熒光染色法在結(jié)核分枝桿菌檢測中的應(yīng)用

張 立，周洪經(jīng)，馮 爽

(天津市海河醫(yī)院，天津300350)

目前，臨床上對于結(jié)核病的診斷，臨床多使用X線、病理切片、痰涂片鏡下檢查、細(xì)菌培養(yǎng)等，但X線對無典型影像學(xué)表現(xiàn)患者有局限性;病理切片耗時(shí)長;厚涂片抗酸染色法結(jié)果較為準(zhǔn)確，長期用于確診結(jié)核病，但鏡檢檢出時(shí)間較長，陽性檢出率較低，無法滿足臨床需要。在常見的幾種結(jié)核桿菌的檢測方法中，結(jié)核桿菌培養(yǎng)陽性率為25%～75%，PCR檢測結(jié)核桿菌DNA陽性率為77%～90%，但這兩種方法對實(shí)驗(yàn)室要求較高，在基層醫(yī)院中難以開展［1，2］。我們采用熒光染料鹽基淡黃配制成熒光染液，采用熒光染色法對250例肺結(jié)核患者痰標(biāo)本進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌檢測，并與抗酸染色法對比，發(fā)現(xiàn)熒光染色法可顯著提高陽性率?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 痰標(biāo)本來自2012年10月～2013年6月天津市海河醫(yī)院住院和門診250例肺結(jié)核患者，這些患者均為初診患者，經(jīng)X線、PPD試驗(yàn)、結(jié)核抗體檢查等臨床初步診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核。每位患者收集深咯痰標(biāo)本，每份痰標(biāo)本涂抹2張玻片，分別進(jìn)行抗酸染色(抗酸染色組)和熒光染色(熒光染色組)。

1.2 熒光染色劑、抗酸染液的配制方法 染色劑:取0.1 g鹽基淡黃溶于10 mL 95%乙醇中加3%石炭酸至100 mL。脫色劑:5%鹽酸乙醇。反襯劑:高錳酸鉀0.5 g，溶于100 mL蒸餾水?？顾崛疽旱呐渲瓢凑铡敖Y(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)則”進(jìn)行。

1.3 痰涂片染色及觀察方法 用竹簽挑取標(biāo)本的膿樣、血樣或干酪樣部分0.05～0.1 mL于玻片正面的右側(cè)2/3中央處，并均勻涂抹成1.0 cm×2.0 cm橢圓形痰膜，薄厚適中，室溫下自然干燥。將痰涂片進(jìn)行染色和鏡檢。①染色方法:熒光染色組:將痰涂片用熒光染液染10 min，水洗后用5%的鹽酸乙醇脫色1～2 min至外觀無黃色為止，水洗后用反襯液染1～2 min，水洗晾干待檢。抗酸染色組:染色按“結(jié)核病診斷細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)規(guī)程”進(jìn)行。②鏡檢:熒光染色組:已染好的涂片用ZEISS Primo Star iLED熒光落射暗視野顯微鏡觀察，以10×目鏡、20×物鏡觀察痰涂片，40×物鏡檢查細(xì)菌細(xì)胞形態(tài)。抗酸染色組:染色好的痰涂片用OLYMPUS CX21普通光學(xué)顯微鏡100×物鏡觀察。熒光染色和抗酸染色鏡檢時(shí)間和結(jié)果報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)均以“結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程”為準(zhǔn)。熒光染色結(jié)果報(bào)告:符合0條/50視野，則為熒光染色抗酸桿菌陰性(-);符合1～9條/50視野，則報(bào)告熒光染色抗酸桿菌數(shù);符合10～99條/50視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(+);符合1～9條/視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(++);符合10～99條/視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(+++);符合≥100條/視野，則為熒光染色抗酸桿菌陽性(++++)［3］。抗酸染色結(jié)果報(bào)告:連續(xù)觀察300個(gè)不同視野，符合0條/300視野，則為抗酸桿菌陰性(-);符合1～8條/300視野，則報(bào)告抗酸桿菌菌數(shù);符合3～9條/100視野，則為抗酸桿菌陽性(+);符合1～9條/10視野，則為抗酸桿菌陽性(++);符合1～9條/視野，則為抗酸桿菌陽性(+++);符合≥10條/視野，則為抗酸桿菌陽性(++++)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

