長鏈非編碼RNA在青少年特發(fā)性脊柱側凸中的表達研究

劉曉陽 邱貴興 翁習生 吳志宏 于斌 王以朋

（中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

長鏈非編碼RNA在青少年特發(fā)性脊柱側凸中的表達研究

劉曉陽 邱貴興 翁習生 吳志宏 于斌 王以朋*

（中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院骨科，北京 100730）

背景：長鏈非編碼 RNA（lncRNAs）是真核細胞中 一類長度 超過 200 核苷酸的非編碼 RNA 分子，與人類眾多疾病的發(fā)生有密切的關系。然而，lncRNAs在青少年特發(fā)性脊柱側凸（AIS）的表達情況尚不清楚。

目的：利用基因芯片篩選AIS患者外周血中差異表達的lncRNAs和mRNAs，分析lncRNAs在 AIS發(fā)病中的可能作用。

方法：選取 2013 年北京協(xié)和醫(yī)院就診的 20 例 AIS 患者和 20 例正常對照。利用 Agilent human lncRNA+mRNAArray V3.0 微陣列芯片檢測 4 例 AIS 患 者和 4 例年齡匹配的正常對照的 lncRNAs和 mRNAs表達，對差異表達的 mRNAs進行GO、Pathway 分析，構建 lncRNAs和 mRNAs的共表達網絡，預測 lncRNAs的可能調控靶點。

結果：AIS 患者中差異表達的 lncRNAs有 139 條，差異表達的 mRNAs有 546 條。GO 分析發(fā)現，差異表達的 mRNAs產物主要參與蛋白結合、金屬離子結合、核苷酸結合、調節(jié)轉錄、RNA剪切等。差異表達的mRNAs主要參與細胞黏附分子、Wnt通路、Toll樣受體通路、MAPK 通路等。靶基因預測，7 條 lncRNAs可能通過調節(jié) mRNAs的表達參與了 AIS的發(fā)病。結論 ：本研 究發(fā) 現了 AIS 患 者外 周 血 中 差 異 表 達 的 lncRNAs 和 mRNAs。lncRNAs可能 通過 調控 mRNA 的 表 達 參 與AIS的發(fā)病或發(fā)展。

特發(fā)性脊柱側凸；青少年；長鏈非編碼RNA

Background:Long noncoding RNAs(lncRNAs)are broadly classified as transcripts longer than 200 nucleotides,which function in a wide range of diseases.Expression profile of lncRNAs inAIS was still unclear.

Objective:To detect differentially expressed lncRNAs and mRNAs in peripheral blood samples from AIS patients using microarray and explore the role of lncRNAin the pathogenesis ofAIS.

Methods:A total of 20 AIS patients from Peking Union Medical College Hospital were recruited as cases together with 20 healthy controls.Peripheral blood was collected from 4 patients with AIS and 4 age-matched normal children and tested with Agilent human lncRNA+mRNA Array V3.0.GO and Pathway analysis was performed.The coding-non-coding gene co-expression network was constructed based on the correlation analysis.Target regulated by lncRNAs was predicted with bioinformatic prediction.

Results:A total of 139 deregulated lncRNAs and 546 deregulated mRNAs were detected in AIS patients.GO Term enrichment in the differentially expressed mRNA list included protein binding,metal ion binding,nucleotide binding,regulation of transcription,RNA splicing et al.Differentially expressed mRNAs may involve in Cell adhesion molecules,Wnt signaling pathway,Toll-like receptor signaling pathway,MAPK signaling pathway and so on.Seven lncRNAs may regulate mRNAs expression in pathogenesis ofAIS.

Conclusions:This is the first time to find lncRNAs and mRNAs expression in AIS patients using microarray.Differentially expressed lncRNAs may play a role in the pathogenesis ofAIS.

青 少 年 特 發(fā) 性 脊 柱 側 凸（adolescent idiopathic scoliosis,AIS）占特發(fā)性脊柱側凸總數的 80%左右，累及脊柱、胸廓、肋骨、骨盆，不但影響外觀，還嚴重影響生命質量及預期壽命。大規(guī)模流行病學調查發(fā)現，AIS 患者的子女患病率高達 27%，遠高于人群發(fā)病率[1]，單卵雙生的 AIS 發(fā)病一致性遠高于異卵雙生子，提示 AIS 具有遺傳傾向[2]。目前連鎖分析定位了一些 AIS 病因相關區(qū)域[3,4]，關聯分析也發(fā)現了一些基因多態(tài)性與 AIS 的臨床特征相關[5,6]。然 而 ，不同研究的結論并不一致[7]。無論是連鎖分析的陽性連鎖區(qū)域還是關聯分析的陽性基因，均不能很好解釋AIS的遺傳方式和發(fā)病機制。

