實驗室內(nèi)質(zhì)量控制與食源性致病菌盲樣分離鑒定

蔡劍輝，李貽漢，何小媚 (廣東省深圳市龍華新區(qū)疾病預(yù)防控制中心，廣東 深圳 518109)

能力驗證是檢查實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制是否有效的一項重要活動，在提高實驗室檢驗水平和發(fā)現(xiàn)實驗室存在問題，保證微生物檢驗質(zhì)量等方面均有重要意義。為此本中心檢驗室參加了湘粵兩地疾控系統(tǒng)2012年度食源性致病菌能力驗證活動，取得滿意結(jié)果?，F(xiàn)將實驗室內(nèi)質(zhì)量控制與盲樣分析結(jié)果報告如下。

1 實驗室內(nèi)質(zhì)量控制

1.1 儀器設(shè)備監(jiān)控:水浴箱、培養(yǎng)箱按要求調(diào)至所需溫度至±1℃范圍內(nèi)。生物安全柜經(jīng)計量部門檢定合格，每天開始前檢驗并做好記錄。

1.2 高壓蒸氣滅菌器:每次清毒時放置化學(xué)指示膠帶，以條帶顯色為滅菌符合要求［1］。

1.3 對所有自配培養(yǎng)菌和商業(yè)成品培養(yǎng)基都做了無菌記錄，并用陽性菌株和陰性菌株進行驗證試驗，達到預(yù)期要求方可使用。

1.4 診斷血清和染色液:都用陽性標菌株和陰性菌株進行驗證，并做好記錄，每次使用血清前，觀察是否透明，色澤是否渾濁。

2 盲樣檢驗方法及步驟

2.1 質(zhì)控樣品:半固體樣品1支，編號為G－16，要求進行沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、臘樣芽胞桿菌、大腸埃希菌O157、單核增生性李斯特菌檢驗。

2.2 檢驗依據(jù):食品微生物學(xué)檢驗國家標準檢驗方法和衛(wèi)生防疫細菌的檢驗方法［2－4］。

2.3 培養(yǎng)基及試劑:營養(yǎng)肉湯、GN增菌液、Sc增菌液、TTB增菌液、7.5%NaCl肉湯、改良EC肉湯、LB1增菌液、LB2增菌液、血平板、普通營養(yǎng)瓊脂、HE瓊脂、XLD瓊脂、三糖鐵培養(yǎng)基、沙門顯色平板、CT－MAC瓊脂、Baird－parKer平板、大腸埃希菌O157顯色平板、MYP瓊脂、PALCAM瓊脂及各種成套細菌微量生化鑒定盒，均由廣東環(huán)凱生物科技有限公司提供;所用診斷血清均由寧波天潤生物藥業(yè)有限公司提供。所有培養(yǎng)基試劑、診斷血清均在有效期內(nèi)。

2.4 方法

2.4.1 用無菌手續(xù)打開質(zhì)控盲樣半固體，用接種環(huán)混均樣品，取樣品分別接種營養(yǎng)肉湯、GN增菌液、Sc、TTB、改良EC肉湯、7.5%NaCl肉湯、LB1、LB2進行增菌，結(jié)果見表1。

2.4.2 取半固體盲樣直接革蘭染色，鏡檢可見革蘭陰性桿菌和革蘭陽性短桿菌。

表1 增菌結(jié)果

2.4.3 取增菌后的培養(yǎng)液，按照食品微生物檢驗方法，分別接種沙門菌顯色平板、HE瓊脂平板、XLD瓊脂平板、大腸埃希菌O157顯色平板、CT－MAC瓊脂、血平板、Baird－parker平板、MYP瓊脂、PALCAM瓊脂，作分離培養(yǎng)，平板分離結(jié)果見表2。

2.4.4 從沙門菌顯色平板、HE平板、XLD平板上挑取疑似沙門菌菌落接種三糖鐵瓊脂斜面和營養(yǎng)瓊脂平板，經(jīng)36℃ 18 h培養(yǎng)后，在三糖鐵瓊脂平板上生化反應(yīng)為:斜面不變色(－)、底層變紅(+)、產(chǎn)氣、H2S(+).挑取營養(yǎng)瓊脂純培養(yǎng)物接種沙門菌生化鑒定盒，生化結(jié)果為:甘露醇(+)、賴氨酸(+)、尿素(－)、山梨酸(+)、KCN(－)、ONPG(－)、定基質(zhì)(－)、H2S(+)。沙門菌血清學(xué)診斷鑒定結(jié)果:A－F多價: (+++)、O9:(+++)、Hp:(+++)、hm:(－)、vi:(－)、Hg:(+++)、鹽水對照:(－)，根據(jù)革蘭染色、平板菌落特點、生化試驗、血清學(xué)診斷結(jié)果，判定從該質(zhì)控盲樣中檢出都柏林沙門氏菌。

