乳腺腫瘤微鈣化與納米細(xì)菌的關(guān)系

李 濤 潘曉燕 陳海鳴 張 偉

納米細(xì)菌(nanobacteria,NB)是目前已知的最小的有細(xì)胞壁的細(xì)菌,它通過(guò)產(chǎn)生磷灰石結(jié)晶使體內(nèi)多種細(xì)胞發(fā)生病理性鈣化[1]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)納米細(xì)菌與多種惡性腫瘤的鈣化有密切的關(guān)系[2-3],但尚未有明確研究報(bào)道乳腺癌微鈣化與納米細(xì)菌的關(guān)系。為此，我們采用ELASA法和免疫組化法研究納米細(xì)菌和乳腺癌微鈣化的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

收集上海市閘北區(qū)市北醫(yī)院和南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院2011年6月-2012年6月的乳腺疾病手術(shù)患者共110例，均為女性。依據(jù)良惡性及有無(wú)鈣化分為4組：A組為惡性伴鈣化組，30例，平均年齡55.6歲。B組：惡性無(wú)鈣化組，30例，平均年齡52.2歲。C組：良性伴鈣化，20例，平均年齡37.5歲。D組：良性無(wú)鈣化，30例，平均年齡31.2歲。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集 分別采集上述患者的血清及病灶組織標(biāo)本。

1.2.2 主要試劑 鼠抗納米細(xì)菌單克隆抗體8D10(10 μg/ml) 購(gòu)自芬蘭Nanobac OY 公司,ELASA Kit 購(gòu)自KPL公司，生物素化羊抗鼠IgG、ABC試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自武漢博士德公司。

1.2.3 血清納米細(xì)菌感染的檢測(cè) ELASA法：①將血清標(biāo)本于-70 ℃解凍,取50～100 μl按1∶4用抗原包被液稀釋。②取100 μl包被液至各孔，4 ℃ 18～24 h或37 ℃孵育4 h，洗滌液洗3次，每次3 min(陽(yáng)性對(duì)照按1∶25稀釋，每次設(shè)一陰性對(duì)照)。③加入封閉液每孔200 μl，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次3 min。④各孔加入鼠抗納米細(xì)菌單克隆抗體100 μl，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次3 min。⑤各孔加入羊抗小鼠IgG 100 μl，37 ℃孵育1 h，洗滌液洗3次，每次3 min，最后一遍浸泡5 min。⑥每孔加入100 μl底物復(fù)合液，37 ℃避光顯色至滿意，5～15 min后加入終止液50 μl，在20 min內(nèi)用酶標(biāo)儀自動(dòng)測(cè)定結(jié)果，波長(zhǎng)405 nm。判斷標(biāo)準(zhǔn)：以測(cè)定標(biāo)本孔的吸收值與一組陰性標(biāo)本測(cè)定孔平均吸收值的比值大于2判斷為陽(yáng)性。

1.2.4 組織納米細(xì)菌的檢測(cè) 免疫組化染色檢測(cè)，SABC法。判斷標(biāo)準(zhǔn)：在高倍視野下可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)內(nèi)或細(xì)胞外微小的棕黃色顆粒者為納米細(xì)菌感染的組織或細(xì)胞或納米細(xì)菌本身。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS11.0軟件分析，采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05 。

2 結(jié)果

2.1 各組患者血清中納米細(xì)菌感染率

患者血清中納米細(xì)菌感染率A組73.3%(22/30)，B組10.0%(3/30)，C組5.0%(1/20)，D組6.7%(2/30)。A組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B、C、D組組間比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 各組患者組織中納米細(xì)菌感染率

患者組織中納米細(xì)菌感染率A組93.3%(28/30)，B組13.3%(4/30)，C組5.0%(1/20)，D組0.0%(0/30)。A組與其他各組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，B組與C、D組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C、D組組間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

乳腺組織的鈣化是很常見(jiàn)的。在乳腺癌當(dāng)中，伴有微鈣化的占40%～50%，良性疾病的鈣化也有約20%[4]。乳腺良惡性鈣化的成分和分布是不同的，惡性鈣化幾乎都為羥磷灰石，且腫瘤壞死區(qū)域最多。良性鈣化主要為草酸鈣，且多數(shù)不伴壞死，而草酸鈣只能由活性細(xì)胞分泌。本組資料也發(fā)現(xiàn)NB主要分布于惡性腫瘤的壞死區(qū)域，包括B組4例NB陽(yáng)性的標(biāo)本均是伴有明顯壞死。而良性的2組均不伴壞死。這些證據(jù)提示良惡性乳腺腫瘤鈣化的形成機(jī)制可能不同。

