基因工程改造與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞凋亡

張存超，寇 庚，3，王 皓，3

（1.上海張江生物技術(shù)有限公司，上海201203；2.抗體藥物與靶向治療國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海201203；3.第二軍醫(yī)大學(xué)腫瘤研究所，上海200433）

治療性單克隆抗體是生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展最迅速的領(lǐng)域，廣闊的市場(chǎng)需求對(duì)其大規(guī)模生產(chǎn)提出了巨大的挑戰(zhàn)。高效細(xì)胞株的高密度、長(zhǎng)周期培養(yǎng)是提升抗體表達(dá)水平的重要手段，而長(zhǎng)周期培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞凋亡是限制細(xì)胞密度提升和培養(yǎng)周期延長(zhǎng)的關(guān)鍵因素［1］。細(xì)胞凋亡又稱(chēng)細(xì)胞的程序性死亡，它是細(xì)胞在多種因素誘導(dǎo)下的自殺行為。

中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢（CHO）細(xì)胞是表達(dá)單克隆抗體最常用的工程細(xì)胞，抑制CHO細(xì)胞凋亡的途徑主要有細(xì)胞工程改造和培養(yǎng)基／培養(yǎng)條件優(yōu)化［2］。抑制CHO細(xì)胞凋亡的細(xì)胞工程改造是在細(xì)胞中上調(diào)或下調(diào)一個(gè)或多個(gè)基因的表達(dá)，從而達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。

作者在此主要從細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑、細(xì)胞信號(hào)通路以及小分子RNA（microRNA）等方面綜述了運(yùn)用基因工程手段對(duì)CHO細(xì)胞凋亡改造的進(jìn)展。

1 細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑與凋亡

依起始半胱天冬酶（caspase）的不同，細(xì)胞凋亡途徑可分為外在途徑、內(nèi)在途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑［3］。外在途徑由細(xì)胞表面的死亡受體如Fas和腫瘤壞死因子受體家族引發(fā)；內(nèi)在途徑由應(yīng)激條件、化學(xué)治療試劑和藥物引發(fā)；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起caspase－12的活化，從而導(dǎo)致凋亡。

參與細(xì)胞凋亡信號(hào)途徑的基因分為兩種：抑制凋亡基因與促進(jìn)凋亡基因，抑凋亡基因的過(guò)表達(dá)或促凋亡基因的下調(diào)均可抑制細(xì)胞凋亡。

bcl家族基因與凋亡密切相關(guān)。丁酸鈉能夠提高重組蛋白的表達(dá)量，同時(shí)也會(huì)抑制細(xì)胞增殖并且誘導(dǎo)凋亡。未添加丁酸鈉時(shí)，在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)bcl－2基因并不能抑制凋亡；然而，在添加5mmol·L－1丁酸鈉后，bcl－2過(guò)表達(dá)通過(guò)降低caspase－3的活性而抑制凋亡，進(jìn)而延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間2d以上，并且使得人源化抗乙肝表面S抗原抗體的表達(dá)量提高了3倍［4］。

Han等［5］使用Tet－off系統(tǒng)通過(guò)100ng·mL－1強(qiáng)力霉素控制bcl－xL的表達(dá)，在310mOsm·kg－1和480mOsm·kg－1滲透壓下，bcl－xL過(guò)表達(dá)在批次培養(yǎng)第8～10d通過(guò)降低剪切型caspase－7含量而抑制細(xì)胞凋亡。

Majors等［6］在CHO細(xì)胞中分別過(guò)表達(dá)了bcl家族基因mcl－1野生型基因及其不能被泛素蛋白酶降解的突變體mcl－1－5k，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩者均能通過(guò)降低caspase－3活性而抑制細(xì)胞凋亡并分別提高VLA1抗體表達(dá)量40%和20%。

除了抑凋亡基因的過(guò)表達(dá)外，促凋亡基因的下調(diào)也能夠抑制凋亡。caspase－3是一種常見(jiàn)的促凋亡基因，在CHO細(xì)胞中借助反義RNA下調(diào)caspase－3表達(dá)量顯著抑制了5mmol·L－1丁酸鈉誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，然而其抗體表達(dá)量并未提高［7］。