表2 平板分離結(jié)果

2.4.5 根據(jù)PALCAM瓊脂平板上菌落特點，挑取疑似單核增生性李斯特菌菌落，革蘭染色為革蘭陽性短小桿菌。用TSA－YE平板劃線分純后，動力試驗為傘狀生長;接種單核增生性李斯特菌生化鑒定管，生化結(jié)果為:葡萄糖(+)、鼠李糖(+)、麥芽糖(+)、VP(+)、七葉苷(+)、甘露醇(－)、木糖(－);溶血試驗為:狹小、透明溶血環(huán)。根據(jù)生化結(jié)果、溶血試驗，判定從該質(zhì)控盲樣中檢出單核增生性李斯特菌。

3 討論

3.1 質(zhì)量控制工作在微生物檢驗工作中地位十分重要，它受到一系列因素的影響。從樣品采集、保存運輸、檢驗器材的驗收、儀器校準、環(huán)境條件、培養(yǎng)基無菌驗證和質(zhì)控、標準菌株和診斷血清的驗證，其中任何一環(huán)發(fā)生偏差，都可能導(dǎo)致最終結(jié)果的錯誤。

3.2 Baird Parker平板是金黃色葡萄球菌分離鑒定的選擇培養(yǎng)基。質(zhì)控盲樣在該平板上形成極細小的黑色菌落，但無渾濁帶和透明環(huán)，要注意與金黃色葡萄球菌相區(qū)別。

3.3 此次質(zhì)控盲樣之所以選用營養(yǎng)肉湯、Sc、TTB、GN、7.5% NaCl肉湯、改良EC肉湯和LB1、LB2增菌液，是因為該次質(zhì)控考核，只要求做沙門菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌O157、蠟樣芽孢桿菌、單核增生性李斯特菌。在實際工作中，應(yīng)根據(jù)工作需要選擇不同的增菌培養(yǎng)基，如發(fā)生食物中毒，需考慮各種致病菌時，還應(yīng)當選擇如小腸結(jié)腸耶爾森氏菌增菌用的改良磷酸鹽緩沖液，空腸彎曲菌增用的boltou肉湯，霍亂增菌用的堿胨水，副溶血性弧菌增菌用的3%NaCl堿胨水等增菌液。

3.4 對混合盲樣半固體直接涂片，是為了觀察細菌形態(tài)、排列方式、染色性質(zhì)、初步判斷可能存在的致病菌，為下步檢驗打好基礎(chǔ)。

3.5 顯色培養(yǎng)基是近年來發(fā)展起來的一種新的培養(yǎng)基，現(xiàn)在大多數(shù)細菌都有其對應(yīng)的顯色培養(yǎng)基，如沙門菌顯色培養(yǎng)基、弧菌顯色培養(yǎng)基、大腸埃希菌O157顯色培養(yǎng)基、致瀉性大腸埃希菌ECC顯色培養(yǎng)基、空腸彎曲菌CCDA顯色培養(yǎng)基等，當細菌生長代謝過程中產(chǎn)生特異性酶分解特異性反應(yīng)底物后，目標菌形成不同顏色的菌落［5］。與傳統(tǒng)培養(yǎng)基相比，顯色培養(yǎng)基更容易觀察，更好辨認，大大提高了微生物檢驗工作效率，尤其在突發(fā)公共衛(wèi)生事件中，為盡快找查致病因素發(fā)揮重要作用。

［1］ 姜瑞霞，張 巖.供應(yīng)室的感染管理及控制［J］.吉林醫(yī)學(xué)，2013，34(2):359.

［2］ 衛(wèi)生部GB/T4789－2003食品微生物檢驗［S］.北京:中國標準出版社，2003:1－35.

［3］ 衛(wèi)生部GB/T4789－2008食品微生物檢驗［S］.北京:中國標準出版社，2008:1.

［4］ 衛(wèi)生部GB4789－2010食品安全國家標準食品微生物檢驗［S］.北京:中國標準出版社，2010:1.

［5］ 王曉梅.微生物實驗室盲樣考核質(zhì)控報告［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2013，(6):124.