IL-24與蛋白激酶和eIF-2α在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

胡長(zhǎng)偉 尹港峰 王希瑞 白慶齡 呂艷明 趙文清 李文玲

IL-24是一種新發(fā)現(xiàn)的具有抗腫瘤作用的細(xì)胞因子，系IL-10家族成員。IL-24是一種具有細(xì)胞因子特性和抑瘤因子功能雙重功效的蛋白質(zhì)。正常生理濃度的IL-24可能是調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，而在超生理濃度下會(huì)顯示非常好的抗腫瘤特性。目前認(rèn)為IL-24發(fā)揮抑癌作用主要是通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤凋亡。但對(duì)于IL-24具體抑制腫瘤細(xì)胞凋亡的機(jī)制尚不明確。本文通過(guò)熒光定量PCR及免疫組化技術(shù)初步探討IL-24可能通過(guò)蛋白激酶(PKR)、真核細(xì)胞翻譯起始因子(eIF-2α)影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2009年1月至2009年12月滄州市中心醫(yī)院神經(jīng)外科手術(shù)切除膠質(zhì)瘤標(biāo)本腫瘤組30例，所有膠質(zhì)瘤標(biāo)本均進(jìn)行HE染色，常規(guī)病理檢查并按WHO 2007年腦腫瘤分類標(biāo)準(zhǔn)分類:Ⅰ～Ⅱ級(jí)9例;Ⅲ級(jí)11例均為間變性星形細(xì)胞瘤;Ⅳ級(jí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤10例。其中，男18例，女12例;平均年齡(43±19)歲。正常腦組織對(duì)照組標(biāo)本均來(lái)自外傷患者內(nèi)減壓手術(shù)，共7例。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 熒光定量 PCR:將膠質(zhì)瘤組織及細(xì)胞中的RNA提取后，經(jīng)分光光度儀檢測(cè)與定量(要求OD260/OD280比值為1.8～2.0)。反轉(zhuǎn)錄后加入GAPDH、IL-24或PKR、eIF-2α的引物后置于7300 HT熒光定量PCR儀上進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR完成后，在ABI 7300 System SDS Software SDS1.3.2.10 軟件上分析，并計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。引物由上海生物工程公司合成。

1.2.2 免疫組化:將膠質(zhì)瘤及正常腦組織標(biāo)本石蠟包埋切片用作檢測(cè)其中IL-24及PKR、eIF-2α的表達(dá)。標(biāo)本切片常規(guī)脫蠟脫水后，一抗(IL-24和PKR、eIF-2α抗體購(gòu)自美國(guó)Promega公司)以1∶100濃度4℃孵育24 h，PBS替代一抗作為陰性對(duì)照。然后二抗以1∶100濃度(購(gòu)自美國(guó)Sigma公司)37℃孵育30 min。應(yīng)用ABC法和DAB顯色，蘇木素復(fù)染，封片后顯微鏡下檢測(cè)。從染色反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及陽(yáng)性強(qiáng)度兩方面進(jìn)行綜合判斷評(píng)分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，＜20%為1分，20% ～39%為2分，40% ～69%為3分，＞70%為4分。染色強(qiáng)度以多數(shù)細(xì)胞為準(zhǔn)，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn):染色陰性0分，淡棕黃色1分，深棕黃色2分，深棕褐色3分。將陽(yáng)性細(xì)胞百分率與染色強(qiáng)度二者得分相加得到總積分，取每個(gè)標(biāo)本3張切片總積分的均值，作為該標(biāo)本研究指標(biāo)的平均表達(dá)值，用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以表示，采用單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-24在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 用熒光定量PCR和免疫組化的方法檢測(cè)各標(biāo)本中IL-24 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤中IL-24表達(dá)較正常腦組織明顯降低，且隨膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加，其表達(dá)逐漸降低。見(jiàn)圖1。

