免疫學技術(shù)在食品過敏原檢測中的應(yīng)用

胡驍飛，王 耀，鄧瑞廣，張改平,3,*

免疫學技術(shù)在食品過敏原檢測中的應(yīng)用

胡驍飛1，王 耀2，鄧瑞廣1，張改平1,3,*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院動物免疫學重點實驗室，河南 鄭州 450002；2.西北農(nóng)林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100；3.河南農(nóng)業(yè)大學牧醫(yī)工程學院，河南 鄭州 450002）

食品過敏原可引起機體產(chǎn)生過敏反應(yīng)，嚴重危害人類健康及生命安全。目前食品包裝上過敏原信息標注規(guī)范尚不完善，因此食品過敏原檢測技術(shù)對于預(yù)防含有過敏原食品進入流通領(lǐng)域，減少過敏事件發(fā)生至關(guān)重要。本文綜述了免疫學檢測技術(shù)在食品過敏原檢測中應(yīng)用，并展望了其未來的發(fā)展趨勢。

食品過敏原；免疫學技術(shù)；檢測

民以食為天，食以安為先。食品安全與人民的身心健康和生命安危密切相關(guān)。隨著食品生產(chǎn)的集中化和機械化，以及新技術(shù)的廣泛使用，食品安全問題在過去的十幾年間不斷涌現(xiàn)，世界各地均有嚴重的食品安全事件爆發(fā)。食品安全已成為世界性的話題，同時各國政府和消費者對食品安全問題也給予了空前的關(guān)注。食品安全問題種類眾多，除了近幾年關(guān)注較多的違禁添加、農(nóng)藥殘留、獸藥殘留、重金屬殘留、霉菌毒素污染及致病性病原微生物污染等問題之外，食品自身所含的一些致敏性物質(zhì)引起的食物過敏也是一種較為嚴重的食品安全問題，嚴重危害著過敏人群的身體健康。目前食物過敏的流行已經(jīng)成為食品行業(yè)的巨大挑戰(zhàn)。世界衛(wèi)生組織將過敏癥定為全球排名第四的慢性疾病，食物過敏作為過敏癥中重要的一種，已成為一個世界性的健康問題，并且逐漸成為大家關(guān)注的焦點。為了防止食品過敏原對過敏人群產(chǎn)生的健康危害，避免消費者出現(xiàn)食物過敏反應(yīng)，對食品中所含的過敏原進行定性定量檢測至關(guān)重要。在過敏原的檢測和分析過程中免疫學技術(shù)扮演著十分重要的角色，本文對免疫學技術(shù)在食品過敏原檢測中的應(yīng)用進行了介紹，并對以后的發(fā)展方向進行了探討。

1 食物過敏概述

食物過敏是機體對于食物或食物成分的免疫異常反應(yīng)，免疫系統(tǒng)的參與使其區(qū)別于其他類型的食物敏感。引起機體發(fā)生食物過敏的成分稱為食品過敏原。根據(jù)Gell等[1]的分類，大多數(shù)食物過敏屬于由IgE介導的速發(fā)型超敏反應(yīng)（Ⅰ型超敏反應(yīng)）[2]，其免疫機制包括致敏和發(fā)敏兩個階段，易感個體對于一定量的過敏原誘導可產(chǎn)生大量的IgE抗體，IgE抗體進入血液循環(huán)，并迅速與肥大細胞、嗜堿性粒細胞膜表面的Fc受體結(jié)合，成為這些細胞表面的過敏原特異性受體，從而使機體處于致敏狀態(tài)。當機體再次接觸含相同或相似過敏原成分的食品時，過敏原特異性識別致敏細胞膜表面的IgE，誘導細胞脫顆粒釋放血管活性胺（如組胺）和其他炎癥介質(zhì)而觸發(fā)食物過敏反應(yīng)。

