微波輔助提取何首烏中的總黃酮及其抗氧化性研究

王濤 郝云輝 馬晶軍

何首烏屬于蓼科蓼屬植物何首烏的塊根，又名地精、首烏或何相公等，是一種常用中草藥，我國(guó)植物資源豐富，分布于東北、中南、華東、西南各?。?，2］。何首烏主要活性成分有二苯乙烯苷類、羥基蒽醌類、多糖類和黃酮類等［2，3］。作為傳統(tǒng)中藥，有補(bǔ)益精血、通便、消腫痛和解瘡毒等作用［3］;有研究表明，何首烏提取物不但能清除自由基、降血脂，還具有抗病毒、抗菌和增強(qiáng)機(jī)體免疫的功能［2－4］;另外，有醫(yī)學(xué)研究證明，黃酮類化合物表現(xiàn)出了很高的抗氧化活性［5，6］，進(jìn)一步提高了何首烏的利用價(jià)值。目前微波提取技術(shù)應(yīng)用于提取黃酮類化合物的報(bào)道有很多［7－10］。本試驗(yàn)中，利用微波輔助技術(shù)提取何首烏中的總黃酮，優(yōu)化了提取條件，并應(yīng)用Feton法［11－13］測(cè)定了總黃酮的清除羥自由基的能能力，考察了黃酮的抗氧化性，旨在為何首烏中有效活性物質(zhì)的提取提供理論基礎(chǔ)，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用何首烏資源提供可靠的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和藥品

1.1.1 供試材料:東北產(chǎn)何首烏，2012年9～10月購(gòu)買于河北省安國(guó)市中藥批發(fā)市場(chǎng)。帶回試驗(yàn)室后，置烘箱中60℃下烘干，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)40目篩，儲(chǔ)于棕色瓶，干燥避光保存，備用。

1.1.2 藥品:蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(生化試劑，中國(guó)藥品生物制品檢定所)、無(wú)水乙醇、95%乙醇、30%H2O2、FeSO4·7H2O、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、水楊酸、濃 H2SO4等，所用試劑均為分析純及以上級(jí)別。試驗(yàn)所用水為二次去離子水。

1.1.3 儀器:756P紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)，ZIP-271型惠而浦家用微波爐(2.45 GHz)，HH·SY11-Ni2型電熱恒溫水浴鍋(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)，AG285分析天平(Mettler Toledo)，pHS-3C酸度計(jì)(上海虹益儀器儀表有限公司)，PH070A干燥箱(上海一恒科技儀器有限公司)，SHB-3型循環(huán)水多用真空泵(鄭州杜甫儀器廠)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制:準(zhǔn)確吸取0.05 mg/ml蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5 ml，分別置于 6 個(gè) 10 ml容量瓶中，各加入0.3 ml 5%NaNO2溶液，6 min后，加0.3 ml 10%Al(NO3)3溶液，6 min后，加入 4 ml 1 mol/L的NaOH溶液，30%乙醇定容，靜置15 min，取4號(hào)瓶掃描在200～800 nm范圍進(jìn)行光譜掃描，得到標(biāo)樣的光譜圖。從光譜圖可知，在506 nm處有最大吸收峰，得到質(zhì)量濃度x與吸光度y的標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=14.069x+0.022;R2=0.9984。

采用微波輔助提取法，分別考察乙醇濃度、微波功率、微波時(shí)間、料液比和提取次數(shù)等影響因素，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法測(cè)定提取液的吸光度，根據(jù)線性回歸方程計(jì)算總黃酮得率。計(jì)算公式如下:

每克干藥材中黃酮類化合物的含量=(c×V×f)/m，其中c為被測(cè)溶液濃度，V為定容后體積，f為稀釋倍數(shù)，m為干藥材的質(zhì)量。以總黃酮得率為測(cè)定指標(biāo)，確定提取何首烏中黃酮的最佳工藝條件。

