犬瘟熱診斷方法研究進(jìn)展及應(yīng)用概況

郭偉軍 （山西隆克爾生物制藥有限責(zé)任公司 山西 太谷 030800）莫偉強(qiáng) （山西省長治市畜牧局）

犬瘟熱診斷方法研究進(jìn)展及應(yīng)用概況

郭偉軍 （山西隆克爾生物制藥有限責(zé)任公司 山西 太谷 030800）莫偉強(qiáng) （山西省長治市畜牧局）

犬瘟熱也稱犬瘟，是由副黏病毒科(Paramyxovirida e)、麻疹病毒屬(Morbillivirus)的犬瘟熱病毒(canine distemper virus，CDV)引起的危害犬科、鼬科、浣熊科及貓科動(dòng)物的一種急性、熱性、敗血性、高度接觸病毒性傳染病[1]。CD的死亡率可高達(dá)80%，素有“毀滅性傳染病”之稱[2]。CDV本病最早發(fā)現(xiàn)于18世紀(jì)后葉，1905年由Carr’e氏首次報(bào)道為病毒性疾病，1926年由Dunkin氏及Laidlaw氏兩位確定本病病原是病毒所致。我國從1972年起陸續(xù)在貂、犬和狐等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)該病。目前該病呈世界分布，我國也廣為流行，是當(dāng)前養(yǎng)犬業(yè)、毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)以及野生動(dòng)物保護(hù)事業(yè)危害最大的傳染病之一。目前CDV血清型只有一種，但根據(jù)分支上H基因氨基酸序列同源性高于95%的毒株可歸為同一基因型的原則，到目前為止CDV主要可區(qū)分為亞洲Ⅰ型(Asia-Ⅰ)、亞洲ⅠⅠ型(Asia-ⅠⅠ)、歐洲型(Europe)、美國型(USA或America)、北極型(Arctic)和疫苗型(Vaccine或OldCDVs)6個(gè)基因型[3]。前5個(gè)基因型均由CDV野毒株組成，并且均與起源于上世紀(jì)50～60年代的弱毒疫苗株在遺傳關(guān)系上存在較遠(yuǎn)距離。近年來，隨著生態(tài)環(huán)境改變和病毒的進(jìn)化，CDV自然感染的宿主范圍正在不斷擴(kuò)大[4]，已經(jīng)出現(xiàn)了人感染CDV的報(bào)道[5]。臨床上CDV感染動(dòng)物后多繼發(fā)細(xì)菌、病毒感染，癥狀多變，難以早期診斷，動(dòng)物一但發(fā)病多預(yù)后不良，因此預(yù)防及早期診斷是防治本病的最佳手段。因此，早期快速而準(zhǔn)確的檢測CDV致病毒株對有效控制CDV的流行具有重要意義。

1 病原學(xué)診斷方法

1.1 病毒的分離鑒定

CDV病毒的分離培養(yǎng)鑒定被認(rèn)為是確診該病的最根本的方法，但由于分離過程繁瑣，時(shí)間長，材料成本較高，DV對外界環(huán)境的抵抗力很弱，易被光和熱滅活，并且在發(fā)病后期由于中和抗體的出現(xiàn)，致使病毒分離成功率較低[6]。但傳統(tǒng)的病毒分離鑒定技術(shù)的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠，一般作為新方法建立的驗(yàn)證方法。常用分離和培養(yǎng)CDV病毒的有原代培養(yǎng)細(xì)胞和傳代細(xì)胞系。實(shí)驗(yàn)室CDV分離成功后，可通過動(dòng)物回歸試驗(yàn)對該病毒的毒力進(jìn)行判定，最敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是雪貂，接種后其死亡率可達(dá)100%[7]。

1.2 電鏡的病毒檢測

電鏡技術(shù)可以直觀、準(zhǔn)確的鑒別病毒，根據(jù)病毒的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和大小等不同特征，可以做出診斷。房紅瑩等[8]將離子捕獲電鏡技術(shù)與免疫電鏡技術(shù)結(jié)合起來，建立了改良離子捕獲電鏡法，效果比單純離子捕獲電鏡法好，提高了完整CDV粒子的檢測率。電鏡觀察表明犬瘟熱病毒粒子呈現(xiàn)多形性，多數(shù)為球形，病毒粒子的直徑為110～550nm之間。核衣殼呈螺旋狀，總長度為1000nm，螺旋直徑15～19nm，螺旋中心5nm的孔，螺距5～6nm，核衣殼由囊膜包裹，其內(nèi)部為M，厚約5nm，表面為H和F兩個(gè)糖蛋白組成的纖突，纖突長度為9nm[9]。該方法直觀、快速，但該方法比較復(fù)雜，一般不作為常規(guī)手段，僅限于以研究為目的的應(yīng)用。

