促進(jìn)植物生長(zhǎng)根圈細(xì)菌(PGPR)的研究現(xiàn)狀

何鐵光， 楊雯馨， 林崇寶， 何永群，張 野， 韋彩會(huì)， 李婷婷

(1.廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)資源與環(huán)境研究所，廣西 南寧530007;2.沅渼生物科技股份有限公司，中國(guó) 臺(tái)灣42057)

在糧食增產(chǎn)的壓力下，化學(xué)肥料與農(nóng)藥被大量使用，造成環(huán)境遭受極大壓力，如環(huán)境激素問題、水體富營(yíng)養(yǎng)化問題等，不僅造成環(huán)境污染、生態(tài)破壞，最后也會(huì)經(jīng)食物鏈造成食品安全等問題，使人類健康遭受威脅，如生長(zhǎng)發(fā)育問題，并造成種種社會(huì)問題.而有機(jī)農(nóng)業(yè)所追求的是與自然界達(dá)成平衡，利用生物性的制劑逐步替代化學(xué)性的制劑已成為近代農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要方向. 因此，好的微生物制劑具有多重功效，如植物保護(hù)、促進(jìn)開根、增加植物抗性基因的表達(dá)、生長(zhǎng)因子的分泌、促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)源的吸收、改善重金屬及化學(xué)有機(jī)物多環(huán)芳香族的污染問題.而植物病害產(chǎn)生的原因大多起因于土壤問題，如病原菌持續(xù)留存在土壤中，致使農(nóng)作物在輪作時(shí)造成植物的再次放大與感染，細(xì)究其主因是生物相的不平衡，在易受病害的土中其微生物相對(duì)而言較為單純. 而這些土壤的微生物具有溶磷作用、固氮作用、增強(qiáng)植物抗病、增強(qiáng)營(yíng)養(yǎng)吸收等作用，因此，一般稱為促進(jìn)植物生長(zhǎng)根圈細(xì)菌(PGPR)［1］.這些土壤菌與植物根系形成生物圈，共同經(jīng)營(yíng)生存環(huán)境，如分泌水解酵素，提升磷及氮、鉀、鐵溶解性，幫助植物吸收微量元素，此外透過植物根部的誘導(dǎo)，植物體啟動(dòng)防御機(jī)制，表現(xiàn)抗性基因，如經(jīng)NPR1 途徑經(jīng)SAR 或ISR 誘發(fā)PR1a、Gns1 (1，3;1，4-β-glucanase)、Cht-1 (chitinase)、PR4、PR5 和PR10a、PPO等基因的表現(xiàn)造成全株植物產(chǎn)生抗性抵御病原入侵［2，3］.另外植物根圈微生物的建立可降低土壤中病原菌數(shù)量，在植物根圈的微生物可促進(jìn)植物產(chǎn)生抗性，增加植物的免疫能力，此種抗性為系統(tǒng)性的，亦稱為誘發(fā)性系統(tǒng)抗性(induced systemic resistance，ISR)［3］，如Bacillus pumilus、Bacillus mycoides. 而從植物根圈所篩出的微生物，可有效的防治真菌、線蟲、病毒、昆蟲及細(xì)菌等危害.發(fā)展多功效的PGPR，及找出最適植物的配方，是有機(jī)農(nóng)業(yè)發(fā)展上的較佳解決之道，因此，最好的方式是對(duì)生態(tài)有所認(rèn)知，利用永續(xù)農(nóng)業(yè)(sustainable agriculture)的觀念進(jìn)行作物培育.其中，有機(jī)農(nóng)業(yè)(organic farming)是最好的方法，透過天然的方式進(jìn)行作物培育，利用有機(jī)質(zhì)肥料，不使用化學(xué)性的肥料、農(nóng)藥、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，改用生物性的肥料、農(nóng)藥、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，并配合如輪作、間作等耕作方式，進(jìn)行農(nóng)業(yè)生產(chǎn)管理，以達(dá)純凈農(nóng)業(yè)的目的.已知這些PGPR 可增加農(nóng)作物的產(chǎn)量，如促進(jìn)作物之發(fā)芽、或是作物的生長(zhǎng)及提升產(chǎn)，目前在一些研究中已獲得成果，例如糧食作物:水稻、花生、小麥、大豆、玉米;根莖類作物:馬鈴薯、甜菜及蘿卜等;葉菜類作物:油菜、小白菜;水果類作物西紅柿等農(nóng)作物［4，5］. 此外，PGPR 若能產(chǎn)生抗性物質(zhì)則稱為Antibiosis-Biological Control Agent (BCA)，可抑制病原菌生長(zhǎng)［6］. 而除抗生素外，這些微生物會(huì)和病原菌競(jìng)爭(zhēng)鐵離子、糖類及其它孢子萌發(fā)所需的物質(zhì)，并占據(jù)空間或捕食，如木霉菌的寄生作用、枯草菌可穿透線蟲. PGPR 微生物亦可改變植物的生理功能，如蒸散作用、營(yíng)養(yǎng)吸收、固氮作用、影響荷爾蒙的產(chǎn)生等.而大多數(shù)與植物共存的PGPR，其生理功能是屬于多重機(jī)制所造成的影響，PGPR 常見的屬為Achromobacter、Arthrobacter、Azospirillum、Azotobacter、Bacillus、Burkholderia、Clostridum、Hydrogenophaga、Microbacterium、Paenibacillus、Serratia、Staphylococcus 及Streptomyces［1］. 近年來，因高速定序發(fā)展快速，使得對(duì)土壤中的菌群的研究得以進(jìn)一步的得知其細(xì)菌群的量及其基因表現(xiàn)的情形，可較清楚了解不同植物根圈中微生物相的變化，藉此可更清楚了解植物的生長(zhǎng)特性與微生物互動(dòng)的情形，更可經(jīng)由transcriptome 來了解PGPR 在植物中扮演的角色，微生物如何透過植物上的受體達(dá)到促進(jìn)植物生長(zhǎng)的效果，此外可經(jīng)由基因體定序，分析主要的PGPR 物種上的基因序列，如Bacillus sp. 經(jīng)基因體定序后可得知其與植物體互動(dòng)的基因［7］.