圖1 免疫組化檢測(cè)IL-24、PKR、eIF-2α在各級(jí)別膠質(zhì)瘤中的表達(dá)

2.2 PKR、eIF-2α在膠質(zhì)瘤組織中的表達(dá) 應(yīng)用熒光定量PCR和免疫組化的方法檢測(cè)各標(biāo)本中PKR、eIF-2α的 mRNA及蛋白的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)PKR、eIF-2α在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)較正常腦組織明顯降低，也隨膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加，其表達(dá)逐漸降低。見(jiàn)圖2。

圖2 熒光定量PCR檢測(cè)各級(jí)別膠質(zhì)瘤中IL-24、PKR、eIF-2α的mRNA的表達(dá)

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見(jiàn)的原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤。膠質(zhì)瘤呈浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，無(wú)明顯界限，目前多采用以手術(shù)為主，結(jié)合放療、化療的綜合治療。而臨床治療中手術(shù)很難完全切除，化療和放療既不能高度特異性地殺傷膠質(zhì)瘤細(xì)胞，治療效果差，又可能產(chǎn)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)，乃致全身不能耐受的毒、副作用。目前研究發(fā)現(xiàn)IL-24可以選擇性殺傷許多腫瘤細(xì)胞(包括肺癌、乳腺癌、黑色素瘤等)，而不損傷正常細(xì)胞［1－3］。IL-24 是目前研究較廣泛的一種腫瘤抑制因子，其在多種腫瘤中的抗癌特性已被驗(yàn)證。膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展與多種細(xì)胞因子的異常表達(dá)有關(guān)，目前認(rèn)為膠質(zhì)細(xì)胞中抑癌基因的突變會(huì)造成抑癌因子表達(dá)的下調(diào)或缺失，從而引發(fā)一系列的細(xì)胞信號(hào)通路的改變，并最終引發(fā)細(xì)胞的癌變，成為膠質(zhì)瘤細(xì)胞。最近，Yacoub 等［4，5］研究發(fā)現(xiàn)IL-24可發(fā)揮一定的膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制作用，并提高膠質(zhì)瘤細(xì)胞的放療易感性。但目前關(guān)于IL-24與人腦膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系及IL-24對(duì)膠質(zhì)瘤作用的具體機(jī)制尚不明確。本研究發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中IL-24的表達(dá)降低，且膠質(zhì)瘤惡性程度越高，IL-24表達(dá)越低，與膠質(zhì)瘤惡性程度相關(guān)，說(shuō)明IL-24的表達(dá)對(duì)膠質(zhì)瘤可能有一定的抑制作用。

我們還發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中PKR的表達(dá)比正常腦組織明顯降低。PKR是一種調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的蛋白分子，目前發(fā)現(xiàn)PKR的活化可介導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡增加，從而發(fā)揮抗腫瘤特性［6］。PKR即雙鏈RNA依賴性蛋白激酶，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，是干擾素所介導(dǎo)的抗病毒以及促使細(xì)胞凋亡功能的主要調(diào)解因子之一，它參與多種刺激因子所介導(dǎo)的凋亡［7］。PKR基因定位于人染色體2p21-2，PKR基因是由一個(gè)含有許多潛在調(diào)控元件的啟動(dòng)子所轉(zhuǎn)錄，通過(guò)兩個(gè)雙鏈RNA綁定區(qū)域被激活［8］。激活的PKR可以調(diào)控多個(gè)下游靶位，其中包括 eIF-2α，NF-κB，可以抑制蛋白的合成，最后抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)細(xì)胞凋亡［9－12］。我們發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織中PKR、eIF-2α的表達(dá)比正常腦組織明顯降低，與IL-24相同的隨膠質(zhì)瘤級(jí)別的增加而降低。說(shuō)明IL-24的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的惡性程度有關(guān)，并且IL-24可以通過(guò)調(diào)控PKR、eIF-2α的表達(dá)，進(jìn)而影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。

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