食物過敏反應(yīng)會對人體造成不同程度的危害。研究表明，對于高度敏感的人群，攝入微量的過敏原就可以引發(fā)機體的消化系統(tǒng)病癥（如嘔吐、腹瀉等）、呼吸病癥（如鼻炎、哮喘等）、循環(huán)系統(tǒng)病癥（如水腫、低血壓等）和皮膚病癥（如蕁麻疹、過敏性皮炎、濕疹等）等局部反應(yīng)；對某些個體，特定的食品過敏原甚至可以引起 致命的全身反應(yīng)（如過敏性休克）[3-4]。目前已有160多種食物可以引起過敏反應(yīng)，其中，牛奶、雞蛋、花生、小麥、大豆、堅果、魚類和貝類8種食物所引起的過敏反應(yīng)占到了所有食物過敏的90%以上[5]。據(jù)統(tǒng)計，這8種食物導致美國兒童發(fā)生過敏反應(yīng)的概率分別約為2.5%、1.3%、0.8%、0.4%、0.4%、0.1%、0.2%和0.1%[6]。近些 年，因食物過敏出現(xiàn)危及生命的反應(yīng)呈增加趨勢，食物過敏在世界范圍內(nèi)已成為一個重要的健康問題[7]。在西方國家，約有8%的兒童和2%的成人會發(fā)生食物過敏[7-8]；在我國，杭州市 區(qū)0～3歲兒童食物過敏率為4.85%[9]，攀枝花市0～3歲兒童食物過敏率為7.58%[10]，中國醫(yī)科大學統(tǒng)計15～24歲年齡段健康人群中約有6%的人存在食物過敏[11]。

食品安全性是食品質(zhì)量最重要的組成部分，而食物過敏嚴重危害食品安全性，已引起了各國食品安全監(jiān)督管理部門的重視。目前，嚴格對食品過敏原進行標注已成為一種重要的發(fā)展趨勢，一些發(fā)達國家為保護食物過敏人群，專門立法規(guī)定食品包裝上要標注食物過敏原，我國在2012年實施的食品安全國家標準GB 7718—2011《預(yù)包裝食品標簽通則》中也推薦食品包裝上標注致敏物質(zhì)。但隨著食品加工業(yè)的飛速發(fā)展，食品多樣化凸顯，深加工和精加工食物過敏成分的標注措施仍不完善，使食物過敏患者難以選擇。因此，針對食品過 敏原的檢測技術(shù)對預(yù)防食品過敏意義重大，而快速、簡便的免疫學檢測技術(shù)對預(yù)防食品過敏尤為重要。

2 食品過敏原的免疫學檢測技術(shù)

食品過敏原多為蛋白質(zhì)，具有緊湊的三維結(jié)構(gòu)、配位鍵、二硫鍵以及糖基化，這些結(jié)構(gòu)特點都使其在酸、堿、加工等處理時保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[12]。而且，食品原料成分較多，其中存在的食品過敏原含量相對于其他原料往往很低，這些因素增加了快速、準確、定量檢測過敏原的難度。

免疫學檢測技術(shù)是基于抗原抗體特異性反應(yīng)建立的檢測技術(shù)。該技術(shù)具有靈敏性高、特異性強的特點，能夠快速、準確對抗原物質(zhì)進行定性定量檢測，并且不需要復雜的程序和價格高昂的儀器，因此，在食品安全檢測領(lǐng)域得以廣泛應(yīng)用，并衍生出多種檢測方法。

2.1 免疫印跡（immunoblotting）

免疫印跡在過敏原的檢測中應(yīng)用較早，并且廣泛應(yīng)用于發(fā)現(xiàn)和鑒定新的過敏原[13]。該法又稱為蛋白質(zhì)印跡（western blotting），是將十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）和固相免疫測定技術(shù)相結(jié)合。其原理是首先將樣品在進行單向或雙向凝膠電泳，抗原蛋白根據(jù)其分子質(zhì)量大小分離，然后將分離的蛋白在電場力的作用下轉(zhuǎn)移到固定化基質(zhì)膜上，最后利用放射物質(zhì)或者酶標記的抗體對膜進行檢測和分析。Gagnon等[14]將免疫印跡和質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，用大豆過敏患者的血清檢測出了19種大豆過敏原，包括5種新過敏原。Satoh等[15]將轉(zhuǎn)基因大米和非轉(zhuǎn)基因大米中提取的蛋白進行了單向和雙向電泳，并進行免疫印跡分析，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因并沒有改變大米中原有的過敏原，也沒有產(chǎn)生新的過敏原。雖然免疫印跡具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的特異性和敏感性，但目前該方法僅可用于過敏原的定性或半定量檢測。