PGPR 微生物是近代有機(jī)農(nóng)業(yè)的一項(xiàng)重要變革，然而，要考慮的是微生物本身在大量使用下或許會(huì)對(duì)生態(tài)造成沖擊，因此合適的配方與合適的使用才能不致造成環(huán)境污染. 而PGPR 微生物的特點(diǎn)是針對(duì)特定植物群有專一性，因此當(dāng)植物改變時(shí)，PGPR 在土壤的優(yōu)勢(shì)會(huì)消失，微生物對(duì)生態(tài)產(chǎn)生的沖擊會(huì)很小，所以，針對(duì)植物的生長(zhǎng)特性開發(fā)適合的微生物制劑日顯重要. 在市場(chǎng)上，針對(duì)不同的植物營(yíng)養(yǎng)源可分為固氮菌、溶磷菌、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等需求，此外，一些真菌類的土壤制劑在市場(chǎng)上亦可見到，如木霉菌、白僵菌、黑僵菌，木霉菌同時(shí)兼具生物防治及溶磷作用［8］，白僵菌及外生菌根菌、蟲生真菌亦具有溶磷作用［9］，在使用時(shí)可減少病害外，同時(shí)可調(diào)節(jié)土壤中的磷肥. 而大多數(shù)的微生物可分泌一些聚合物如β-葡聚醣、γ-聚麩胺酸等物質(zhì)，可提高土壤保水性. 此外，微生物所產(chǎn)生的有機(jī)酸可中和土壤，并可緩慢釋出離子、提高營(yíng)養(yǎng)元素的可利用率，不致使?fàn)I養(yǎng)源流失，如Pseudomonas sp.可分泌lipopolysaccharide［10］，而Bacillus sp. 可分泌γ-聚麩胺酸［11］.生物性肥料，其肥效高低，除了菌種本身的能力外，菌種配方與組成也是關(guān)鍵因素之一，特別是多種菌株的有效組合，及其在環(huán)境中的生長(zhǎng)與植物的互動(dòng)，是提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)值的關(guān)鍵技術(shù)［12］.