熒光染色組結(jié)核桿菌在黑暗背景下呈黃綠色，桿狀或短棒狀;抗酸染色組結(jié)核桿菌呈紅色桿狀，稍彎曲。

熒光染色組檢出結(jié)核分枝桿菌陽性109例，陽性率為 43.60%，其中(+)、(++)、(+++)、(++++)陽性率分別占13.20%、11.60%、8.40%、10.40%;抗酸染色組陽性86例，陽性率為34.40%，其中(+)、(++)、(+++)、(++++)分別占6.80%、8.80%、8.00%、10.80%。兩組總陽性率及(+)陽性率比較P均＜0.01。250例活動(dòng)性肺結(jié)核患者痰標(biāo)本，熒光染色法檢測出109例陽性標(biāo)本中抗酸染色檢測79例為陽性、30例為陰性;熒光染色檢測為陰性的141例標(biāo)本中抗酸染色檢測134例為陰性、7例為陽性;而在抗酸染色為陽性的86例標(biāo)本中，其中熒光染色檢測79例為陽性、7例為陰性。熒光染色組的靈敏度為91.86%、特異性為95.04%;抗酸染色組的靈敏度為72.48%、特異性為81.71%。與抗酸染色組比較，熒光染色組檢測痰中結(jié)核桿菌的靈敏度、特異性均較高(P均＜0.05)。

3 討論

熒光染色可用于結(jié)核患者的抗酸桿菌檢驗(yàn)工作，如結(jié)核桿菌或麻風(fēng)桿菌，操作簡便，觀察結(jié)果更為迅速，陽性率較抗酸染色法高［4，5］，也有文獻(xiàn)［6］報(bào)道熒光染色法檢測痰中結(jié)核桿菌的靈敏度高，特異性與準(zhǔn)確率也較高。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其結(jié)果的可靠性，我們采用熒光染色和抗酸染色兩種方法對250例痰標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測。從結(jié)果可以看出經(jīng)痰結(jié)核菌涂片的熒光染色陽性率高于抗酸染色，這與國內(nèi)的其他報(bào)道［7，8］相符合。熒光染色組抗酸桿菌(+)的陽性率高于抗酸染色組，而(++)、(+++)、(++++)的陽性率兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這表明熒光染色和抗酸染色陽性率差異主要體現(xiàn)在(+)陽性率上，即含菌量較少的標(biāo)本。這對于那些病變活動(dòng)輕微，排菌量較少的肺結(jié)核病的診斷具有重要意義。熒光染色和抗酸染色的原理相同，都利用了結(jié)核桿菌的嗜石炭酸性，在染色劑中加入了石炭酸作為媒染劑，熒光染色的陽性率高于抗酸染色，原因是某些長期服用藥物的患者結(jié)核桿菌的抗酸性被破壞，但熒光染色性仍保留，結(jié)果在抗酸染色中為陰性，而在熒光染色中呈陽性。通過熒光染色可明顯提高陽性檢出率，有利于臨床診斷。文獻(xiàn)報(bào)道，熒光染色法的特異性為93.8%，假陽性率為7%［9，10］，均優(yōu)于抗酸染色。另外，由于熒光染色僅需要在40×的高倍鏡下觀察，視野大，對陰性結(jié)果的判讀僅需選取50個(gè)視野內(nèi)未發(fā)現(xiàn)桿菌即可，顯著加快了鏡下檢查的速度和判讀，結(jié)果報(bào)告變得簡單、快捷［11］，能夠滿足臨床大量標(biāo)本初篩及迅速出結(jié)果以供臨床早期對癥治療的要求。

熒光染色鏡檢中需要注意的問題:①鹽基淡黃熒光染液應(yīng)新配制避光保存，使用時(shí)間不宜超過1周，以免熒光減退。染色時(shí)嚴(yán)禁缸染，應(yīng)單獨(dú)進(jìn)行染色，以防交叉污染，造成假陽性。②脫色時(shí)間不宜超過2 min，脫色時(shí)間過長背景過暗，影響鏡檢結(jié)果，脫色時(shí)間過短熒光染料脫色不完全，容易造成假陽性。③熒光染色后涂片應(yīng)24 h內(nèi)鏡檢完畢，否則熒光減退，影響陽性檢出率。④熒光染色鏡檢時(shí)應(yīng)認(rèn)真觀察抗酸桿菌的形態(tài)，應(yīng)具備抗酸染色工作經(jīng)驗(yàn)后方可進(jìn)行。對于用20×物鏡50個(gè)視野內(nèi)發(fā)現(xiàn)1～9條抗酸桿菌者，應(yīng)以抗酸染色復(fù)染該片或另取一張抗酸染色的同一標(biāo)本復(fù)驗(yàn)。⑤熒光染色鏡檢抗酸桿菌在暗色背景下會發(fā)出黃綠熒光，非常醒目容易發(fā)現(xiàn)，而且40×物鏡視野大，鏡檢速度快(通常2 min左右)，而抗酸染色100×油鏡檢視野小，鏡檢較慢(通常要4～6 min)。因此熒光染色很適合用于工作量大的單位，可提高工作效率。

可見，熒光染色法檢測結(jié)核分枝桿菌的陽性率高于抗酸染色法，尤其是在檢測排菌量少的患者中;同時(shí)熒光染色法是一種檢查靈敏度高、較為方便快捷的方法，可在結(jié)核患者的早期診斷治療中予以推廣和應(yīng)用。

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