缺鋅玉米植株的傅立葉變換紅外光譜研究

王盛鋒, 劉云霞, 高麗麗, 韓 亞, 黃金生,Hilman, 劉榮樂(lè), 汪 洪*

(1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)資源與農(nóng)業(yè)區(qū)劃研究所， 農(nóng)業(yè)部植物營(yíng)養(yǎng)與肥料重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室， 北京 100081;2 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院， 北京 100081)

鋅是植物必需的微量元素，對(duì)植物體內(nèi)碳水化合物、 蛋白質(zhì)、 生長(zhǎng)素等物質(zhì)代謝以及生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用[1-2]。世界上缺鋅土壤面積約占30%[3]，甚至可能高達(dá)50%[4]。據(jù)1997年公布的全國(guó)土壤普查數(shù)據(jù)，我國(guó)缺鋅土壤面積約有0.63億公頃，占當(dāng)時(shí)耕地總面積45.7%。Yang等[5]和Zou等[6]估計(jì)我國(guó)缺鋅土壤面積約在40%以上。北方石灰性土壤上，作物缺鋅尤為普遍[7]。玉米對(duì)缺鋅敏感，缺鋅時(shí)常表現(xiàn)為莖節(jié)間縮短、 新葉失綠黃化，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)壞死性斑點(diǎn)[1-2]。

傅里葉變換紅外光譜(fourier transform infrared spectroscopy, FTIR)是一種基于化合物中官能團(tuán)和極性鍵振動(dòng)的結(jié)構(gòu)分析技術(shù)，F(xiàn)TIR技術(shù)可對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量分析，具有靈敏度高，制樣方法簡(jiǎn)單，樣品用量少，測(cè)試時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)[8]。植物體內(nèi)生物大分子如核酸，脂類和碳水化合物，具有特征性的官能團(tuán)和獨(dú)特的分子振動(dòng)模式(振動(dòng)的指紋)[9]。通過(guò)分析紅外光譜吸收位置、 寬度和強(qiáng)度，有助于了解植物體內(nèi)有機(jī)物分子官能團(tuán)的組成和結(jié)構(gòu)特征[10-11]。歐全宏等[12]利用FTIR研究水稻稻瘟病葉、 玉米和蠶豆銹病葉，發(fā)現(xiàn)主要由多糖、 蛋白質(zhì)的振動(dòng)吸收譜帶組成，葉片中主要成分糖類、 蛋白質(zhì)和脂類化合物在正常葉片和感病葉片之間存在明顯差異。Shi[13]研究發(fā)現(xiàn)玉米銹病發(fā)病葉和正常葉片的FTIR圖譜在酰胺I和II吸收帶上差異明顯，認(rèn)為病程相關(guān)蛋白在抵抗病原體侵染中起著重要作用。薛生國(guó)等[14]進(jìn)行了紫茉莉?qū)︺U脅迫生理響應(yīng)的FTIR 研究，結(jié)果表明， 根組織在3420、 2920、 1610和1060 cm-1等處峰高隨鉛處理濃度表現(xiàn)為先上升后下降趨勢(shì)，說(shuō)明低鉛處理下植株體內(nèi)蛋白質(zhì)、 氨基酸、 糖類、 羧酸等含量較高，但隨鉛處理濃度增加，植株體內(nèi)有機(jī)物含量逐漸下降； 葉組織在1650 cm-1處峰高隨鉛處理濃度升高而升高，這可能與紫茉莉葉中蛋白質(zhì)和氨基酸等物質(zhì)含量升高有關(guān)。

利用FTIR研究缺鋅脅迫下植物體內(nèi)化學(xué)組分的變化，尚未見(jiàn)到有關(guān)文獻(xiàn)。本試驗(yàn)選擇農(nóng)大108和鄭單958兩個(gè)玉米品種為供試作物，進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，研究缺鋅脅迫下玉米幼苗生長(zhǎng)和鋅吸收，利用FTIR對(duì)玉米植株不同器官的化學(xué)組成進(jìn)行研究，以期為缺鋅影響玉米生長(zhǎng)與生理代謝的機(jī)理研究提供參考。