長 鏈 非 編 碼 RNA（long non-coding RNAs,lncRNAs）是一類在真核細胞內被普遍轉錄的長度超過200個核苷酸的功能性RNA分子，不具有或很少具有蛋 白 編碼 功 能，但可通 過 RNA-蛋白、RNA-DNA 或RNA-RNA 等 多 種 相 互 作 用 方 式 發(fā) 揮 調 控 功 能[8-10]?，F有研究已證實，lncRNAs在疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用，許多疾病與lncRNAs的調控有密切的關系[11,12]。到目前為止，國內外尚未開展 AIS 發(fā)病機制中 lncRNAs的相關研究，發(fā)現 AIS 的 lncRNAs表達譜系對于進一步研究AIS的發(fā)病機制具有重要的意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象

采用病例-對照研究方法，病例組為 2013年4 月至2013年10月在北京協(xié)和醫(yī)院就診的20例中國漢族 人 群 青 少 年 女 性 AIS 患 者 ，年 齡（14.0± 2.0）歲 ，Cobb 角范圍為 47.4°±12.4°。所有患者的體格檢查和閱片均由同一名醫(yī)師完成，根據以下診斷標準確診：全脊柱側位片顯示Cobb角＞15°伴椎體旋轉，無椎體的先天性畸形，無椎旁肌萎縮，并排除馬凡綜合征、神經纖維瘤病、神經系統(tǒng)疾病、骨骺發(fā)育不良等疾病。對照組為年齡匹配的正常對照20例，排除脊柱畸形疾病及家族史、內分泌疾病等。采集所有受試者的臨床資料、影像學資料，清晨空腹安靜狀態(tài)下抽靜 脈 血 6 ml，采 血 后 立 即 與 3 倍 體 積 的 Trizol LS 混勻，分裝至EP管中，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

1.2.1 主 要 試 劑 ：Trizol LS（美 國 Ambion 公 司 ）；異 丙醇、氯仿、無水乙醇（上?；瘜W試劑有限公司）；RNA純 化 試 劑 盒（德 國 QIGEN 公 司 ），PrimeScript RT reagent kit反轉錄試劑盒（寶生物工程有限公司）；定量PCR檢測試劑盒（寶生物工程有限公司）。基因芯片檢測使用 Agilent human lncRNA+mRNAArray V3.0，委托北京博奧生物技術有限公司進行。

1.2.2 主要 儀器 ：ND-1000 超微 量分 光光 度計（美 國NanoDrop 公司）；普通 PCR 儀（美國 ABI公司）；Realtime PCR 儀（寶 生 物 工 程 有 限 公 司）；-80℃ 冰 箱 、高速冷凍離心機等設備以及其他常規(guī)儀器。

1.3 實驗方法

1.3.1 基因芯片檢測：年齡匹配的 4 例 AIS 患者和 4 例正常對照進行基因芯片分析。外周血和 Trizol LS 凍存混合液室溫融化后劇烈搖勻；使用化學試劑發(fā)提取 全 血 總 RNA，并 使 用 QIAGEN Rneasy Kit純 化RNA，所 得總 RNA OD260/OD280≥1.8，電 泳 檢 測 有清晰的 18S 和 28S rRNA 條帶，同時28S/18S 的比例接近1∶1。反轉錄合成雙鏈cDNA，進一步合成Cy3熒光標記cRNA，測定濃度和純度后上芯片進行雜交。使用 Agilent芯片掃描儀（G2565CA）對清洗后的芯片進行掃描，得到雜交圖片。

1.3.2 基因芯片數據分析：提取雜交圖片數據并進行歸一化處理獲得各區(qū)域熒光強度，經過折疊倍率（fold change,FC）篩選 ，篩 選 出 所 有 差 異 表 達 的 lncRNAs和 mRNAs，參數選擇標準為 P＜0.05，FC＞2。

基 因 本 體 論（gene ontology,GO）分 析 描 述 差 異表達的 mRNAs的功能屬性?；谧钚碌?Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數據庫，對差異表達的mRNAs數據進行生物學途徑分析，明確差異表達的mRNAs數據主要富集分布于哪些生物學途徑。構建編碼基因和非編碼基因的共表達網絡（the coding-non-coding gene co-expression network），直觀顯示 lncRNAs和 mRNAs之間的相關性。在 lncRNAs和 mRNAs共表 達基礎 上預 測 lncRNAs的 可能調控靶點。Cis-預測尋找基因組位置在 10 kb 之內的 lncRNA-mRNA 對，Trans-預測對lncRNA 和mRNA序列進行比對，篩選序列相似的 lncRNA-mRNA 對。1.3.3 定量 PCR：以年齡匹配的 20 例 AIS 患者和 20 例正常女性為研究對象，選取差異表達較明顯的、靶基因預測顯示可能參與 AIS 發(fā)病的 lncRNAs進行實時定量PCR驗證。

