植物體內西羅血紅素的研究進展

刁清清, 毛碧增

(浙江大學農業(yè)與生物技術學院，浙江杭州 310058)

生物界中廣泛存在四吡咯(tetrapyrrole)類化合物，主要分為兩類： 一類是卟啉類分子(porphyrins)[1]，包括血紅素和葉綠素; 另一類是卟吩烷類分子(porphinoids)，包括西羅血紅素、 血紅素d1、 鉆銨素(維生素B12的核心結構)和F430因子等[2]。四吡咯類化合物及其金屬衍生物具有多種生物功能，可以參與生物體內的光合作用、 氧氣的運輸和其它多種氧化還原反應。

植物主要以硝酸鹽和硫酸鹽的形式吸收氮元素和硫元素，但是這兩種氧化態(tài)的離子均不能被直接利用，而要經過還原酶的作用，轉化成銨態(tài)氮和含硫氨基酸后才能被生物體同化利用。西羅血紅素是最簡單的功能型四吡咯分子，在其卟啉結構的核心螯合一個Fe2+，因此能夠催化一個六電子的轉移反應，分別將亞硝酸鹽和亞硫酸鹽還原成生理形態(tài)為銨態(tài)氮和含硫氨基酸兩類物質[3]。與其它卟啉類輔基的合成過程相同，西羅血紅素的合成同樣需要經過轉甲基、 氧化脫氫以及螯合作用三個步驟，不同的是螯合的金屬離子為Fe2+。本文主要介紹生物體西羅血紅素的合成過程及其在生物體內的相關生化反應和重要作用。

1 西羅血紅素的合成

1.1 合成西羅血紅素的關鍵酶和前體物

1.1.1 關鍵酶 西羅血紅素的合成由眾多酶參與其中，這些酶行使各種催化功能，其中比較重要的幾種酶有膽色素原脫氨酶(porphobilinogen-deaminase，PBGD)、 尿卟啉原Ⅲ甲基化酶(uroporphyrinogen Ⅲ methyltransferase，UPM)、 前咕啉-2氧化酶、 西羅葉綠三酸鐵螯合酶。

膽色素原脫氨酶是生物體內參與四吡咯化合物生物合成過程的關鍵酶之一，它催化四個膽色素原(PBG)單吡咯體依次連接組成線形的四吡咯化合物： 羥甲基膽素。羥甲基膽素在尿卟啉原III合成酶的催化下環(huán)合形成所有天然四吡咯化合物的共同前體—尿卟啉原Ⅲ。

UPM需要S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl-Lmethionine，SAM)作為甲基供體。SAM是細胞中除ATP外第二個廣泛存在的高能分子，它參與多種催化反應，大部分情況下作為甲基供體; 從能量轉換角度來講，它比另一個甲基供體—葉酸的催化效率更高。甲基化反應后，SAM轉化為S-腺苷高絲氨酸(S-adenosyl-L-homoserine，SAH)。

前咕啉-2氧化酶是依賴于NADP的酶，其功能是催化前咕啉-2脫氫生成西羅葉綠三酸。釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中，Met8p編碼蛋白具有前咕啉-2氧化酶和西羅葉綠三酸鐵螯合酶功能[4]。枯草桿菌(Bacillussubfilis)和巨大芽孢桿菌(Bacillusmegaterium)的前咕啉-2氧化酶分別由ylnF和sirC編碼[5]。

生物體內行使功能的卟啉分子都是金屬卟啉，因此螯合酶具有重要作用。螯合酶均具專一性，分別催化一種金屬離子的螯合反應。目前發(fā)現(xiàn)的金屬螯合酶分為三大類： 第一類需ATP，如葉綠素的鎂螯合酶，輔酶F430的鎳螯合酶; 第二類是血紅素鐵螯合酶HemH; 第三類是西羅血紅素的鐵螯合酶和鈷銨素生物合成的CbiX。