2 細(xì)胞信號(hào)通路與凋亡

細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是指信號(hào)分子經(jīng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)轉(zhuǎn)換，最終影響細(xì)胞生物學(xué)功能的過(guò)程。細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通過(guò)多種信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)。PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路是細(xì)胞中與凋亡相關(guān)的重要通路。PI3K是細(xì)胞內(nèi)的一種磷脂酰肌醇3激酶，當(dāng)接受來(lái)自酪氨酸激酶和G蛋白偶聯(lián)受體的信號(hào)后，PI3K被激活并使Akt從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上；并在3－磷酸肌醇依賴(lài)性蛋白激酶1的輔助下，通過(guò)使Akt蛋白磷酸化而激活，并最終激活A(yù)kt底物雷帕霉素靶體蛋白（mTOR）［8］。

Akt和mTOR是PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路的核心蛋白。研究顯示，在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)人Akt可降低剪切型caspase－3蛋白含量，同時(shí)減輕染色體DNA片段化，這意味著Akt過(guò)表達(dá)抑制了CHO細(xì)胞凋亡［9］。與此類(lèi)似，在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)人mTOR可提高培養(yǎng)基中血清缺乏（0.5%胎牛血清）或缺氧（1%氧濃度）時(shí)CHO細(xì)胞活率，并提高人胎盤(pán)堿性磷酸酶和α－淀粉酶的表達(dá)量3倍以上，表明mTOR可通過(guò)抑制凋亡提高細(xì)胞活率［10］。

3 小分子RNA（microRNA）與凋亡

microRNA是真核生物中廣泛存在、長(zhǎng)度為21～23個(gè)核苷酸、可調(diào)節(jié)其它基因表達(dá)的RNA分子。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA可通過(guò)與RNA或其它分子作用抑制細(xì)胞凋亡［11］。

一些研究者通過(guò)靶向特定的microRNA顯著抑制了細(xì)胞的凋亡。在CHO細(xì)胞中借助短發(fā)夾RNA（shRNA）穩(wěn)定敲除mmu－miR－466h－5p，與對(duì)照相比，基因敲除后的細(xì)胞活率顯著提高并延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間35h以上，研究顯示caspase－3和caspase－7的激活被延遲并促進(jìn)了抑凋亡基因bcl 2l 2等的表達(dá)，而且此細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物人胎盤(pán)堿性磷酸酶的表達(dá)量提高了43%［12］。microRNA－326通過(guò)降低丙酮酸激酶活性、上調(diào)caspase－3和caspase－7，促進(jìn)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，通過(guò)特異性作用于microRNA－326或許可以抑制細(xì)胞凋亡［13］。除此之外，microRNA－133也是潛在的可用于抑制細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn)［14］。

4 多基因協(xié)同作用與凋亡

在上述研究中，均是過(guò)表達(dá)單基因以抑制凋亡，此外，多基因常常被聯(lián)合使用以進(jìn)一步抑制凋亡。與單基因在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)相比，beclin－1和bcl－2在CHO細(xì)胞中共表達(dá)進(jìn)一步降低了剪切型caspase－3和caspase－7的蛋白含量，并抑制了3mmol·L－1丁酸鈉或0.1mol·L－1氯化鈉誘導(dǎo)的凋亡［15］。與之類(lèi)似，多基因的聯(lián)合使用均取得了比單基因過(guò)表達(dá)更好的效果：如使用蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)抑凋亡基因E1B－19K和Aven顯著抑制了CHO細(xì)胞的凋亡并提高單克隆抗體表達(dá)量40%以上［16］、bcl－2和酮戊二酸轉(zhuǎn)運(yùn)子過(guò)表達(dá)提高細(xì)胞對(duì)線(xiàn)粒體氧化損傷的耐受并抑制CHO細(xì)胞凋亡［17］、LDH－α敲除及bcl－2擴(kuò)增通過(guò)作用于caspase－7來(lái)抑制二氫葉酸還原酶缺陷的CHO－DG44宿主細(xì)胞的凋亡［18］。與單基因過(guò)表達(dá)相比，熱休克蛋白HSP 27和HSP 70在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)進(jìn)一步抑制了細(xì)胞凋亡，并提高了干擾素γ的表達(dá)量54%以上［19］。在CHO細(xì)胞中共表達(dá)存活素和細(xì)胞周期蛋白D1在無(wú)血清培養(yǎng)基中抑制了33%～43%的早期凋亡［20］。