2 μg 總 RNA 去除 DNA，反轉錄成 cDNA。實時定 量 PCR 采 用 20 μl反 應 體 系 ，包 括 SYBR Premix（10 μl）、正向引物（0.4 μl）、反向引物（0.4 μl）、cDNA模板（1 μl）、雙蒸水（8.2 μl）。定量 PCR 所用引物由北 京 Inventrogen 生 物 工 程 有 限 公 司 合 成（ 表 1）。94℃反應 5 min；變性和擴增和延伸，94℃反應 30 s，58℃反應 30 s，72℃反 應 40 s，共 40 個循 環(huán) ；72℃反應7 min。采用△△cycle threshold（△ △ Ct）方 法 進 行定量分析[13]。每樣本重復 3 次，基因平均拷貝數經管家基 因 3-磷 酸 甘 油 醛 脫 氫 酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）的 拷 貝 數 校 正 。 計 算2-△△Ct值，即為實驗組的目的基因表達量是對照組表達量的百分數，大于200%為表達上調，小于50%為表達下調。

表1 實時定量PCR引物

2 結果

2.1 芯片實驗結果

2.1.1 差異表達 lncRNAs 和 mRNAs：采用 Agilent human lncRNA+mRNAArray V3.0 檢測，AIS 患者有 139條 lncRNAs差異表達。其中上調的 lncRNAs 120 條，下 調 的 lncRNAs 19 條 。 差 異 表 達 的 mRNAs 共 546條，上調表達 mRNAs 512 條，下調表達的 lncRNA 34條 。 上 調 、下 調 倍 數 最 明 顯 的 10 條 lncRNAs 和mRNAs分別見表2和表3。通過分層群聚圖可直觀的看到 AIS 組與 NC 組 lncRNAs與 mRNAs的差異表達（圖1A和圖1B）。從紅色到綠色，顏色越深差異表達越明顯。

2.1.2 GO、Pathway 分析：GO 功能分類注釋得出 ，差 異表達的mRNAs參與轉錄調節(jié)、免疫反應、信號轉導、RNA剪切、凋亡、細胞周期過程、生物學周期過程等過程。Pathway 分 析 顯示，差異表達 mRNAs在 細 胞黏附分子、造血細胞、T細胞受體信號通路、結直腸癌、Wnt信號通路等方面功能的基因有顯著地變化。

2.1.3 CNC 網 絡 圖 ：相 關 性 分 析 發(fā) 現 ，共 64 對 lncRNAs-lncRNAs相關性 、280 對 lncRNAs-mRNAs相關性根據基因之間的相關性，構建CNC網絡圖。圖2顯 示 的 AIS 患 者 降 低 表 達 最 多 的 lncRNA p1842 的CNC 網 絡 圖 。 p1842 同 時 與 8 條 lncRNAs 和 13 條mRNAs具有相關性。

2.1.4 lncRNAs的作用靶點預測：經過Cis-和Trans-預測發(fā)現 ，7 條 lncRNAs（uc002ddj.1,uc021tnw.,uc021zdc.1, HIT000067310,ENST00000577528.1,ENST0000060-2322.1,TCONS_00001429）可 能調 控 5 條 mRNAs的表達（表4）。

2.2 定量PCR

選取靶基因可能參與運動系統(tǒng)發(fā)育的lncRNAs（ENST00000602322.1 和 HIT000067310）以及差異表達 最 多 的 lncRNAs（ENST00000440778.1、TCONS_ 00028768 和 ENST00000414894.1）用 定 量 PCR 對 基因芯片的結果進行驗證。結果顯示，4條lncRNAs在擴大樣本中得到較好的驗證，qPCR的結果與芯片數據趨勢基本一致（圖3），1條lncRNA的基因芯片結果未能在擴大樣本中得到驗證。

3 討論

人類基因組中只有不到2%的序列編碼蛋白質，除去大約7%的非轉錄區(qū)，其余91%的基因組序列轉錄產生非編碼 RNA[14]。隨著科學技術的發(fā)展和相關研究的不斷深入，現在越來越多的長鏈非編碼RNA（1ncRNAs）被鑒定出來，并成為病因學研究和分子生物學研究領域中一個全新的熱點?，F有研究表明，lncRNAs的表達紊亂與多種人類重大疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[11,15-17]，對 lncRNAs 的 深 入 研 究 對 于推動人們對生命現象的重新闡釋具有重大意義。本研究揭示了 AIS 疾病中的 lncRNAs表達輪廓，對于進一步研究和探討AIS的發(fā)病機制具有重要的作用和意義。