1 PGPR 的應(yīng)用

PGPR 可視為有益微生物，而這些生物種類多元，如Azotobacter、Azomonas、Beijerinckia、Derxia 和Rhizobium 為常見的非共生型固氮菌.固氮菌可分為共生、附著及游離三種，固氮菌可減少氮肥的使用，可將空氣中的氮以nitrogenase 催化銨態(tài)氮源;此外，一些光合菌及好氣菌藍(lán)綠藻，亦具有nitrogenase，可提高土壤中的氮肥，如Anabaena、Gloeothece、Nostoc、Oscillatoria、Rhodopseudomonas、Synechococcous、Rhodospirillum、Chlorobium 和Chromatium 等屬的微生物，可進(jìn)行光合作用固氮作用，減少對(duì)氮肥的依賴.磷肥在使用后會(huì)流失在土壤中，大部分的磷元素與土壤中的鈣、鎂、鋁、鐵結(jié)合后呈現(xiàn)不溶形態(tài)的復(fù)合物，而PGPR 中有許多物種可產(chǎn)生有機(jī)酸或離子嵌合劑，將土壤中存在的磷酸鋁、磷酸胺鎂、磷酸鈣及磷酸鐵等磷酸復(fù)合體溶解，經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化為有機(jī)磷，提供植物營(yíng)養(yǎng).常見的菌屬如Achromobacter、Aerobacter、Alcaligenes、Azotobacter、Bacillus、Beijerinckia、Bradyrhizobium、Brevibacterium、Erwinia、Flavobacterium、Micrococcus、Nitrosomonas、Pseudomonas 和Xanthomonas.這些PGPR 微生物常由健康植株中的土壤環(huán)境所篩選，制劑中含有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的活性微生物體或孢子，而制劑的配方可混合細(xì)菌、放線細(xì)菌、真菌、光合細(xì)菌及其發(fā)酵代謝產(chǎn)物等所制成的生物制劑.

此外，如放線菌、真菌等，亦有相當(dāng)多的屬種可作為PGPR 微生物. 這些微生物除具有生物肥料能力外，亦具有保護(hù)植物的多種機(jī)制，如Pseudomonas所具有的脂多醣可誘發(fā)植物的抗病能力;而Bacillus可分泌拮抗物質(zhì)如fengycin、surfactin 可抗真菌. 而PGPR 在具有拮抗病害能力的有些菌種也同時(shí)具有生物性肥料的功能，PGPR 拮抗的病原菌可包括Erwinia chrysanthemi 、Ralstonia solanacearum 、Xanthomonas campestris pv. Vesicotoria［15］、Xanthomonas campestris pv. Campestris［16］、Xanthomonas campestris pv.Citri［17］等.PGPR 可作為良好的生物防治用藥［18］，保護(hù)植物不受病菌的侵襲，可歸于下列幾項(xiàng)因素:抗生物質(zhì)的作用、誘發(fā)植物抗病性、競(jìng)爭(zhēng)作用、營(yíng)養(yǎng)源限制等因素. 如:pyochelin［19］作為鐵離子嵌合劑可限制其它微生物生長(zhǎng);pyocyanin［20］、butyrolactones、kanosamine、DAPG、phenazine-1-carboxyclic acid、2，4-diacetyl phloroglucinol、oomycin、pyoluteorin、pyrrolnitrin、zwittermycin-A、pantocin 等可作為抗生物質(zhì);其它如N-acyl-L-homoserine lactones(AHL)，可作為植物的抗性誘發(fā)劑［21］. 有些PGPR在植物根圈的微生物相可經(jīng)產(chǎn)生激素，如IAA/cytokin 來促進(jìn)植物發(fā)育;也有微生物可產(chǎn)生水解酵素，如蛋白酶、脂肪分解酶、纖維素酶及核酸分解酶，分解大分子化合物;此外PGPR 可產(chǎn)生有機(jī)酸中和土壤中的離子營(yíng)養(yǎng)源或亦可將營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在菌群中消長(zhǎng)，達(dá)到延長(zhǎng)營(yíng)養(yǎng)素在土中的停留期，協(xié)助植物獲取養(yǎng)分;另外亦有的菌群會(huì)分泌抗性物質(zhì)，降低病原菌危害. 在植物的根圈，大多數(shù)微生物透過吸附、固定在植物體上，亦有與植物形成共生等方式，如內(nèi)生菌的方式，產(chǎn)生特定物質(zhì)，促進(jìn)植物生長(zhǎng).