1 材料與方法

選取農(nóng)大108和鄭單958兩個(gè)玉米品種，飽滿一致的玉米種子經(jīng)10% H2O2表面消毒15 min，去離子水洗凈，浸泡12 h后，轉(zhuǎn)移到鋪有濕濾紙的培養(yǎng)皿中，上蓋一層濕紗布，25℃黑暗中催芽1天。選擇發(fā)芽一致的種子播于洗凈的石英砂中，室溫下育苗。7天后(兩葉一心)，選擇長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗，去掉胚乳，移栽到500 mL玻璃培養(yǎng)管中進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)液培養(yǎng)，每管1株。玻璃培養(yǎng)管直徑為5 cm，高20 cm，外用黑色塑料布包裹遮光。

基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)液配方為(mol/L): Ca(NO3)22.0×10-3、 K2SO47.5×10-4、 MgSO46.5×10-4、 KH2PO42.5×10-4、 EDTA-Fe(Ⅱ)1.0×10-4、 H3BO31.0×10-6、 MnSO41.0×10-6、 CuSO41.0×10-7、 (NH4)6Mo7O245.0×10-9。設(shè)置缺鋅(0 μmol/L)和正常供鋅(1 μmol/L)兩個(gè)處理，代號(hào)分別為-Zn 和+Zn。鋅以ZnSO4形式供給，每個(gè)處理4次重復(fù)。營(yíng)養(yǎng)液pH用NaOH或HCl調(diào)到6.2，每隔兩天換一次營(yíng)養(yǎng)液。幼苗培養(yǎng)在人工氣候箱進(jìn)行，控制條件光照時(shí)間 12 h，光照強(qiáng)度24000 lx，晝夜溫度為25℃/20℃，相對(duì)濕度70%。

營(yíng)養(yǎng)液處理20天后，玉米缺鋅癥狀明顯表現(xiàn)為生長(zhǎng)矮小、 節(jié)間縮短、 葉片黃化。將地上部和根系分開(kāi)，用直尺測(cè)量長(zhǎng)度，獲得株高和根長(zhǎng)； 植株樣品經(jīng)105℃殺青1 h，再在80℃下烘干至恒重，測(cè)干重。烘干至恒重的植株樣品用HNO3-HClO4(3 ∶1)消煮，原子吸收分光光度計(jì)(型號(hào)WFX-120C，北京瑞利分析儀器公司)測(cè)定消煮液中鋅濃度，計(jì)算植株中鋅含量和鋅積累量。收獲玉米根系放入FAA固定液(70%酒精 ∶38%甲醛 ∶乙酸體積比=90 ∶5 ∶5)中，利用掃描儀(EsponV 700)掃描根系樣品獲取數(shù)字化圖像，利用用WinRHIZO根系分析軟件(Regent Instruments Inc., Canada)對(duì)圖像進(jìn)行分析，獲得根長(zhǎng)、 根面積、 根體積等指標(biāo)。

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差統(tǒng)計(jì)分析(ANOVA)，采用Duncan新復(fù)極差方法檢驗(yàn)不同處理之間數(shù)據(jù)的差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物量和鋅含量

缺鋅嚴(yán)重影響玉米的生長(zhǎng)，植株生長(zhǎng)矮小，節(jié)間縮短，株高下降，新葉基部出現(xiàn)黃化后白化，并出現(xiàn)壞死性褐色斑點(diǎn)。

表1結(jié)果表明，施鋅增加地上部干重，而缺鋅導(dǎo)致地上部干物質(zhì)重降低，鋅營(yíng)養(yǎng)對(duì)地上部影響顯著，而對(duì)根系生物量影響不明顯。缺鋅時(shí)根冠比增大，兩個(gè)品種比較，缺鋅條件下農(nóng)大108具有更大根冠比。不施鋅玉米植株地上部和根系中鋅含量明顯降低。根系鋅含量高于地上部鋅含量。

缺鋅與施鋅地上部生物量比值: 農(nóng)大108為0.45，小于鄭單958(0.64)，缺鋅脅迫下農(nóng)大108生物量下降較鄭單958多。

表1 缺鋅和施鋅處理下玉米生物量和鋅含量

2.2 根系形態(tài)

與供鋅處理相比，缺鋅明顯降低了農(nóng)大108根系長(zhǎng)、 根面積、 根體積； 鄭單958根系各項(xiàng)指標(biāo)在缺鋅和供鋅處理之間差異不顯著(表2)。

表2 缺鋅和施鋅處理下玉米根系形態(tài)