NB的1個(gè)重要特性就是它通過(guò)產(chǎn)生磷灰石結(jié)晶使體內(nèi)多種細(xì)胞發(fā)生病理性鈣化。目前的許多研究已證實(shí)它與多種鈣化性疾病密切相關(guān)，如泌尿系結(jié)石，膽道結(jié)石，動(dòng)脈硬化等，并且與卵巢惡性腫瘤的砂粒體形成有關(guān)[2-3，5-6]。國(guó)內(nèi)唐中華等通過(guò)電鏡觀察20例乳腺癌標(biāo)本，其中19例觀察到了納米細(xì)菌樣顆粒的存在[7]。本研究A組血清及組織中NB的感染率均明顯高于其他組，說(shuō)明NB與乳腺癌鈣化有密切的關(guān)系。提示NB感染可能與乳腺癌微鈣化的形成有關(guān)，而與良性鈣化的形成無(wú)關(guān)。而惡性無(wú)鈣化組的感染率高于良性組我們認(rèn)為可能是部分感染的病例是早期尚未形成鈣化灶。

對(duì)于乳腺癌微鈣化形成的具體機(jī)制目前尚不完全清楚，現(xiàn)有的主要觀點(diǎn)包括：①組織壞死或營(yíng)養(yǎng)不良；②腫瘤細(xì)胞的分泌；③鈣泵或鈣調(diào)蛋白的功能失調(diào)；④壞死組織或細(xì)胞碎片的礦化等。這些觀點(diǎn)相互之間難以連貫。Ciftcioglu等研究發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤都存在NB黏附受體，可以介導(dǎo)NB的進(jìn)入，并且導(dǎo)致隨后腫瘤的鈣化，這一理論經(jīng)von Kossa染色證實(shí)[8]。NB的感染如果是乳腺癌微鈣化的關(guān)鍵因素，則有可能將上述的觀點(diǎn)很好的串聯(lián)起來(lái)：乳腺癌腫瘤細(xì)胞是否也會(huì)表達(dá)NB的粘附分子從而介導(dǎo)NB的進(jìn)入，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞鈣代謝失調(diào)，進(jìn)一步造成組織壞死及微鈣化的形成。這一假設(shè)尚需進(jìn)一步研究證實(shí)，但這為解釋乳腺癌微鈣化的形成機(jī)制提供了1個(gè)新的切入點(diǎn)。

對(duì)于某些早期無(wú)腫塊的乳腺癌，微鈣化往往是唯一的陽(yáng)性發(fā)現(xiàn)。因此，微鈣化對(duì)于乳腺癌的早期診斷非常有意義。但判斷鈣化的良惡性是比較困難的。早先研究認(rèn)為鈣化的大小，數(shù)目及分布有助于鑒別良惡性，這一觀點(diǎn)也被廣泛接受。但較近的多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)上述的某些特征對(duì)于鑒別鈣化的良惡性意義不大，鈣化灶活檢不到30%的惡性檢出率也支持這些觀點(diǎn)[9-10]。本組資料顯示，惡性鈣化組伴有NB感染的比例明顯增高，特別是血清檢測(cè)感染的比例明顯增高，而且血清ELASA檢測(cè)簡(jiǎn)便易行。因此，將NB血清感染作為1個(gè)輔助參考指標(biāo)來(lái)明確鈣化的性質(zhì)理論上是可行的。如果進(jìn)一步的研究能獲得證實(shí)，將有助于提高判斷鈣化良惡性的正確性，從而避免許多患者接受不必要的活檢。本組數(shù)據(jù)除A組外各組的血清NB感染率均低于國(guó)外報(bào)道14%的健康人群的感染率；B組血清感染率略高于國(guó)內(nèi)報(bào)道的健康人群8%的感染率，C、D兩組則稍低?？赡芘c良惡性兩組的平均年齡相差較大有關(guān)，國(guó)內(nèi)外的資料均提示隨著年齡的增加，NB感染的比例也會(huì)增高[11]。

文獻(xiàn)報(bào)道伴有鈣化的乳腺癌侵襲性強(qiáng)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的發(fā)生明顯高于無(wú)鈣化的病例，預(yù)后相對(duì)較差[12]。張家云等也報(bào)道伴鈣化的乳腺癌患者合并HER-2陽(yáng)性的比例明顯增加，病程多較晚[13]。這些均提示鈣化的形成可能與腫瘤的惡性程度及病程發(fā)展相關(guān)。Cooke等的研究顯示羥磷酸鹽不僅能刺激細(xì)胞的有絲分裂，加快腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且能誘導(dǎo)癌細(xì)胞穿透基膜而發(fā)生轉(zhuǎn)移[14]。鈣代謝異?？赡苁前殁}化乳腺癌預(yù)后差的原因。NB是否在伴鈣化的乳腺癌的發(fā)展過(guò)程中扮演了重要的角色是個(gè)值得研究的方向，并且也可能為乳腺癌的治療提供了1個(gè)新的靶點(diǎn)。

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