人類的生活富足后，所追求的是永續(xù)，加上健康及環(huán)保意識(shí)抬頭，有機(jī)農(nóng)業(yè)成為重要的一環(huán)，而有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)量低，若不使用農(nóng)藥肥料，收成相當(dāng)有限.而在環(huán)境中有許多有用的微生物，這些微生物可取代化學(xué)性肥料，作為生物性肥料(Biofertilizer)［22］. 微生物制劑的生物肥料，可施用在種子、幼苗或土壤等，可增進(jìn)土壤營(yíng)養(yǎng)狀況或改良土壤之理化、生物性質(zhì)，協(xié)助植物吸收營(yíng)養(yǎng)，改善農(nóng)作物抗性，增加產(chǎn)量及提升質(zhì)量. 而生物性肥料的使用與生物技術(shù)的應(yīng)用有重大的關(guān)聯(lián)性，因此將傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)提升成為生技產(chǎn)業(yè)中重要的一環(huán). 生物肥料所使用的生物技術(shù)主要有菌種的分子鑒定，技術(shù)包括16S DNA 序列分析、16S-23S ITS 序列、DDGE、qPCR、RAPD、SSCP、TGGE、T-RFLP 及次世代基因體定序等技術(shù)(NGS).因PGPR 的組成復(fù)雜，而過去的研究是將菌種一一分離進(jìn)行比對(duì)，在菌種回接后亦只能對(duì)1 至數(shù)種的微生物進(jìn)行研究，在NGS 基因定序技術(shù)開發(fā)后，在一次實(shí)驗(yàn)中可定出10 萬(wàn)到百萬(wàn)的序列，而若以16S 基因序列中的V6 區(qū)域來定序，此區(qū)域是菌種的指針區(qū)，土壤中的細(xì)菌約1 千種，NGS的定序能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于菌種的數(shù)量，可利用NGS 的技術(shù)分離及研究土壤中的主要菌群，作為PGPR 組成設(shè)計(jì)的參考，針對(duì)不同植物設(shè)計(jì)最適菌調(diào)整配方，此外NGS 亦可快速了解土壤中菌群的組成，有利于新菌種的開發(fā).

2 結(jié) 論

PGPR 是透過對(duì)自然生態(tài)的了解所開發(fā)出的產(chǎn)品，以微生物肥料作為肥料，此肥料可和植物體互動(dòng)，因在有益微生物環(huán)境下可培育出良好的有機(jī)農(nóng)作物，大多數(shù)的有益微生物其群落的成長(zhǎng)和代謝與植物體呈現(xiàn)正相關(guān)，即良好發(fā)育的PGPR 會(huì)造就植物成長(zhǎng)的良好培育環(huán)境.與化學(xué)肥料不同的是，PGPR 是以生命型式作為有效性的基礎(chǔ)，化學(xué)肥料是以氮、磷、鉀的元素為基礎(chǔ). PGPR 對(duì)有機(jī)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著重要的作用，包括土壤養(yǎng)分供應(yīng)、植物生長(zhǎng)的促進(jìn)、抗病、抗逆性、改善農(nóng)產(chǎn)品特性等.PGPR 可協(xié)助改良植物的土壤環(huán)境，抑制病原菌與植物體的互動(dòng)，而配方組合會(huì)影響植物的成長(zhǎng)，良好的菌種配方，包括菌種組成、活性、使用方法及時(shí)機(jī)，除了與植物體的互動(dòng)外，菌種與土壤的互動(dòng)也很重要. 而這些PGPR 產(chǎn)生的植物荷爾蒙如IAA［23］，cytokinin［24］或Gibberellin［25］能促使植物根系發(fā)育. 而PGPR 也成為一項(xiàng)研究重點(diǎn)，如在植物抗性基因的表達(dá)，在模式植物擬南芥的研究中，探討PGPR 的表現(xiàn)情形，認(rèn)為PGPR 從根部所誘發(fā)的基因表現(xiàn)在PR-1a 具有顯著性，其中所表現(xiàn)的基因多屬誘發(fā)型的抗性基因及訊號(hào)傳遞基因，特別是與SAR 及ISR 基因相關(guān)的表現(xiàn). 未來，可透過NGS 的技術(shù)更清楚了解PGPR 誘發(fā)植物抗性的主因，便可具有好的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行菌株、配方的評(píng)估與檢測(cè). 有機(jī)農(nóng)業(yè)是農(nóng)業(yè)永續(xù)經(jīng)營(yíng)的最好的方式，而PGPR 植物根圈細(xì)菌可降低農(nóng)藥的使用，并維持植物健康的生長(zhǎng)環(huán)境，這些根圈細(xì)菌可產(chǎn)生許多互動(dòng)因子如促進(jìn)植物生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)吸收、誘發(fā)植物抗病及平衡環(huán)境營(yíng)養(yǎng)源，而正確及適當(dāng)?shù)氖褂貌挪粫?huì)造成生態(tài)的污染及危害.