5 潛在抑制細(xì)胞凋亡的基因

細(xì)胞代謝可能也與凋亡相關(guān)。代謝副產(chǎn)物乳酸的累積抑制細(xì)胞生長(zhǎng)甚至降低產(chǎn)物表達(dá)量［21］。由此推測(cè)，減少乳酸的產(chǎn)生或許可以抑制細(xì)胞凋亡。比如，過(guò)表達(dá)丙酮酸羧化酶或敲除LDH－α均可改善細(xì)胞中的糖酵解代謝并減少乳酸產(chǎn)生，這或許也可以抑制細(xì)胞凋亡。

蘋(píng)果酸－天冬氨酸穿梭途徑相關(guān)蛋白可能與凋亡相關(guān)。以Aralar1蛋白為例，Aralar1在胰島β細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可降低乳酸產(chǎn)生、改善線(xiàn)粒體能量代謝狀態(tài)［22］，而乳酸是糖酵解的常見(jiàn)代謝副產(chǎn)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；線(xiàn)粒體膜電位的改變是凋亡早期的顯著變化，由此推測(cè)Aralar1或許與凋亡相關(guān)。

此外，?；撬徂D(zhuǎn)運(yùn)子在CHO細(xì)胞中過(guò)表達(dá)可提高細(xì)胞活率、減少乳酸產(chǎn)生并提高重組蛋白表達(dá)量，是另一個(gè)潛在的細(xì)胞工程靶點(diǎn)［23］。

從與凋亡相關(guān)的信號(hào)通路出發(fā)，對(duì)CHO細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的基因工程改造可能帶來(lái)更好的效果。除了上面提到的PI3K／Akt／mTOR通路外，Hippo－Mst信號(hào)通路或許可以作為潛在靶點(diǎn)。在果蠅中，hippo抑制細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是抑癌基因。下調(diào)Hippo－Mst信號(hào)途徑的關(guān)鍵蛋白表達(dá)可能加速細(xì)胞增殖并抑制細(xì)胞凋亡［24］。Akt通路的調(diào)控或許也能抑制細(xì)胞凋亡。PHLDA3是p53調(diào)節(jié)的Akt抑制基因，Akt的過(guò)表達(dá)抑制了細(xì)胞凋亡，以此推測(cè)PHL－

DA3的下調(diào)或許是抑制凋亡的另一個(gè)途徑［25］。

［1］PORTT L，NORMAN G，CLAPP C，et al.Anti－apoptosis and cell survival：A review［J］.BBA－Mol Cell Res，2010，1813（1）：238－259.

［2］LEE J S，LEE G M.Rapamycin treatment inhibits CHO cell death in a serum－free suspension culture by autophagy induction［J］.Biotechnol Bioeng，2012，109（12）：3093－3102.

［3］TAYLOR R C，CULLEN S P，MARTIN S J.Apoptosis：Controlled demolition at the cellular level［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，9（3）：231－241.

［4］KIM N S，LEE G M.Overexpression of bcl－2inhibits sodium butyrate－induced apoptosis in Chinese hamster ovary cells resulting in enhanced humanized antibody production［J］.Biotechnol Bioeng，2001，71（3）：184－193.

［5］HAN Y K，HA T K，KIM Y G，et al.bcl－xL Overexpression delays the onset of autophagy and apoptosis in hyperosmotic recombinant Chinese hamster ovary cell cultures［J］.J Biotechnol，2011，156（1）：52－55.

［6］MAJORS B S，BETENBAUGH M J，PEDERSON N E，et al.mcl－1 Overexpression leads to higher viabilities and increased production of humanized monoclonal antibody in Chinese hamster ovary cells［J］.Biotechnol Progr，2009，25（4）：1161－1168.

［7］KIM N S，LEE G M.Inhibition of sodium butyrate－induced apoptosis in recombinant Chinese hamster ovary cells by constitutively expressing antisense RNA of caspase－3［J］.Biotechnol Bioeng，2002，78（2）：217－228.

［8］SONG G，OUYANG G L，BAO S D.The activation of Akt／PKB signaling pathway and cell survival［J］.J Cell Mol Med，2007，9（1）：59－71.