1.3 包涵體檢查

在CDV感染的細(xì)胞中出現(xiàn)一種特征性的形態(tài)學(xué)變化包涵體(inclusion body)。這是CDV感染的重要標(biāo)志之一，可通過診斷病理學(xué)進(jìn)行檢查，這是診斷CD的重要輔助方法。采樣部位包括皮膚、眼結(jié)膜、呼吸道、肺、胃腸道、膀胱刮取物、陰道黏膜或外周血液等。在光學(xué)顯微鏡下感染細(xì)胞中常可發(fā)現(xiàn)呈紅色或暗紅色、具有清晰的邊界和勻質(zhì)的邊緣的多形性包涵體，一般呈圓形或橢圓形，也有見到呈鐮刀形而緊貼于胞核上者，存在于核內(nèi)的包涵體屬CowdryA型[10]。發(fā)現(xiàn)包涵體對診斷CD有一定的意義，但由于與狂犬病病毒、犬傳染性肝炎病毒等所形成的包涵體及細(xì)胞本身某些反應(yīng)產(chǎn)物難以區(qū)分，因此作出診斷需與其他方法結(jié)合[11]。

2 血清學(xué)診斷

2.1 傳統(tǒng)血清學(xué)試驗(yàn)

2.1.1 瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP) 自從1966年Woernle將AGP標(biāo)準(zhǔn)化以來，該方法已經(jīng)用于CDV的檢測。任文陟等[12](1994)利用犬瘟熱雞胚成纖維細(xì)胞弱毒疫苗免疫動(dòng)物制備了瓊脂擴(kuò)散抗體，并對患犬瘟熱病貉肝臟中的抗原進(jìn)行檢測，與電鏡結(jié)果相比較，陽性符合率達(dá)85.7%，陰性符合率為75%，總體符合率為90%。雖然瓊脂免疫擴(kuò)散試驗(yàn)只能粗略的對抗體進(jìn)行測定，靈敏性較差，但不需要特殊的儀器，操作簡單，適宜于在基層臨床中推廣使用。

2.1.2 病毒中和試驗(yàn)(VNT) 通常用抑制病毒檢查待檢血清中的特異性抗體和抗體效價(jià)的測定，該試驗(yàn)敏感、特異、穩(wěn)定，并一直被國內(nèi)外學(xué)者作為CDV抗體標(biāo)準(zhǔn)檢測方法，用來評價(jià)CD疫苗的免疫效果和檢測犬的抗體水平。喬貴林等[13]采用固定病毒——稀釋血清法以CD弱毒和自制的高免犬血清建立了檢測CDV抗體的中和試驗(yàn)。本方法特異性強(qiáng)、敏感性較高，穩(wěn)定性較好，是目前診斷CD和臨床上監(jiān)測犬免疫力的標(biāo)準(zhǔn)方法，但是診斷所需時(shí)間較長，工作量大，不利于CDV的快速診斷。

2.1.3 SPA直接平板協(xié)同凝集試驗(yàn) 該方法的基本原理是由于SPA能與ⅠgG的Fc片段非特異性結(jié)合，同時(shí)不影響Fab片段的活性，所以當(dāng)帶有SPA的金黃色葡萄球菌與抗體混合，再加入適量的相應(yīng)抗原，結(jié)果會(huì)使出現(xiàn)的凝集反應(yīng)更容易觀察。遇秀玲等(1998)應(yīng)用酶標(biāo)SPA(葡萄球菌A蛋白)染色法對接種CDV的Vero細(xì)胞進(jìn)行染色后發(fā)現(xiàn)，有相應(yīng)CDV抗原部位，同樣滴加CDV陽性血清的對照細(xì)胞片，未見相應(yīng)反應(yīng)。CDV MD-77株感染后3、6、9、12h，胞漿可見細(xì)小陽性顆粒(呈淡黃色至棕褐色著染)；1d后陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，多見于胞漿，胞漿亦可見大空泡；2d后壞死細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，細(xì)胞間拉網(wǎng)；3～4d后合胞體細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)，壞死細(xì)胞呈棕褐色至黑褐色；5d后陽性反應(yīng)主要見于新生細(xì)胞胞漿；6d后合胞體細(xì)胞呈大圓形，陽性反應(yīng)主要見于胞漿；7d后整個(gè)合胞體細(xì)胞呈一棕褐色大團(tuán)塊；8d后大部分細(xì)胞脫落，殘留細(xì)胞呈強(qiáng)陽性反應(yīng)[14]。該法敏感性高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，與瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)及對流免疫電泳試驗(yàn)比較，三者之間無明顯差異，且操作方法簡單、快速、節(jié)省材料，是一種CDV的早期病原診斷及流行病學(xué)調(diào)查的新技術(shù)。