［1］Reed M;Glickz B R. Applications of Plant Growth-Promoting Bacteria for Plant and Soil Systems［J］.Applications of Microbial Engineering，2013:181.

［2］Annapurna K，Kumar A，Kumar L V. Govindasamy，V.;Bose，P.;Ramadoss，D.，PGPR-Induced Systemic Resistance (ISR)in Plant Disease Management［J］. In Bacteria in Agrobiology:Disease Management，Springer:2013:405-425.

［3］Yi H S，Yang J W，Ryu C M.ISR Meets SAR Outside:Additive Action of the Endophyte Bacillus Pumilus INR7 and the Chemical Inducer，Benzothiadiazole，on Induced Resistance Against Bacterial Spot in Field-grown Pepper［J］.Frontiers in Plant Science，2013:4.

［4］Lucas，J.A.;García‐Villaraco，A.;Ramos，B.;García‐Cristobal，J.;Algar，E.;Gutierrez-Ma?ero，J.，Structural and Functional Study in the Rhizosphere of Oryza Sativa L.Plants Growing under Biotic and Abiotic Stress. Journal of Applied Microbiology 2013，115，218-235.

［5］Dawwam，G.;Elbeltagy，A.;Emara，H.;Abbas，I.;Hassan，M.，Beneficial Effect of Plant Growth Promoting Bacteria Isolated from the Roots of Potato Plant.Annals of Agricultural Sciences 2013，58，195-201.

［6］Charalambous，A.;Tjamos，S.E.;Domazakis，E.;Paplomatas，E.J.，Incorporation into the Transplant Soil Plug of the Plant Protective Agent Paenibacillus Alvei Strain K165 Confers Protection to Melon Against Fusarium Wilt. Bio-Control 2013，58，685-692.

［7］Song，J. Y.;Kim，H. A.;Kim，J.-S.;Kim，S.-Y.;Jeong，H.;Kang，S. G.;Kim，B. K.;Kwon，S.-K.;Lee，C. H.;Yu，D.S.，Genome Sequence of the Plant Growth-promoting Rhizobacterium Bacillus sp.Strain JS.Journal of Bacteriology 2012，194，3 760-3 761.

［8］Altomare，C.;Norvell，W.;Bj?rkman，T.;Harman，G.，Solubilization of Phosphates and Micronutrients by the Plantgrowth-promoting and Biocontrol Fungus Trichoderma Harzianum Rifai 1295-22.Applied and Environmental Microbiology 1999，65，2 926-2 933.

［9］ Fomina，M.;Alexander，I.;Hillier，S.;Gadd，G.，Zinc Phosphate and Pyromorphite Solubilization by soil plantsymbiotic Fungi. Geomicrobiology Journal 2004，21，351-366.

［10］Dekkers，L.C.;van der Bij，A.J.;Mulders，I.H.;Phoelich，C. C.;Wentwoord，R. A.;Glandorf，D. C.;Wijffelman，C.A.;Lugtenberg，B.J.，Role of the O-antigen of Lipopolysaccharide，and Possible Roles of Growth Rate and of NADH:Ubiquinone Oxidoreductase (nuo)in Competitive Tomato Root-tip Colonization by Pseudomonas Fluorescens WCS365. Molecular Plant-microbe Interactions 1998，11，763-771.