［9］HWANG S O，LEE G M.Effect of Akt overexpression on programmed cell death in antibody－producing Chinese hamster ovary cells［J］.J Biotechnol，2008，139（1）：89－94.

［10］DREESEN I A，F(xiàn)USSENEGGER M.Ectopic expression of human mTOR increases viability，robustness，cell size，proliferation，and antibody production of Chinese hamster ovary cells［J］.Biotechnol Bioeng，2011，108（4）：853－866.

［11］LIMA R T，BUSACCA S，ALMEIDA G M，et al.microRNA Regulation of core apoptosis pathways in cancer［J］.Eur J Cancer，2011，47（2）：163－174.

［12］DRUZ A，SON Y J，BETENBAUGH M，et al.Stable inhibition of mmu－miR－466h－5p improves apoptosis resistance and protein production in CHO cells［J］.Metab Eng，2013，16：87－94.

［13］KEFAS B，COMEAU L，ERDLE N，et al.Pyruvate kinase M2is a target of the tumor－suppressive microRNA－326and regulates the survival of glioma cells［J］.Neuro－Oncology，2010，12（11）：1102－1112.

［14］XU C，LU Y，PAN Z，et al.The muscle－specific microRNAs miR－1and miR－133produce opposing effects on apoptosis by targeting HSP60，HSP70and caspase－9in cardiomyocytes［J］.J Cell Sci，2007，120（17）：3045－3052.

［15］LEE J S，HA T K，PARK J H，et al.Anti－cell death engineering of CHO cells：Co－overexpression of bcl－2for apoptosis inhibition and beclin－1 for autophagy induction［J］.Biotechnol Bioeng，2013，110（8）：2195－2207.

［16］FIGUEROA B，AILOR E，OSBORNE D，et al.Enhanced cell culture performance using inducible anti－apoptotic genes E1B－19K and Avenin the production of a monoclonal antibody with Chinese hamster ovary cells［J］.Biotechnol Bioeng，2007，97（4）：877－892.

［17］WILKINS H M，MARQUARDT K，LASH L H，et al.bcl－2is a novel interacting partner for the 2－oxoglutarate carrier and a key regulator of mitochondrial glutathione［J］.Free Radical Bio Med，2011，52（2）：410－419.

［18］JEON M，YU D Y，LEE G M.Combinatorial engineering of ldhαand bcl－2 for reducing lactate production and improving cell growth in dihydrofolate reductase－deficient Chinese hamster ovary cells［J］.Appl Microbiol and Biotechnol，2011，92（4）：779－790.

［19］LEE Y Y，WONG K T K，TAN J，et al.Overexpression of heat shock proteins（HSPs）in CHO cells for extended culture viability and improved recombinant protein production［J］.J Biotechnol，2009，143（1）：34－43.

［20］ZHAO X H，GUO J W，YU Y Q，et al.Overexpression of survivin and cyclin D1in CHO cells confers apoptosis resistance and enhances growth in serum－free suspension culture［J］.Biotechnol Lett，2011，33（7）：1293－1300.

［21］HAUSER H，WAGNER R.Metabolic Control of Animal Cell Culture Processes：WAGNER R.Mammalian Cell Biotechnology in Protein Production［M］.Berlin：Walter de Gruyter，1997：233－276.

［22］RUBI B，del ARCO A，BARTLEY C，et al.The malate－aspartate NADH shuttle member Aralar1determines glucose metabolic fate，mitochondrial activity，and insulin secretion in beta cells［J］.J Biol Chem，2004，279（53）：55659－55666.

［23］TABUCHI H，SUGIYAMA T，TANAKA S，et al.Overexpression of taurine transporter in Chinese hamster ovary cells can enhance cell viability and product yield，while promoting glutamine consumption［J］.Biotechnol Bioeng，2010，107（6）：998－1003.

［24］HARVEY K F，PFLEGER C M，HARIHARAN I K.The Drosophila Mst ortholog，hippo，restricts growth and cell proliferation and promotes apoptosis［J］.Cell，2003，114（4）：457－467.

［25］KAWASE T，OHKI R，SHIBATA T，et al.PH Domain－only protein PHLDA3is a p53－regulated repressor of Akt［J］.Cell，2009，136（3）：535－550.