1.1.2 重要的前體物質 5-氨基酮戊酸(5-aminolevulinic acid，ALA)是有機體中兩大重要色素葉綠素和亞鐵血紅素的共同合成前體，在植物體內作為葉綠素合成的一個部分很早就受到重視。近年來研究人員發(fā)現(xiàn)，它除了與植物光合作用有關外，高濃度的ALA可作為無污染的除草劑在農業(yè)生產中應用; 低濃度的ALA具有調節(jié)植物生長發(fā)育的功能，被看作是一種新型的植物生長調節(jié)物質，而其具有植物生長調節(jié)劑的作用是因為ALA能促進硫酸鹽的吸收，同時促進半胱氨酸和谷胱甘肽的合成[6]。

尿卟啉Ⅲ是尿卟啉原Ⅲ的非酶氧化產物，是一類對光敏感的化合物，它的積累很可能會導致光損傷，同時增加活性氧(reactive oxygen species，ROS)在質體和細胞中的積累。高等植物中，四吡咯的合成途徑是由血紅素通過谷氨酸-tRNA還原酶(Hem A)的代謝負反饋調節(jié)的[7-8]。Hem-A位于UPM的上游，負責合成ALA。UPM促使尿卟啉原Ⅲ甲基化，然后調控ALA以合成西羅血紅素。這種反饋調節(jié)方式的優(yōu)點是： 當光敏物質不用于合成西羅血紅素、 葉綠素或血紅素時，不會在葉綠體中積累。

一個復雜的調控系統(tǒng)需足量的底物支撐，所以西羅血紅素的合成控制途徑可能會引起尿卟啉原Ⅲ的積累。尿卟啉原Ⅲ氧化生成具有高光敏性的尿卟啉Ⅲ，這會引起以四吡咯為媒介的光敏反應而產生ROS[9-10]。ROS的積累會提高生物自清潔系統(tǒng)的活力并且可能改變細胞的氧化還原狀態(tài)。當細胞中代謝和氧化還原態(tài)發(fā)生較大的改變時，與脅迫和防御有關的基因被激活。因所有和修復系統(tǒng)有關的酶是由核基因編碼的，擾亂質體中四吡咯的生物合成途徑和ROS的生成可能會影響從質體到細胞核逆行信號的轉導[11]。

1.2 合成西羅血紅素的前期物質準備

高等植物中，四吡咯類化合物的合成發(fā)生在質體中[12-13]，其起始反應為谷氨酸-tRNA在Hem-A的催化作用下生成谷氨酸-1-半醛，然后經分子間的轉氨作用生成ALA; 最后，ALA在ALA脫水酶、 PBGD和尿卟啉原Ⅲ合成酶的作用下合成尿卟啉原Ⅲ，尿卟啉原Ⅲ是該系列反應的第一個大環(huán)中間物[14-15]。ALA脫水酶的作用是結合兩分子的ALA并脫去一分子水合成膽色素原，然后四分子膽色素原在膽色素原脫氨酶和尿卟啉原Ⅲ合成酶的作用下形成尿卟啉原Ⅲ。接下來的反應進入一個分支點，如果尿卟啉原Ⅲ進行甲基化反應，最后會合成西羅血紅素; 如果是由尿卟啉原Ⅲ脫羧酶催化，最后形成葉綠素和血紅素[16](圖1)。

圖1 合成西羅血紅素的前期物質反應Fig.1 The reaction of the prophase in the synthetic process of siroheme

1.3 西羅血紅素合成的途徑

由尿卟啉原Ⅲ生成西羅血紅素需經過三步酶促反應： 甲基化、 氧化脫氫和鐵螯合。催化的酶分別是尿卟啉原Ⅲ甲基化酶、 前咕啉-2氧化酶和西羅葉綠三酸鐵螯合酶。尿卟啉原Ⅲ甲基化酶催化尿卟啉原Ⅲ發(fā)生兩步甲基化反應，第一步形成前咕啉-1，第二步形成前咕啉-2，然后前咕啉-2經過氧化脫氫反應生成西羅葉綠三酸，最后西羅葉綠三酸與鐵螯合生成西羅血紅素(圖2)。不同的生物中，與該系列反應相關的酶有很大的區(qū)別。