1.2.2 體外抗氧化活性的測(cè)定:采用Fenton體系體外抗氧化性測(cè)定。實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組:樣品組、空白組、本底組。樣品組中含有 0.4 ml 0.15 mol/L FeSO4，2.0 ml 2 mmol/L 水楊酸，1.0 ml 6 mmol/L H2O2以及樣液(稀釋10倍)1.0 ml;空白組中用蒸餾水代替樣液;本底組中以蒸餾水代替水楊酸。試驗(yàn)時(shí)，加入H2O2后，37℃水浴1 h，離心(1 500 r/min)6 min后取上清液，以蒸餾水為參比，分別測(cè)510 nm處吸光度A。

按下式計(jì)算-OH清除率:E={［A0－(A－A1)］/A0}×100%;式中E:清除率;A0:空白組吸光度值;A:樣品組的吸光度值;A1:本底組的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 乙醇濃度對(duì)何首烏黃酮提取率的影響 隨著乙醇濃度的提高，總黃酮的提取量呈增加的趨勢(shì)，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，黃酮的提取量達(dá)到最高，再增加乙醇濃度時(shí)，提取量反而減小，因此，確定提取的最佳乙醇濃度為70%。出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象的原因考慮是因?yàn)樵谝掖紳舛容^低時(shí)，黃酮類物質(zhì)沒(méi)有完全溶出，隨著乙醇濃度增加，溶出黃酮類物質(zhì)增多，但是當(dāng)乙醇濃度達(dá)到70%時(shí)，溶出黃酮類物質(zhì)基本達(dá)到平衡，繼續(xù)增加乙醇濃度不能使更多的黃酮溶解。見(jiàn)圖1。

圖1 乙醇濃度對(duì)黃酮物質(zhì)提取效果的影響

2.2 微波功率對(duì)何首烏黃酮提取率的影響 隨著微波功率的增加，黃酮提取量也隨之增加，當(dāng)微波功率為350 W時(shí)，黃酮提取量最多，繼續(xù)增加功率時(shí)，黃酮提取量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的提取時(shí)間為350 W。見(jiàn)圖2。

圖2 微波功率對(duì)總黃酮物質(zhì)提取效果的影響

2.3 微波時(shí)間對(duì)何首烏總黃酮提取率的影響 隨著微波提取時(shí)間的增加，黃酮提取量也隨之增加，當(dāng)提取時(shí)間為10 min時(shí)，黃酮提取量最多，當(dāng)提取時(shí)間再增加時(shí)，黃酮提取量沒(méi)有明顯增加，因此確定最佳的提取時(shí)間為10 min。見(jiàn)圖3。

圖3 微波時(shí)間對(duì)總黃酮物質(zhì)提取效果的影響

2.4 不同料液比對(duì)何首烏總黃酮提取率的影響 在乙醇濃度為70%，微波功率350 W，提取時(shí)間10 min的條件下，測(cè)定不同料液比對(duì)何首烏中黃酮類物質(zhì)的提取率的影響，因此確定最佳料液比為1∶25。見(jiàn)圖4。

圖4 物料比對(duì)黃酮物質(zhì)提取效果的影響

2.5 提取次數(shù)對(duì)何首烏總黃酮提取率的影響 隨著提取次數(shù)的增加，黃酮提取含量增加，當(dāng)提取次數(shù)為3時(shí)，黃酮提取量最多，當(dāng)增加提取次數(shù)時(shí)，提取的黃酮含量無(wú)明顯增加。因此確定最佳的提取次數(shù)為3次。見(jiàn)圖5。

圖5 提取次數(shù)對(duì)總黃酮物質(zhì)提取效果的影響

2.6 抗氧化性實(shí)驗(yàn)結(jié)果 何首烏中的黃酮具有一定的清除羥自由基活性能力，且效果隨著濃度增加而增強(qiáng)。見(jiàn)圖6。

