32]?？寡趸富钚缘淖兓侵参飳?duì)Cd脅迫的耐性機(jī)制之一。而Yan等[7]的研究結(jié)果顯示：隨As脅迫水平的增加，三七的SOD和POD活性顯著增加、CAT活性降低。這一結(jié)果與三七根系抗氧化酶活性對(duì)Cd脅迫的響應(yīng)不同，說明三七對(duì)不同重金屬脅迫的耐性不一致。

研究結(jié)果表明：較低水平的土壤Cd脅迫具有促進(jìn)三七生長(zhǎng)的作用、而較高水平的土壤Cd脅迫可抑制三七生長(zhǎng)；Cd脅迫對(duì)三七根尖細(xì)胞DNA沒有明顯的損傷，但可導(dǎo)致三七根系SOD、POD和CAT活性不同程度變化。因此，對(duì)藥材三七種植而言，不能僅僅依據(jù)Cd對(duì)三七生長(zhǎng)的影響確立其土壤Cd安全濃度限值，還需要考慮Cd在三七藥材中的富集狀況和富集程度。有關(guān)三七藥材中Cd的積累和富集機(jī)制則有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。

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