由尿卟啉原Ⅲ生成西羅血紅素需經過三步酶促反應： 甲基化、 氧化脫氫和鐵螯合。催化的酶分別是尿卟啉原Ⅲ甲基化酶、 前咕啉-2氧化酶和西羅葉綠三酸鐵螯合酶。尿卟啉原Ⅲ甲基化酶催化尿卟啉原Ⅲ發(fā)生兩步甲基化反應，第一步形成前咕啉-1，第二步形成前咕啉-2，然后前咕啉-2經過氧化脫氫反應生成西羅葉綠三酸，最后西羅葉綠三酸與鐵螯合生成西羅血紅素(圖2)。不同的生物中，與該系列反應相關的酶有很大的區(qū)別。

圖2 不同生物體中由尿卟啉原Ⅲ合成西羅血紅素的酶促反應(改編自Baishnab和Rena[17])Fig.2 The enzymatic reaction from uroporphyrinogen Ⅲ to siroheme in different organisms (adapted from Baishnab and Rena[17])

在擬南芥中，甲基化反應是由UPM催化的，然后前咕啉-2脫氫產生西羅葉綠三酸，最后鐵在西羅葉綠三酸鐵螯合酶(sirohydrochlorin ferrochelatase，SirB)的催化作用下螯合到四吡咯環(huán)的內部，形成西羅血紅素。高等植物中與氧化脫氫反應相關的酶和基因目前還沒有報道。同時，不僅是NiR和SiR具有鐵硫中心，SirB也以鐵硫中心為輔基[18]。在酵母中，甲基化反應是由Met1p催化的，但是該酶與植物中的UPM并無同源性。最后兩步反應是由一個雙功能酶Met8p催化[19]，該酶的同一個活性位點具有氧化和螯合雙重功能，同樣，該酶在高等植物中也沒有直系同源。一些細菌中，生成西羅血紅素的反應是由兩個獨立的酶SirC和SirB催化的[20]。SirC催化前咕啉-2的氧化脫氫反應，SirB的作用是把亞鐵提供給西羅葉綠三酸，最后合成西羅血紅素。值得一提的是，一種存在于細菌S.entericaserovaryphimurium和Escherichiacoli內的大小約為59 kDa的同源二聚體酶亞基CysG能夠催化所有的反應[21]。

一些與進化相關的螯合酶會把一些離子螯合到四吡咯的骨架中[22]。高等植物和細菌中，SirB的許多蛋白序列與細菌中的鈷鰲合酶(CbiX)密切相關[23]。該酶負責把Co2+螯合到西羅葉綠三酸上，同時在維生素B12的合成也起重要作用。一般情況下，CbiX在碳端有一段富含組氨酸的區(qū)域，該區(qū)域在金屬離子的轉運和貯存方面具有重要作用，同時也可能含有一個鐵硫中心，這在大量細菌中都有發(fā)現(xiàn); 該亞基還含有一個獨立蛋白，可能是亞鐵和鈷螯合酶的初始物。高等植物中，SirB是由核基因編碼的，其基因來源于原核生物，該基因通過內共生，由原生質體基因轉變?yōu)楹嘶?，從而成為真核細胞的一部分?/p>

2 與西羅血紅素相關的重要代謝途徑

2.1 重要的硫元素和氮元素代謝

植物從土壤中吸收的含硫物質主要是硫酸鹽，但是硫酸鹽進入植物后不能被直接利用，而需經過一系列的反應整合到半胱氨酸和甲硫氨酸上才能被植物利用。硫酸鹽進入植物之后的系列反應為： 首先，硫酸鹽在硫酸鹽還原酶的作用下還原為亞硫酸鹽，該反應發(fā)生在質體中，是由SiR催化的六電子轉移反應; 然后還原態(tài)的硫被整合到半胱氨酸和甲硫氨酸上，最后含硫氨基酸被分配到細胞中的各個部位，用來進一步合成蛋白質或含硫化合物，如氧化還原活性肽和金屬硫蛋白。與硫同化相關的許多酶都要經過轉錄，轉錄后和翻譯三個環(huán)節(jié)調控，同時這些酶的活性還會受到控制及反饋調節(jié)[24]。