圖6 提取物對(duì)羥自由基的清除結(jié)果

3 討論

黃酮類化合物廣泛存在于綠色植物體中，其生物活性一直受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注。該類化合物不但具有良好的抗氧化性能和清除自由基的能力還在抗腫瘤、保護(hù)心血管和抗突變等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的能力［14］。研究表明，天然黃酮類化合物是一類安全可靠、成本低、來(lái)源廣、具有強(qiáng)抗氧化活性的抗氧化劑［15，16］。目前，黃酮類化合物廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)，正在逐步取代人工合成的抗氧化劑，有很好的應(yīng)用前景。目前，從天然物質(zhì)中提取黃酮類物質(zhì)的方法以溶劑熱浸提為主［10，11］，國(guó)內(nèi)外利用微波法提取何首烏中黃酮的報(bào)道較少。微波輔助萃取法是在普通萃取法基礎(chǔ)上輔以微波技術(shù)，利用微波熱效率高、穿透力強(qiáng)和選擇性高的特點(diǎn)，加快萃取過(guò)程中的傳質(zhì)作用，從而提高萃取效率［12］。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，何首烏中含有一定量的黃酮，具有較強(qiáng)的抗氧化活性，是良好的天然抗氧化劑。明確了在微波條件下何首烏中黃酮的提取最佳工藝為提取3次，乙醇濃度70%，料液比為1∶25、微波功率350 W和提取時(shí)間10 min。

1 江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典.第1版.上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1977.1135.

2 張志國(guó)，呂泰省，姚慶強(qiáng).何首烏的研究進(jìn)展.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào)，2008，24:62-64.

3 張綿松，劉新，孟秀梅，等.生何首烏體外抗氧化活性及抗菌活性的研究.食品科技，2012，37:228-231.

4 葉春，范家佑.何首烏營(yíng)養(yǎng)成分分析研究.食品開(kāi)發(fā)與研究，2006，127:127-129.

5 李云峰，郭長(zhǎng)江，楊繼軍，等.石榴皮抗氧化物質(zhì)提取及其體外抗氧化作用研究.營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2004，26:144-147.

6 高翔.石榴的營(yíng)養(yǎng)保健功能及其食品加工技術(shù).中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2005，7:40-42.

7 李娜，魯曉翔.微波提取紅花黃酮類化合物的研究.中國(guó)釀造，2010，7:105-109.

8 張蕾蕾，常雅寧，夏鵬竣，等.微波法提取紫蘇黃酮類物質(zhì)及其成分分析.食品科學(xué)，2012，33:53-57.

9 張代佳，劉傳斌，修志龍，等.微波技術(shù)在植物細(xì)胞內(nèi)有效成分提取中的應(yīng)用.中草藥，2000，31:5-6.

10 陳叢瑾，黃克瀛，李德良，等.微波法提取香椿葉總黃酮的工藝條件.福建林學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，26:375-379.

11 夏扎旦，薩提瓦力地·赫力力，買合布白·阿不都熱依木，等.分光光度法測(cè)定維吾爾傳統(tǒng)藥用植物何首烏的總黃酮含量.食品科學(xué)，2006，27:704-705.

12 索金玲，彭秧，張縱圓，等.石榴葉總黃酮提取工藝及體外抗氧化性研究.生物技術(shù)，2009，19:63-65.

13 黃九林，魏春雁，李慶華.連翹提取液中連翹苷和總黃酮的含量測(cè)定與抗氧化活性的研究.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40:5209-5210.

14 Neuhofer H，Witte L，Gorunovic M，et al.Alkaloids in the bark of punica granatum L(Pomegranate)from Yugo Slavia.Pharmazie，1993，48:389-391.

15 Li YF，Guo CJ，Yang JJ，et al.Evaluation of antioxidant properties of pomegranate peel extract in comparison with pomegranate pulp extract.Food chemistry，2006，96:254-260.

16 Seeram N，Lee R，Hardy M，et al.Rapid large scale purification of ellagitannins from pomegrannte husk，a byproduct of the commercial juice industry.Separation and purification Technology，2005，41:49-55.