［11］Liu，J.;He，D.;Li，X.-z.;Gao，S.;Wu，H.;Liu，W.;Gao，X.;Zhou，T.，γ-Polyglutamic Acid (γ-PGA)Produced byBacillus Amyloliquefaciens C06 Promoting Its Colonization on Fruit Surface.International Journal of Food Microbiology 2010，142，190-197.

［12］ Nelson，L. M.，Plant Growth Promoting Rhizobacteria(PGPR):Prospects for New Inoculants. Online. Crop Management doi 2004，10，1 094.

［13］Kumar，A.;Prakash，A.;Johri，B.，Bacillus as PGPR in Crop Ecosystem.In Bacteria in Agrobiology:Crop Ecosystems，Springer:2011;pp 37-59.

［14］Aliye，N.;Fininsa，C.;Hiskias，Y.，Evaluation of Rhizosphere Bacterial Antagonists for Their Potential to bioprotect potato Solanumtuberosum against bacterial wilt Ralstonia solanacearum.Biological Control 2008，47，282-288.

［15］El-Hendawy，H.H.;Osman，M.E.;Sorour，N.M.，Biological Control of Bacterial Spot of Tomato Caused byXanthomonascampestris pv. VesicatoriabyRahnellaaquatilis.Microbiological Research 2005，160，343-352.

［16］Massomo，S.;Mortensen，C. N.;Mabagala，R.;Newman，M. A.;Hockenhull，J.，Biological Control of Black Rot(Xanthomonas Campestris pv.Campestris)of Cabbage in Tanzania with Bacillus Strains. Journal of Phytopathology 2004，152，98-105.

［17］Pühler，A.;Arlat，M.;Becker，A.;G?ttfert，M.;Morrissey，J. P.;O’Gara，F(xiàn).，What Can Bacterial Genome Research Teach Us about Bacteria–plant Interactions?Current Opinion in Plant Biology 2004，7，137-147.

［18］Siddiqui，Z. A.，PGPR:Prospective Biocontrol Agents of Plant Pathogens.In PGPR:Biocontrol and Biofertilization，Springer:2006;pp 111-142.

［19］Cox，C. D.;Rinehart，K. L.;Moore，M. L.;Cook，J. C.，Pyochelin:Novel Structure of an Iron-chelating Growth Promoter for Pseudomonas Aeruginosa. Proceedings of the National Academy of Sciences 1981，78，4 256-4 260.

［20］Mavrodi，D.V.;Bonsall，R.F.;Delaney，S.M.;Soule，M.J.;Phillips，G.;Thomashow，L.S.，F(xiàn)unctional Analysis of Genes for Biosynthesis of Pyocyanin and Phenazine-1-carboxamide from Pseudomonas aeruginosa PAO1. Journal of Bacteriology 2001，183，6 454-6 465.

［21］Fernando，W. D.;Nakkeeran，S.;Zhang，Y.，Biosynthesis of Antibiotics by PGPR and Its Relation in Biocontrol of Plant Diseases.In PGPR:Biocontrol and Biofertilization，Springer:2006:67-109.

［22］Vessey，J. K.，Plant Growth Promoting Rhizobacteria as Biofertilizers.Plant and Soil 2003，255，571-586.

［23］Barazani，O.;Friedman，J.，Is IAA the Major Root Growth Factor Secreted from Plant-growth-mediating Bacteria?Journal of Chemical Ecology 1999，25，2 397-2 406.

［24］García de Salamone，I. E.;Hynes，R. K.;Nelson，L. M.，Cytokinin Production by Plant Growth Promoting Rhizobacteria and Selected Mutants. Canadian Journal of Microbiology 2001，47，404-411.

［25］Bottini，R.;Cassán，F(xiàn).;Piccoli，P.，Gibberellin Production by Bacteria and Its Involvement in Plant Growth Promotion and Yield Increase.Applied Microbiology and Biotechnology 2004，65，497-503.