2.2 火箭免疫電泳（rocket immuno-electrophoresis，RIE）

RIE的特點是使用含有抗體的凝膠進行過敏原的檢測，被檢測的過敏原根據(jù)自身的電泳遷移率移動直到形成抗原抗體復合物在凝膠中沉淀，電泳圖片中顯示的火箭形狀的高度與被檢測的過敏原的量成正比。Yman等[16]在分析食品中的蛋白質(zhì)時利用了該方法，驗證是否含有過敏原或過敏原標示錯誤。Holzhauser等[17]利用花生蛋白的抗血清進行RIE，在兩種沒有標明花生成分的食品中檢測出了花生蛋白。但該方法在過敏原的檢測中并沒有得到廣泛應(yīng)用，主要由于含抗體凝膠的制備比較繁瑣，而且染色過程較為復雜。

2.3 斑點免疫印跡（dot immunoblotting）

斑點免疫印跡的原理是首先將提取的蛋白樣品點在硝酸纖維素或者聚偏二氟乙烯膜上，然后用酶標抗體孵育，最后加入底物反應(yīng)顯色后形成有色的可視斑點，斑點的強度與過敏原的含量成正比。其中酶標抗體也可以用放射性物質(zhì)標記抗體代替，最后用射線照相進行分析。Blais等[18]將滌綸布作為樣品膜，用該方法檢測了多種食品中的花生蛋白，部分陽性樣品中花生蛋白的含量小于1mg/L。雖然該方法是一種操作簡單而且廉價的檢測方法，但仍只適用于食品中過敏原的半定量檢測。

2.4 放射/酶聯(lián)過敏原吸附抑制實驗（r adi oallergosorbent/enzyme-allergosorbent inhibition test，RAST/ EAST Inhibition）

RAST和EAST通常用于食物過敏的臨床診斷，而RAST/EAST抑制實驗已被應(yīng)用于過敏原的定性檢測以及食物中潛在過敏原的評估[19-20]。該方法的原理是首先將能與人體特異的IgE抗體結(jié)合的過敏原固定在固相載體上，然后加入被測樣品，樣品溶液中的過敏原會抑制固相載體上的過敏原與IgE結(jié)合，最后加入用放射性物質(zhì)或酶標記 的抗IgE抗體，再加入發(fā)光或顯色的底物，用射線計數(shù)器或分光光度計來檢測結(jié)合的IgE，從而間接的檢測樣品中的過敏原。Herian等[21]利用RAST抑制實驗定性檢測了多種大豆制品（豆芽、豆豉、豆腐、豆醬、醬油等）的過敏原性，結(jié)果表明這些大豆制品都會對大豆過敏人群造成潛在的危害。Fremont等[22]利用RAST抑制實驗證明了嬰兒食用的谷物面粉中添加的乳糖成分中含有1～5μg/g的過敏原α-乳白蛋白，表明需要對食品過敏原信息進行詳細標注，以降低潛在的食物過敏風險。Paschke等[23]利用EAST抑制實驗檢測比較了精煉大豆油、非精煉大豆油和大豆卵磷脂的過敏原性，結(jié)果顯示可能是由于精煉過程中的熱處理，消除了精煉大豆油的過敏原性。由于RAST/EAST抑制實驗依賴于合適的過敏人群血清并且很難建立標準的檢測方法，所以該方法在食品過敏原定量檢測中的應(yīng)用有一定的局限[24]。

2.5 酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

目前，ELISA方法是實驗室、食品企業(yè)以及食品監(jiān)管機構(gòu)檢測食品中過敏原最常用的方法[25]。該方法主要是基于抗原或抗體的固相化以及抗原或抗體的酶標記，固相化的抗原或抗體可以保持其免疫學活性，酶標記物在保持其免疫學活性的基礎(chǔ)上也保留了酶的活性。常用于食品中過敏原定量檢測的ELISA方法主要有競爭ELISA（competitive ELISA）和夾心ELISA（sandwich ELISA）兩種。競爭ELISA是將過敏原固定在微孔板上，與樣品中的過敏原競爭結(jié)合特異抗體；而夾心ELISA基于食品過敏原具有多抗原決定簇的特點，先將過敏原的一種特異抗體固定在微孔板上，與樣品中的過敏原結(jié)合后，然后加入另一種酶標記的特異抗體與過敏原結(jié)合。這兩種方法均具有實用性強、特異性高、敏感性強等優(yōu)點。