2.3 FTIR譜圖分析

2.3.1 根 FTIR譜分析 圖1可以看出，缺鋅和施鋅處理根系紅外光譜的特征峰位置基本相同，但透過(guò)率有差異。缺鋅根系紅外光譜在3410、 2920、 1650、 1380、 1055 cm-1附近透過(guò)率較低。

3410 cm-1是自由羥基的伸縮振動(dòng)峰，主要來(lái)自于多糖、 纖維素、 半纖維素等碳水化合物[15]； 1055 cm-1是C-O-C伸縮振動(dòng)，來(lái)源于多糖類[16-18]，缺鋅條件下兩處透過(guò)率的升高表明根系碳水化合物的減少。

兩品種比較， 農(nóng)大108根系在缺鋅和加鋅處理間1540、 1380、 1240 cm-1附近透過(guò)率的差異大于鄭單958根系，表明農(nóng)大108根系中蛋白質(zhì)、 核酸受缺鋅影響更大。

圖1 缺鋅和施鋅處理下農(nóng)大108和鄭單958根FTIR譜圖Fig.1 FTIR spectra of roots of maize cultivars, Nongda108 and Zhengdan 958, with and without zinc application

2.3.2 莖FTIR譜分析 圖2表明缺鋅和供鋅處理莖的紅外光譜特征峰對(duì)應(yīng)的波數(shù)基本相同，缺鋅農(nóng)大108莖的紅外光譜在3410、 2920、 1655、 1380、 1240和1055 cm-1附近透過(guò)率降低，表明碳水化合物、 脂類、 蛋白質(zhì)和核酸含量升高。缺鋅下鄭單958莖的紅外光譜在3410、 2920、 1655、 1380 cm-1附近透過(guò)率降低，表明碳水化合物、 脂類、 蛋白質(zhì)含量升高。兩品種比較，農(nóng)大108在3420、 1655、 1380、 1240、 1055 cm-1附近透過(guò)率差異較大，鄭單958在1240和1055 cm-1透過(guò)率基本相同。

缺鋅農(nóng)大108莖中碳水化合物、 脂類、 蛋白質(zhì)含量增加較多，鄭單958莖中核酸和多糖含量受到影響較小。

圖2 缺鋅和施鋅處理下農(nóng)大108和鄭單958莖FTIR譜圖Fig.2 FTIR spectra of stems of maize cultivars, Nongda108 and Zhengdan 958, with and without zinc application

2.3.3 葉片F(xiàn)TIR譜分析 從圖3可以看出， 與正常供鋅處理相比，兩個(gè)品種缺鋅條件下葉片F(xiàn)TIR譜在3420與2920 cm-1處透過(guò)率升高，糖類、 纖維素類碳水化合物、 脂類等物質(zhì)含量下降。

農(nóng)大108葉片F(xiàn)TIR譜中1655、 1380、 1240和1050 cm-1處透過(guò)率升高，蛋白質(zhì)、 核酸和多糖含量下降。鄭單958缺鋅葉片紅外圖譜中1380 cm-1透過(guò)率下降，主要是蛋白質(zhì)中甲基和亞甲基C-H彎曲振動(dòng)和羧基中C-O彎曲振動(dòng)減少，蛋白含量受到一定影響，而1650、 1240、 1055 cm-1附近與加鋅處理相比無(wú)明顯變化，酰胺I帶蛋白含量和多糖含量受鋅影響較小。

圖3 缺鋅和施鋅處理下農(nóng)大108和鄭單958葉片F(xiàn)TIR譜圖Fig.3 FTIR spectra of leaves of maize cultivars, Nongda108 and Zhengdan 958, with and without zinc application

3 討論與結(jié)論

將缺鋅和正常供鋅水平下生物產(chǎn)量的比值定義為玉米鋅效率系數(shù)，若該系數(shù)較低，作物對(duì)缺鋅相對(duì)敏感[24-25]。本試驗(yàn)中供試的兩玉米品種比較，缺鋅條件下，農(nóng)大108地上部干物質(zhì)積累較少，缺鋅和施鋅處理下地上部生物量比值明顯較鄭單958小，根冠比較大，農(nóng)大108比鄭單958可能對(duì)缺鋅更為敏感。