表2 與正常對照組比較，AIS組差異表達前 10 位 lncRNAs

表3 與正常對照組比較，AIS 組差異表達前10位的mRNAs

基因轉錄是一個受到嚴格調控的生物學過程。lncRNAs作為細胞中的重要調控因子，也參與了基因的轉錄調控。此研究中的ENST00000602322.1位于11 號 染 色 體 長 臂 上 ，緊 鄰 Pcf11（Protein 1/Cleavage Factor 1）。Pcf11 的編碼蛋白參與 pre-mRNA 剪切[18]，在調控轉錄起始、延長以及mRNA的從核內向胞漿轉運過程中發(fā)揮重要的調節(jié)作用[19-21]。Pcf11 在轉錄和 pre-mRNA 剪切中的作用主要是通過與 RNA 聚合酶 II的 C 端 結 構域（RNA polymerase Ⅱ C-terminal domain（Poly Ⅱ CTD）和多聚腺苷酸因子結合來實現的[22,23]。Poly Ⅱ CTD 的磷酸化狀態(tài)直接影響 Pcf11 與RNA 聚合酶Ⅱ的結合，lncRNAs作為順式調控因子間接影響 Pcf11 和 pre-mRNA 的結合[24,25]。鑒于 Pcf11在調控轉錄和mRNA剪切過程中的重要作用，差異表 達 的 Pcf11 可 能 參 與 了 AIS 發(fā) 病 及 發(fā) 展 。ENST00000602322.1對 Pcf11 轉錄和翻譯的調控機制也需要在將來研究中進一步確認。

定量 PCR 結果與芯片結果基本一致，4 條 lncRNAs的表達趨勢完全一致，只是qPCR結果較芯片數據的差異倍數有所減小。1條 lncRNAs的芯片數據未能在大樣本中得到驗證，原因可能是芯片檢測的偶然誤差，也可能是由于樣本的個體特征差異引起。部分lncRNAs的群體表達特征還需要大樣本人群來驗證。ENST00000440778.1 在 AIS 組和 NC 組間的差異僅為 FC=2.17，芯片數據與 qPCR 結果有一定的差距，原因可能是用于芯片檢測的樣本不能很好的代表人群中l(wèi)ncRNAs的表達輪廓。

圖 1 差異表達的 lncRNAs（左圖）和 mRNAs（右圖）分層群聚圖

圖 2 p1842的 CNC網絡圖三角形代表lncRNA，圓形代表mRNA

表 4 lncRNAs及其 mRNAs預測靶點信息

圖3 定量PCR驗證基因芯片結果

在組織分化和發(fā)育過程中，lncRNAs的表達具有時間特異性和空間特異性[26]。lncRNAs較 mRNAs具有更高的特異性，還具有易于檢測的特性，采用普通PCR 即可完成[27,28]。因此，該研究發(fā)現的 AIS 患者特異性表達的 lncRNAs對于將來發(fā)掘 AIS 患者的特異性診斷和預后標記具有重要的指導意義。

我們的研究也具有局限性：①研究發(fā)現了大量AIS 患者 差 異表 達的 lncRNAs，這些 差 異表 達的 lncRNAs 可 能 參 與 了 AIS 的 發(fā) 病 。 但 是 ，缺 乏 lncRNAs的更詳細信息以及它們在 AIS發(fā)病中的確切機制。②用于芯片檢測的樣本每組僅有4對，可能會遺漏一些信息，降低了篩選生物標記的準確性。③此 研 究 標本取自外周血，差 異 表 達的 lncRNAs還需要在骨骼肌肉系統(tǒng)中進一步驗證。但是，獲取正常青少年的骨骼肌肉具有相當大的難度。因此，將經外周血篩查發(fā)現的差異表達的 lncRNAs與 AIS 患者骨骼肌肉系統(tǒng)中的表達狀況進行比對，可能進一步 縮小 AIS 發(fā) 病相 關 lncRNAs的篩 選范圍 ，該 研 究為進一步探討 lncRNAs在 AIS 發(fā)病機制中的作用打下了基礎。

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Study on expression of long non-coding RNAin adolescent idiopathic scoliosis

LIU Xiaoyang,QIU Guixing,WENG Xisheng,WU Zhihong,YU Bin,WANG Yipeng*

(Department of Orthopedic Surgery,Peking Union Medical College Hospital,ChineseAcademy of Medical Sciences& Peking Union Medical College,Beijing 100730,China)

idiopathic scoliosis;adolescent;long non-coding RNA

*通信作者：王以朋，E-mail:ypwang133@163.com