植物中大多數(shù)還原態(tài)的氮元素是由硝酸鹽還原得來，但是與根瘤菌共生的豆科植物可以通過根瘤直接從空氣中固氮。植物依靠載體從根部吸收硝酸鹽，硝酸鹽進入細胞質，在硝酸鹽還原酶的作用下還原為亞硝酸鹽; 然后在質體中，亞硝酸鹽進一步由NiR催化發(fā)生六電子轉移生成氨基酸。在與光反應有關的細胞器中，亞硝酸還原所需的電子是由鐵氧還蛋白提供的，鐵氧還蛋白位于光反應的電子傳遞鏈上。除了西羅血紅素，SiR、 NiR也含鐵并把鐵硫中心作為輔基，這表明細胞內鐵元素在硫酸鹽和硝酸鹽的同化吸收過程有重要的作用。

研究表明，在擬南芥中，轉錄因子SLIM1在初級和次級硫代謝中是主要的轉錄調控子[25]。另外，進一步的觀察發(fā)現(xiàn)SLIM1在印度梨形孢和擬南芥有益互作中是必需化合物。在酵母雙雜交體系中，SLIM1與MYB72形成二聚體，MYB72是擬南芥誘導系統(tǒng)抗性(ISR)必備轉錄子[26-27]。如果這在植物體內適用，SLIM1則直接參與植物與微生物的互作[28]; 在十字花科植物中，硫代謝是由有益菌調控的，主要原因如下： 首先，提供足量的硫元素能夠促進植物的形態(tài)建成; 其次，在寄主植物存在有益微生物的情況下，能夠增強依賴硫元素的防御機制的抗病能力，達到穩(wěn)產目的。

2.2 氧化還原反應調節(jié)

細胞最重要的機制是維持谷胱甘肽氧化還原平衡，以達到維持細胞內部氧化還原狀態(tài)的穩(wěn)定[29]。谷胱甘肽是植物抗逆反應和抗氧化損傷的重要物質。谷胱甘肽的生物合成分兩步，皆不需要ATP： 第一步為谷氨酰半胱氨酸合成酶催化半胱氨酸和谷氨酸生成γ-谷氨酰半胱氨酸，此反應為整個反應過程中的限制性反應; 第二步為γ-谷氨酰半胱氨酸和甘氨酸在谷胱甘肽合成酶的作用下生成谷胱甘肽。還原型谷胱甘肽是細胞內諸多反應的底物，反應后形成氧化型谷胱甘肽。氧化型谷胱甘肽是由二硫鍵橋接兩分子谷胱甘肽分子形成的。細胞主要是在轉錄水平上對谷胱甘肽合成酶和分解酶的合成來調控還原型谷胱甘肽的量; 同時也會通過酶修飾、 底物的量和反饋回路進行轉錄后調控。另外，谷胱甘肽還是金屬硫蛋白的合成底物，金屬硫蛋白能夠螯合并去除細胞中過量的重金屬。

極端溫度、 干旱、 病原物侵害或有毒物質積累都會誘導細胞產生ROS[30-32]。去除ROS、 有害異物和重金屬都需要谷胱甘肽參與，這是因為谷胱甘肽作為抗氧化物質在抗壞血酸循環(huán)中起重要作用。不同細胞器中的防御反應也會使氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變。氧化還原狀態(tài)的改變會影響NPR1的合成，NPR1是由水楊酸介導防御基因的重要調控子[33-35]。NPR1通過分子間的二硫鍵連接成寡聚體，游離在細胞質中。NPR1的巰基亞硝基化修飾促進其聚合物的形成，但由水楊酸誘導的NPR1聚合物的解離反應是由硫氧還蛋白催化的[36]。另外，NPR1硫的亞硝基化修飾還促進NPR1由細胞質轉移到細胞核。氧化脅迫和H2O2的積累會使氧化還原感受器呈氧化狀態(tài)，這種情況就需要植物做出相應的反應; 相反，有益微生物則使細胞呈還原狀態(tài)[36-37]。