根系形態(tài)的差異可能會(huì)影響植物對(duì)鋅吸收利用[26]，Dong 等[27]研究發(fā)現(xiàn)缺鋅條件下小麥鋅高效品種細(xì)根長(zhǎng)度增加，所占比例增多。水稻上的研究也發(fā)現(xiàn)在中度缺鋅時(shí)根系長(zhǎng)度、 根面積和根尖數(shù)增加，且鋅高效品種增加更多[28]。本研究發(fā)現(xiàn)缺鋅培養(yǎng)20天的玉米品種農(nóng)大108根系生長(zhǎng)受抑，根長(zhǎng)、 根面積和根體積下降，而鄭單958根系形態(tài)變化尚不明顯。缺鋅時(shí)鄭單958具有較大根表面積和根體積，細(xì)根較多，可能是其對(duì)缺鋅不敏感的一個(gè)重要原因。

FTIR方法測(cè)定分子吸收光譜，由分子振動(dòng)或轉(zhuǎn)動(dòng)引起偶極矩的凈變化產(chǎn)生，從而可以鑒定化合物和分子結(jié)構(gòu)，紅外光譜具有“指紋”特征，可對(duì)植物所含化學(xué)物質(zhì)提供鑒別[8]。薛生國(guó)等[14]和歐全宏等[12]研究發(fā)現(xiàn)植物FTIR譜圖的特征峰集中在3420、 2920、 1610和1060 cm-1附近，認(rèn)為主要由多糖、 脂類、 蛋白質(zhì)的振動(dòng)吸收譜帶組成。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)玉米根、 莖、 葉FTIR譜圖特征峰集中在3410、 2920、 1650、 1380、 1055和 1240 cm-1附近，推斷主要由碳水化合物、 脂類和蛋白質(zhì)中基團(tuán)的振動(dòng)組成，透射率的高低可近似代表特征物質(zhì)含量。

本研究發(fā)現(xiàn)缺鋅處理根系和葉片F(xiàn)TIR圖譜中3410和1055 cm-1透過(guò)率較高，莖FTIR圖譜中此波數(shù)附近透過(guò)率較低，表明缺鋅時(shí)碳水化合物在玉米葉片和根系中含量下降，而在莖中可能有所積累。鋅是碳酸酐酶和1,5-二磷酸核酮糖羧化酶的組成成分[29-30]，缺鋅時(shí)光合作用下降，碳水化合物代謝受到影響。缺鋅菜豆植株中淀粉、 淀粉合成酶活性以及淀粉粒數(shù)下降[31]，甜菜和玉米中蔗糖合成酶活性降低，蔗糖含量下降[32]。也有報(bào)道表明缺鋅時(shí)菜豆葉片中蔗糖和淀粉含量升高，但根系中碳水化合物的濃度降低，對(duì)此的解釋是缺鋅可能抑制源葉向外運(yùn)輸[33]。植物莖中碳水化合物含量升高可能是由于生長(zhǎng)受阻引起的濃度效應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)缺鋅處理根系和葉片F(xiàn)TIR圖譜中1650和1380 cm-1透過(guò)率及1240 cm-1處透過(guò)率較高，表明缺鋅時(shí)蛋白質(zhì)及核酸在玉米葉片和根系中含量下降。李佐同等[34]報(bào)道低鋅處理降低玉米葉片可溶性蛋白質(zhì)含量。缺鋅植物體內(nèi)RNase活性升高，導(dǎo)致RNA降解，含量降低，缺鋅時(shí)核糖體變形、 減少[1,29]。另外鋅是RNA聚合酶的必要組分[35]，該酶保護(hù)核糖RNA免受核糖核酸酶的攻擊而降解，缺鋅時(shí)該酶活性明顯下降。另外轉(zhuǎn)錄因子鋅指蛋白中含有鋅，鋅指蛋白與特定的靶DNA或靶蛋白結(jié)合負(fù)責(zé)調(diào)控基因的表達(dá)，影響蛋白質(zhì)合成，缺鋅可能降低鋅指蛋白含量。

綜上所述，缺鋅條件下玉米根系和葉片F(xiàn)TIR譜在波數(shù)3410、 2920、 1650、 1380、 1055 cm-1附近處透過(guò)率較高，莖FTIR譜在這些波數(shù)處透過(guò)率較低，表明缺鋅導(dǎo)致根系和葉片中碳水化合物、 脂類、 蛋白質(zhì)及核酸含量下降，而在莖中有所積累。玉米品種農(nóng)大108植株中各組分變化受缺鋅影響較鄭單958大。本文結(jié)果表明， 利用FTIR技術(shù)可揭示缺鋅脅迫玉米植株中組分變化。

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