2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELⅠSA)

ELⅠSA檢測法已竟被廣泛應(yīng)用與吃CDV的檢測，ELⅠSA在CDV的早期感染、持續(xù)感染中均得到應(yīng)用，并可以同時(shí)用于特異性抗原和抗體的檢測。在診斷方面，定期采血監(jiān)測正常犬中的CDV抗體的ELⅠSA效價(jià)，根據(jù)ELⅠSA抗體升高的程度判斷是否存在感染CDV。母源抗體的存在對疫苗的免疫效果產(chǎn)生影響，常應(yīng)用ELⅠSA檢測方法對疫苗免疫后血清中抗體的情況進(jìn)行調(diào)查。在敏感性方面，ELⅠSA的敏感性比較高。

2.2.1 間接ELⅠSA 該方法主要用于抗體ⅠgM和ⅠgG的檢測。付少才[15]等以犬瘟熱病毒(CDV)抗原包被酶標(biāo)板，用辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗犬ⅠgG，建立了檢測犬血清中CDV/ⅠgG抗體的間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的方法，對46只小犬進(jìn)行了抗體水平測試、犬抗CDV血清效價(jià)的測定，結(jié)果都較滿意，此方法與免疫熒光檢測方法比較，其靈敏度高，方便簡捷。Blixenkrone-Moller[16]等建立了檢測抗犬瘟熱病毒ⅠgM的ELⅠSA，用于犬和水貂的血清抗體檢測，并將檢測結(jié)果與檢測抗犬瘟熱病毒ⅠgG的ELⅠSA和病毒中和試驗(yàn)的檢測結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果表明該方法可用于犬和水貂CDV早期感染的檢測。Messling[17]等利用桿狀病毒重組表達(dá)的CDV野生分離株(2544/Han95)的N蛋白做為包被抗原，建立捕獲夾心ELⅠSA，并將其用于檢測犬血清中的ⅠgM和ⅠgG，結(jié)果表明在特異性ⅠgG的定性測定上，該方法可以替代病毒中和試驗(yàn)，并且通過對特異性ⅠgM的測定可以彌補(bǔ)病毒中和試驗(yàn)和RT-PCR在診斷急性犬瘟熱方面的不足。

2.2.2 DOT-ELⅠSA 該方法是一種以硝酸纖維素膜等固相化基質(zhì)膜為載體的ELⅠSA，用于檢測抗體或抗原，具有簡便、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果判定直觀等優(yōu)點(diǎn)，但是也存在結(jié)果判斷主觀性強(qiáng)的不足。金鑫等(2000)用建立的三抗體夾心法Dot-ELⅠSA檢測犬瘟熱病毒(CDV)抗原，其抗原最低檢出量為1.15ug/ml(0.57625ng/點(diǎn))，經(jīng)與常規(guī)ELⅠSA對104份自然感染犬的血液白細(xì)胞樣本，60份眼結(jié)膜分泌物樣本，73份脾、肝、淋巴結(jié)等臟器樣本進(jìn)行檢測，檢測的陽性率分別為92.31%、66.67%、83.56%和90.72%、63.29%、81.86%；兩種方法檢出的總陽性率分別為83.54%(198/237)和80.17%(190/237)，總陽性符合率為95.96%，表明兩者呈高度正相關(guān)(r=0.92，P＜0.01)。經(jīng)電子顯微鏡觀察驗(yàn)證比較，三抗體夾心法Dot-ELⅠSA檢測的可信度為94.74%[18]。

2.2.3 單克隆抗體(MAb)

夾心ELⅠSA 該方法利用MAb包被ELⅠSA板，具有極高的特異性。張鴻[19]等建立的單克隆抗體夾心ELⅠSA法，對純化的CDV最小檢出濃度為0.01μg/ml，敏感性接近于N-PCR法，兩種方法的符合率為85%。

2.3 膠體金試紙?jiān)\斷技術(shù)