Ecker等[26]利用兔多抗和雞多抗建立了夾心ELISA方法檢測餅干和面條中的羽扇豆蛋白，該方法準確性高、特異性好，在不同基質(zhì)中檢測限為0.4～2.3mg/kg。Ma Xi等[27]在獲得大豆球蛋白單克隆抗體的基礎(chǔ)上建立了競爭ELISA檢測方法，該方法的半數(shù)抑制濃度（IC50）為1.7μg/L，檢測限為0.3μg/L。Hei Wenjing等[28]用鼠源單克隆抗體作為包被抗體，用兔源多克隆抗體作為二抗建立了檢測β-伴大豆球蛋白的夾心ELISA方法，該方法的檢測限為1.63μg/L，線性范圍為3～100μg/L。

目前，市場上已經(jīng)有一些商品化的ELISA檢測試劑盒，專門用于檢測食品中的過敏原，可在1～2 h內(nèi)對過敏原進行定性和定量檢測[29]。雖然ELISA方法有諸多優(yōu)點，但有時因為食品基質(zhì)干擾，也會對檢測結(jié)果造成影響。

2.6 側(cè)流免疫層析法（lateral-flow immunochromatography assay，LFA）

LFA是20世紀50年代形成的一種技術(shù)[30]，它的基礎(chǔ)是乳膠凝集實驗。近年來，LFA已發(fā)展成為一種重要的檢測方法，結(jié)合膠體金標記技術(shù)及其他標記技術(shù)，這種方法已被開發(fā)出多種多樣的商業(yè)化的檢測試紙條。其原理是將抗原或抗體固定于NC膜檢測區(qū)域，然后通過毛細管作用，使樣品沿著該膜向前移動，當移動至檢測區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗體或抗原就會在此區(qū)域發(fā)生特異性結(jié)合，若用膠體金標記可使檢測區(qū)域顯示顏色，從而進行特異性的免疫檢測。Koizumi等[31]制備并驗證了一種膠體金免疫層析試紙條，用于檢測加工食品中的甲殼類動物蛋白質(zhì)，該方法靈敏度高，檢測蝦蛋白的目測檢測限為25μg/L。類似膠體金的其他納米顆粒也可以應(yīng)用于LFA的標記材料，例如Zheng等[32]將超順磁納米顆粒與單克隆抗體偶聯(lián)，研制了一種能夠定量檢測魚主要過敏原小白蛋白的免疫層析試紙，該試紙的檢測線性范圍為0.01～100mg/L。側(cè)流免疫層析法的檢測時間比其他免疫學方法大大縮短，可在數(shù)分鐘內(nèi)得到實驗結(jié)果，該方法還具有便攜、經(jīng)濟的特點，而且操作簡單，不需要任何儀器，可以實現(xiàn)現(xiàn)場實時檢測，因而在食品安全監(jiān)控領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。但該方法多為半定量檢測，仍有進一步發(fā)展的空間。

2.7 時間分辨熒光免疫法（time-resolved fluoreimmuo assay，TRFIA）

TRFIA是20世紀80年代迅速發(fā)展起來的一種公認的最有發(fā)展前途的非放射免疫標記技術(shù)。TRFIA是用具有特殊熒光的鑭系離子與螯合劑結(jié)合作為示蹤物標記蛋白質(zhì)、多肽、激素、抗體等，在一定的反應(yīng)體系（如抗原抗體免疫反應(yīng)、生物素親和素反應(yīng)、核酸探針雜交反應(yīng)、靶細胞與效應(yīng)細胞的殺傷反應(yīng)等）發(fā)生反應(yīng)后，用時間分辨熒光儀測定產(chǎn)物中的特異熒光強度，推測反應(yīng)體系中分析物的濃度，從而達到對待測物質(zhì)進行定量分析的目的[33]。Faeste等[34]用銪的螯合物的熒光特性來提高信噪比，建立了TR FIA方法來檢測食品中的榛子蛋白，該方法檢測限可以達到0.1mg/kg。TRFIA技術(shù)具有靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好、測定范圍寬、試劑壽命長、操作簡便和非放射性等特點，但需要儀器進行熒光強度測定。

2.8 免疫傳感器檢測技術(shù)