2.3 硫的次級代謝

硫元素不僅參與基礎代謝，同時在硫代葡萄糖苷的合成中也起著重要作用。在十字花科植物中，植物體內超過30%的硫元素用來合成硫代葡萄糖苷。此外，富含硫的十字花科植物的代謝物能用于植物病蟲害的防治。有研究發(fā)現(xiàn)，硫的次級代謝產生的不同的含硫抗菌物質對內生真菌和腐生真菌均具有抗性[38-39]。硫的次級代謝產生的多種含硫抗菌物質可能有助于植物抵抗腐生型和活體營養(yǎng)型的真菌。

在植物與微生物間的有益互作中，硫代葡萄糖苷可能也有一定作用[40]，因為它們的分解產物可能會抑制菌絲的生長。硫代葡萄糖苷也是香氣、 抗癌藥劑和作物抗真菌劑的重要成分。硫代葡萄糖苷的合成與植物中硫含量有直接關系。足量的硫肥會促進硫代葡萄糖苷的合成，增加量從25%到50多倍。由蛋氨酸合成的硫代葡萄糖苷比由色氨酸合成的硫代葡萄糖苷作用顯著，這由許多基因轉錄調控和SLIM1控制。在缺硫的植物中，硫代葡萄糖苷的合成由一個下調基因和上調基因共同作用控制硫的吸收與同化。硫代葡萄糖苷可作為潛在硫源，在缺硫的狀態(tài)下為其它代謝反應提供硫。但是，關于硫代葡萄糖苷如何進行硫代謝這個問題還沒有研究定論[41-42]。在缺硫條件下，硫代葡萄糖苷分解用于根部生長素的合成，這可能會促進根部生長以吸收更多的硫[42]。

亞麻薺素(camalexin)是擬南芥對抗灰霉病B菌株時產生的植物抗毒素，從而對抗外來病原的入侵。亞麻薺素含硫和氮的側鏈，這也顯示了西羅血紅素在植物病原菌互作中的重要作用。植物的莖與根都能誘導亞麻薺素合成[42]，最主要的誘導物質是ROS，另外一些非生物因素，比如重金屬積累、 紫外光照和化學毒害等都會誘導產生ROS，最后促進亞麻薺素的合成。除了ROS，水楊酸信號傳導和谷胱甘肽的氧化還原狀態(tài)也會誘導亞麻薺素合成。研究已經明確了導致亞麻薺素的合成的生物和非生物因素，但是關于亞麻薺素在植物防御中的功能尚處于研究的初期階段。

2.4 鐵鹽代謝

當根部缺鐵時，原生質膜中的質子ATP轉移酶會使非原生質體呈弱酸性，從而提高Fe(OH)3的溶解量。酸性條件會提高與原生質膜相連的Fe3+螯合還原酶FRO2的活性，F(xiàn)RO2會把細胞內NADH的電子傳給細胞外的Fe3+。該酶的活性是與控制鐵轉運的IRT1相互作用的。在細胞中，鐵元素分布于不同的亞細胞結構中，如質體、 線粒體、 細胞液和液泡等[43]。在相應的細胞器中，是由鐵蛋白和螯合酶把鐵轉運到需要的地方，或者直接作為輔基和酶連接。由于這些反應很復雜，并且鐵在西羅血紅素合成、 硫氮元素同化和作為一些酶輔基中具有重要作用，可以推測，細胞中鐵含量的平衡對硫元素和氮元素的代謝具有重要作用。