膠體金免疫層析法是將免疫膠體金技術(shù)與層析技術(shù)有機(jī)結(jié)合起來建立的一種快速免疫學(xué)檢測技術(shù)。該技術(shù)最早用作電鏡的示蹤標(biāo)記物，并逐步應(yīng)用于禽病檢測。An[20]等利用獲得的2株單克隆抗體建立了CDV膠體金試紙條診斷技術(shù)，并用巢式PCR進(jìn)行比較，雖然敏感性(89.7%和85.7%)和特異性(94.6%和100%)略低，但其使用方便，造價(jià)低廉，所以更容易在臨床上推廣。

3 病毒RNA診斷技術(shù)

3.1 核酸雜交技術(shù)

核酸雜交技術(shù)是一種分子水平的檢測技術(shù)，是利用堿基互補(bǔ)原理檢測目的核有酸片段具有敏感性、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，其最重要的一環(huán)就是特異性探針標(biāo)記，目前常用的標(biāo)記物有同位素、生物素及地高辛等。在利用核酸雜交技術(shù)對犬瘟熱進(jìn)行診斷的應(yīng)用上，國內(nèi)報(bào)道較少，國外在這方面的研究報(bào)道較多。Oglesbee等[21]利用針對犬瘟熱病毒N蛋白設(shè)計(jì)的放射性同位素32P標(biāo)記的雙鏈DNA探針對溶細(xì)胞性病毒株(Ond-CDV)感染的Vero細(xì)胞和持續(xù)性感染細(xì)胞株(CCL64-RCDV)感染的水貂肺傳代細(xì)胞進(jìn)行原位雜交實(shí)驗(yàn)，在兩種細(xì)胞中均檢測到犬瘟熱病毒核酸，結(jié)果表明核酸探針有較高的敏感性和特異性，同時(shí)根據(jù)結(jié)果顯示可以通過減少核酸探針的長度來提高其靈敏性。Gaedke等[22]針對CDV的N蛋白的RNA分別制作了用地高辛標(biāo)記的1種單鏈RNA，2種雙鏈DNA和一種只有10個(gè)核苷酸的寡聚核苷酸鏈的探針，對感染了CDV的Vero細(xì)胞和犬的組織進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，結(jié)果表明在三種核酸探針中，單鏈RNA探針是目前檢測組織中CDV RNA 最敏感的探針。核酸雜交技術(shù)含量要求較高，操作繁瑣，受多種反應(yīng)條件的影響，難于臨床推廣。王宏俊等[23]根據(jù)犬瘟熱病毒(CDV)基因序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在其編碼核衣殼蛋白的高度保守基因區(qū)內(nèi)，設(shè)計(jì)合成一對特異性引物。以RT-PCR技術(shù)從CDV基因中擴(kuò)增出了一段長度為430bp的核有酸cDNA，并制備出地高辛標(biāo)記的CDV核酸探針。特異性檢測結(jié)果表明，該探針能與CDV標(biāo)準(zhǔn)株和地方分離株核酸發(fā)生特異性雜交，而與對照的NDV、MV等病毒的核酸雜交反應(yīng)均為陰性。敏感性檢測結(jié)果表明，該探針對CDV的檢出量可達(dá)到011pg。用所制備的核酸探針對某寵物診所疑似犬瘟熱病例進(jìn)行臨床診斷初步應(yīng)用試驗(yàn)，表明該標(biāo)記探針完全可用于CDV的臨床檢測。

3.2 RT-PCR

PCR技術(shù)用于CDV診斷使診斷技術(shù)提高到了基因水平，該方法具有簡便快捷、敏感性強(qiáng)和特異性高的特點(diǎn)。Shin等運(yùn)用RT-PCR已能檢測出患狗外周血單核細(xì)胞中的犬瘟熱病毒的核衣殼蛋白基因(N)及運(yùn)用pRVSV載體成功表達(dá)了CDV的N基因[24,25]。李金中等[26](1999)根據(jù)Barrett報(bào)道的犬瘟熱病毒弱毒株Onderstepoort的融合蛋白(F)基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對能擴(kuò)增324bp基因片段的引物，并以此引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到了與設(shè)計(jì)片段大小和酶切位點(diǎn)相同的產(chǎn)物，且不擴(kuò)增犬細(xì)小病毒、犬腺病毒和狂犬病病毒犬的三種病原的核酸，在國內(nèi)首次建立了CDVRT-PCR診斷方法。初步研究結(jié)果表明此方法具有高度敏感、特異、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可用于犬瘟熱病毒的臨床診斷和實(shí)驗(yàn)研究。Frisk[27]等運(yùn)用建立的檢測CDV核蛋白的RT-PCR對病犬的血清、全血、腦脊液樣品進(jìn)行檢測，其檢出率分別為86%(25/29)、88%(14/16)、88%(14/16)。上述結(jié)果表明，RT-PCR的敏感性受引物序列的較大影響，但在犬瘟熱的診斷中仍不失為一種高特異性和敏感性的診斷方法，并且不受發(fā)病類型、體液免疫反應(yīng)和病毒分布的限制。在RT-PCR的基礎(chǔ)上，國外又有人將巢式PCR應(yīng)用于犬瘟熱的診斷上，并且表現(xiàn)出了更高的敏感性。Shin等[28]運(yùn)用建立的RT-PCR和巢式PCR對疑似病犬的血液、尿液、唾液和鼻腔分泌物樣品進(jìn)行檢測，其檢出率分別為50%(11/22)、50%(10/20)、20%(5/25)、22% (6/27)和82%(18/22)、75%(15/20)、56%(14/25)、70% (19/27)，結(jié)果表明巢式PCR的敏感性要高于普通的一步法RT-PCR，這與Jozwik等[29]報(bào)道的結(jié)果一致。