免疫傳感器檢測技術(shù)是通過實時監(jiān)測識別元件表面的抗原抗體反應(yīng)，將傳統(tǒng)的免疫測試結(jié)果通過傳感器轉(zhuǎn)換為精密的數(shù)字輸出，從而達到分析和檢定量測的目的[35]。表面等離子體共振（surface plasmon resonance，SPR）傳感器是目前的一個研究熱點，其原理是將配體分子預(yù)先固定在金屬表面上，待分析樣品通過樣品通道與配體特異性結(jié)合形成復合物，當被分析物與配體分子結(jié)合后，共振峰的位置會發(fā)生位移，該位移的大小將反映固定在金屬表面的物質(zhì)的量，進而監(jiān)測分子間相互作用，這樣就達到了實時監(jiān)控配體與待分析物的吸附和解吸完整的反應(yīng)過程[36]。Pollet等[37]利用光纖SPR傳感器快速準確地檢測花生過敏原，該傳感器利用磁性納米顆粒增強了傳感信號，將檢測限提高到了 0.09g/mL。Billakanti等[38]應(yīng)用SPR傳感器對加工和未加工過的牛乳樣品中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、牛血清白蛋白、乳鐵蛋白和IgG 5種蛋白質(zhì)進行了檢測，平均含量分別是0.8、4.0、0.21、0.12mg/mL和0.48mg/mL，結(jié)果與液相色譜和ELISA檢測結(jié)果相一致。免 疫傳感器技術(shù)具有快速、高靈敏和高特異等優(yōu)點，未來可將其與微陣列相結(jié)合，高通量地對過敏原進行定量分析。

3 結(jié) 語

綜上所述，隨著人們對食品安全的重視，新型快速的食品過敏原檢測技術(shù)必將成為研究熱點，而免疫學檢測技術(shù)則成為其中的重點。免疫印跡、火箭免疫電泳、斑點免疫印跡和放射/酶聯(lián)過敏原吸附抑制實驗4種方法由于操作繁瑣、不能準確定量、依賴過敏人群血清等自身的局限因素，未能在食品過敏原檢測方面得到長足的發(fā)展，但仍可作為輔助的檢測方法。目前，國內(nèi)外應(yīng)用較為廣泛的主要是酶聯(lián)免疫吸附實驗、側(cè)流免疫層析法、時間分辨熒光免疫法和免疫傳感器檢測等方法。但這些方法也存在一些亟需解決的問題：一方面由于食品過敏原種類較多，檢測過程中可能會發(fā)生交叉反應(yīng)；另一方面，現(xiàn)有方法可能會存在基質(zhì)干擾，影響檢測結(jié)果。因此需要針對單一過敏原制備出敏感性高、特異性強的抗體。同時還需要研究建立即簡單便捷，又能減小基質(zhì)干擾的樣品處理新技術(shù)，以增加檢測的靈敏度和準確性。

隨著貿(mào)易全球化的發(fā)展，不同國家和地域的食品也會相互流通，過敏人群接觸食品過敏原的種類和機會也大大增加。為有效避免食品過敏原對過敏人群造成的食品安全隱患，除了在食品包裝上對食品過敏原進行嚴格標注，為過敏人群提供警示信息之外，將免疫學檢測技術(shù)與其他方法相結(jié)合，研發(fā)出高通量、高靈敏、高特異、經(jīng)濟快速、簡便的食品過敏原檢測方法也勢在必行。

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Application of Immunological Techniques in Detection of Food Allergens: A Review

HU Xiao-fei1, WANG Yao2, DENG Rui-guang1, ZHANG Gai-ping1,3,*
(1. Key Laboratory of Animal Immunology, Henan Academy of Agricultural Sciences, Zhengzhou 450002, China; 2. College of Food Science and Engineering, Northwest A & F University, Yangling 712100, China; 3. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou 450002, China)

The allergic reactions caused by food allergens are threatening human health and life. Currently, allergy information on the packaging of food products is imperfect. Thus, development of technologies to detect food allergens is critical to prevent all ergy-causing foods from entering into circulation and to reduce the occurrence of allergic incidents. This review summarizes recent applications of immunological technologies in the detection of food allergens, and discusses future prospects in this field.

food allergens; immunological techniques; detection

R392.8

A

1002-6630（2014）08-0001-05

10.7506/spkx1002-6630-201408001

2014-03-30

河南省基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計劃項目（132300413222）

胡驍飛（1972—），男，副研究員，博士，研究方向為食品安全檢測技術(shù)。E-mail：huxf1972@126.com

*通信作者：張改平（1960—），男，中國工程院院士，教授，博士，研究方向為動物病毒分子致病機制和食品安全檢測。E-mail：zhanggaiping2003@163.com