鐵元素對豆科植物中的固氮根瘤菌也有重要作用，因為豆血紅蛋白和固氮酶中含有大量的鐵。豆血紅蛋白的輔基為含鐵的血紅素，血紅素是由細菌合成的，脫輔基蛋白卻是由豆科植物合成。另外，固氮酶包含有兩個亞基，其中一個亞基由MoFe作為輔基，另一個亞基由鐵作為輔基。所以，提供足量的鐵用于相關蛋白的合成是根瘤菌和豆科植物共生的保障。

鐵含量的平衡對植物細胞中Fe-S簇的生物合成具有重要作用。盡管Fe-S簇的化學結構簡單并且能夠在厭氧條件下自我合成，但在有氧條件下，其合成需要特定的蛋白，其合成包括三個步驟： 半胱氨酸釋放硫、 鐵硫在骨架蛋白中聚集、 新合成的Fe-S簇形成鐵硫蛋白。

鐵硫簇具有不穩(wěn)定性，所以每個細胞核細胞器都包含有Fe-S簇聚集蛋白。Fe-S簇的合成途徑起源已久，因所有的細菌都能合成它們[44]。在進行光合作用的綠色植物中，大部分的Fe-S簇用于光合作用。例如，光系統(tǒng)Ⅰ中的蛋白復合體是植物中最復雜的的蛋白復合體之一，含有3個Fe-S簇[45]。暗反應中一些重要的酶也含有Fe-S中心。

2.5 在細胞和細胞器信號轉導中的作用

長久以來，很多學者認為葉綠素生物合成的中間物在信號轉導過程中具有重要作用[46]。葉綠素中間物不可能直接參與該過程[47-48]，但是葉綠素合成受損會影響由核基因編碼的質體蛋白合成。比如后續(xù)的光損傷會促進ROS的合成。西羅血紅素的合成受抑制也許會影響到光敏物質尿卟啉Ⅲ的積累，如果它不用來合成葉綠素和血紅素，會擾亂從血紅素和原葉綠酸到ALA的反饋調節(jié)。與代謝和信號轉導的相關蛋白表達能夠通過微距陣分析得出重要的數(shù)據(jù)，這些蛋白都是由西羅血紅素控制調節(jié)的(例如Fe、 N、 S的代謝，F(xiàn)e-S簇的生物合成，ROS修復系統(tǒng)，氧化還原狀態(tài)控制，谷胱甘肽的生物合成，防御反應， 由質體到細胞核的信號轉導)。通過對以上數(shù)據(jù)相關性分析，證明血紅素和西羅血紅素在逆向信號傳導中具有重要作用[49]。

3 研究展望

本文主要綜述了西羅血紅素在植物生理生化反應過程中的重要作用，但是還有諸多問題有待解決。首先，尿卟啉原Ⅲ在甲基化反應合成西羅血紅素和脫羧反應合成葉綠素或血紅素兩種不同反應途徑中，其量是如何分配的尚不能確定。其次，在野生型和基因敲除性生物中，關于鐵螯合物(α，α-聯(lián)氮雜苯)如何決定生物體內的重要生理參數(shù)還需要進一步研究，以明確原卟啉IX和西羅血紅素合成時的物質競爭情況。尿卟啉原Ⅲ在兩種途徑中的分配可能隨著外部環(huán)境的變化而變化，如養(yǎng)分的利用率或環(huán)境脅迫。同時，SirB具有一個鐵硫中心，該鐵硫中心不能被還原，這種特性會在反應的分支點起調節(jié)作用。氧化還原影響著蛋白和蛋白之間的互作，這種互作可以調控下游的反應。因該輔酶對外部調控和氧化還原敏感，這可能是因其具有感應電子的功能，為此依靠UPM或SirB修復的植物會對還原型鐵或硫高度敏感。當細胞內離子水平超出一定范圍時，不僅要依靠生化反應調節(jié)，植物也許會在反應前就識別到細胞內離子的變化，并做出相應反應。SirB里的鐵硫中心會參與到氧化還原狀態(tài)識別或信號轉導途徑的起始，該信號轉導途徑負責控制下游加工過程。最后，植物合成途徑中關于催化第二步反應的酶尚不明確。所以，還需更多的研究來解決這些問題。

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