3.3 實(shí)時(shí)熒光PCR

近幾年來，有不少報(bào)道運(yùn)用熒光定量PCR用于傳染病的診斷，表現(xiàn)出了良好的特異性和敏感性，顯示出了較好的應(yīng)用前景。實(shí)時(shí)熒光PCR與普通PCR相比，其特異性和靈敏度都要更高。Gabriella Eliad[30]等應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR檢測CDV獲得了較高的敏感性和特異性，最小檢測量為100個(gè)RNA，未加病毒的樣品和陰性血清樣品反應(yīng)均為陰性，而且狗的各種組織和器官均可用來檢測。黃國君等[31]建立了SY BR G reenⅠ Real- time RT-PCR，該法比常規(guī)RT-PCR高103倍，用建立的Real-time RT-PCR檢測11例臨床病例，CDV陽性率為100%。對犬瘟熱弱毒活疫苗中的CDV進(jìn)行定量，其含量在1.24×105～4.88×105拷貝/頭份之間。蘇建青等[32]根據(jù)犬瘟熱病毒N蛋白基因的保守序列分別設(shè)計(jì)一對引物及其相應(yīng)的Taqman探針建立的了熒光定量PCR，反應(yīng)的靈敏度為10TCⅠD50。FQ-PCR具有快速、靈敏和穩(wěn)定的特點(diǎn)，適用于臨床樣品的檢驗(yàn)。

3.4 基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項(xiàng)高新技術(shù)。DNA芯片技術(shù)檢測疾病具有高通量、并行性和結(jié)果判讀客觀、準(zhǔn)確和信息化的特點(diǎn)。張偉[33]等應(yīng)用基因芯片、ELⅠSA診斷試劑、病毒分離和PCR方法，對258份疑似病料進(jìn)行了檢測效果的對比研究。研究結(jié)果表明，應(yīng)用基因芯片方法對CDV檢測率比ELⅠSA法分別高出23.4%?；蛐酒ㄍ《痉蛛x法、免疫法的符合率低，差異極顯著(P＜0101)，與PCR法符合率在90%以上，靈敏度平均要高出4.8%。

3.5 環(huán)介導(dǎo)逆轉(zhuǎn)錄等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)

RT-LAMP技術(shù)室建立在基礎(chǔ)PCR基礎(chǔ)上的一種新型的核酸檢測的方法，具有簡便、快速高效、敏感性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。Cho[34]等采用RT-LAMP 技術(shù)檢測CDV 基因組，以RT-PCR相對比，敏感性達(dá)100%，特異性為93.3%，但其檢測時(shí)間更短，僅用1h，還可以進(jìn)行位點(diǎn)檢測。胡嘉欣等[35]建立了CDV RT-LAMP檢測方法，可以檢測到RNA的濃度為5.6×10-6ng/UL，試驗(yàn)過程比RT-PCR縮短了1.5h，靈敏度高103倍，具有極高的靈敏性。該方法具備耗時(shí)短、靈敏度高、簡單易行等特點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)室快速診斷中是一種檢測CDV的有效方法。

4 小結(jié)

目前CDV病原學(xué)診斷、血清學(xué)診斷、分子生物學(xué)檢測的方法在廣度和深度上已經(jīng)有了很大的發(fā)展，但是各種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，每一種方法都很難做到，快速、簡便、靈敏、特異、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用。因此對CDV感染的診斷必須建立在臨床初步診斷的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室診斷手段，快速確定病原，然后根據(jù)判定結(jié)果，制定相對應(yīng)的免疫程序，達(dá)到快速防治CDV感染的目的。

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